苦參堿與氧化苦參堿的常壓與減壓提取工藝對(duì)比研究

韓 飛，張冰玉，李 賢，李金金

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西楊凌 712100)

苦參類生物堿廣泛存在于苦參、苦豆子及廣豆根等豆科植物中[1-2]。這類生物堿表現(xiàn)出廣泛而優(yōu)良的生物活性如抗病毒[3]、抗腫瘤[4]、抗炎[5]、鎮(zhèn)痛等[6]。此外，還對(duì)心、肝、肺、腎、腦、血管等具有一定的保護(hù)作用。因此上述富含苦參堿的植物多為我國長期使用的中藥資源。

近年來，隨著對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量限制的加壓以及對(duì)抗生素使用的管控加強(qiáng)，人們對(duì)于新型、高效環(huán)保的農(nóng)藥的需求日益增加[7]。中藥以其廣泛的生物活性和相對(duì)較低的毒性，逐漸引起人們的重視。近些年出現(xiàn)了很多關(guān)于中藥活性成分作為農(nóng)藥的研究[8-9]。苦參堿對(duì)植物和動(dòng)物害蟲均表現(xiàn)出顯著的毒殺作用[10-11]，還能抑制多種影響作物生長的真菌或細(xì)菌[12-13]。此外，苦參類生物堿也顯現(xiàn)出植物的生長調(diào)節(jié)活性[14-15]。因此，含有苦參的中藥具有直接開發(fā)為農(nóng)藥或獸藥的價(jià)值。

在苦參類生物堿中，具有顯著藥理活性的分子是苦參堿和氧化苦參堿。這兩種物質(zhì)的作用與功效大致相同。但是，相比氧化苦參堿，苦參堿具有毒性，使得苦參直接作為藥物使用會(huì)存在一定的安全隱患，從而限制苦參類藥物的推廣應(yīng)用?？鄥A和氧化苦參堿存在著可以相互轉(zhuǎn)化的化學(xué)反應(yīng)[16]，因此通過適當(dāng)控制條件，使高毒性的苦參堿轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘愿偷难趸鄥A。

綜上所述，本研究以中藥苦參飲片作為原材料，在常壓和減壓兩種方式下，通過改變提取條件來對(duì)比兩種不同方法的提取效果，以期發(fā)現(xiàn)合適的提取工藝，使得苦參堿與氧化苦參堿的提取率高，而且使其保持一定的比例，降低毒性，從而提高苦參類藥物的臨床使用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 提取材料 苦參飲片(來自豆科植物苦參的干燥根[17]，批號(hào)：20210101)，寶雞向源中藥飲片有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品(編號(hào)MUST-13021904)，氧化苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品(編號(hào)MUST-13021902)，成都曼斯特生物有限公司產(chǎn)品；無水乙醇、乙腈均為色譜純，氯仿、磷酸均為分析純，購自楊凌天成化玻儀器有限公司；實(shí)驗(yàn)用純水由實(shí)驗(yàn)室自制[18]。

1.1.3 主要儀器 高效液相色譜儀(LC-10AT)，日本島津公司產(chǎn)品；pH計(jì)(pHS-3C)，上海日島科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；1/10萬電子分析天平(AE24)，瑞士梅特勒-托利多公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照品溶液的配制 準(zhǔn)確稱量0.528 mg的苦參堿和1.523 mg的氧化苦參堿，分別轉(zhuǎn)移入10 mL棕色容量瓶中，并加入乙腈-無水乙醇進(jìn)行溶解稀釋、定容、搖勻，配制成苦參堿和氧化苦參堿對(duì)照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的配制 精確量取10 mL提取液并轉(zhuǎn)移入錐形瓶中，加入適量氨水調(diào)節(jié)其pH 9～10。用6×20 mL的氯仿對(duì)上述溶液進(jìn)行萃取。合并氯仿相，減壓蒸除溶劑，殘余物加入適量無水乙醇進(jìn)行溶解，并轉(zhuǎn)移入 25 mL容量瓶中定容、搖勻，得到供試品溶液。

1.2.3 色譜條件 采用高效液相色譜法測定提取液中苦參堿和氧化苦參堿的含量。色譜柱：Kromasil NH2柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-無水乙醇-3%磷酸80∶10∶10；檢測波長：220 nm；流動(dòng)速度：1 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2 結(jié)果

2.1 色譜方法性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 苦參堿與氧化苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品譜圖 圖1和圖2是苦參堿與氧化苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。從圖中可以看出，苦參堿和氧化苦參堿的的保留時(shí)間分別為5.875 min和8.848 min。因此，在一定的色譜條件下，確定了苦參堿和氧化苦參堿的在液相色譜儀上的出峰位置，從而能夠進(jìn)一步對(duì)提取的苦參堿和氧化苦參堿進(jìn)行定性或定量分析。

5.875：苦參堿的保留時(shí)間5.875：Retention time of matrine

8.848：氧化苦參堿的保留時(shí)間8.848：Retention time of and Oxymatrine

2.1.2 線性關(guān)系 準(zhǔn)確量取對(duì)照品溶液，并分別倒入容量為2 L、4 L、6 L、8 L、16 L、20 L的量杯中，隨后按照色譜條件進(jìn)行測定。以橫坐標(biāo)為進(jìn)樣量，縱坐標(biāo)為峰面積，建立了兩個(gè)對(duì)照品的回歸方程，分別為y=6.976 105x-3 028.1(R2=0.999 8),y=7.353 105x-7 315.3(R2=0.999 8)，線性范圍分別為0.105 6 μg～1.056 μg與0.304 6 μg～3.046 μg之間。

2.1.3 精密度試驗(yàn) 選用對(duì)照品溶液，繼續(xù)在色譜條件下進(jìn)行6次連續(xù)測定，得出兩種對(duì)照品溶液的計(jì)算峰值面積分別為1.1%和2.6%，說明測量儀器精密度非常優(yōu)良。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 選擇同樣等量的供試品分別記錄不同時(shí)間段的測量結(jié)果，記錄的時(shí)間為0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h，然后計(jì)算在這些時(shí)間下苦參堿和氧化苦參堿的峰面積分別為2.1%和2.4%，得出最佳的時(shí)間為12 h。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 量取6份同一提取條件的提取液，參照2.1.2的方法制備供試品提取液，按2.1.3的條件進(jìn)行測定。最終測得供試品溶液中的苦參堿與氧化苦參堿的峰值面積分別為2.5%和2.7%，表明這種試驗(yàn)方式的重復(fù)性良好。

2.1.6 加樣回收試驗(yàn) 量取6份5.0 mL的已知含量的提取液，并依次加入11.76 mL的苦參堿和9.06 mL的氧化苦參堿，繼續(xù)按2.1.2的制備方式制備供試品溶液，并在色譜條件下計(jì)算出苦參堿平均回收率為97.63%、面積為2.2%，氧化苦參堿的平均回收率為98.12%、面積為2.4%，說明這種方法具有科學(xué)性。

2.2 常壓提取工藝的分析與優(yōu)化

稱取34份10 g苦參飲片，在常壓和減壓條件下，設(shè)置不同的時(shí)間、溫度、次數(shù)、溶劑用量對(duì)其進(jìn)行提取，并結(jié)合液相色譜對(duì)不同提取液中苦參堿與氧化苦參堿的含量進(jìn)行分析，以考察上述因素對(duì)提取效果的影響。提取效果的指標(biāo)通過提取液中苦參總堿含量(苦參堿與氧化苦參堿的總量)，各自的含量以及綜合評(píng)分來體現(xiàn)，權(quán)重系數(shù)為0.5。根據(jù)前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，最佳提取溶劑為水。

2.2.1 單因素考察

(1)提取時(shí)間：將提取溫度設(shè)置成恒溫60℃，水料比10∶1，共提取兩次，然后將提取時(shí)間分別設(shè)置成0.5 h、1 h、1.5 h、2 h。試驗(yàn)結(jié)果如下：苦參總堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.81% (0.5 h)、0.99% (1 h)、1.09% (1.5 h)、1.06% (2 h)；苦參堿與氧化苦參堿各自的含量分別為0.72%和0.09%(0.5 h)、0.9%和0.09% (1 h)、0.97%和0.12%(1.5 h)、0.93%和0.13%(2 h)。綜合上述兩組數(shù)據(jù)，得出各個(gè)溫度下的綜合評(píng)分為0.76 (0.5 h)、0.95 (1 h)、0.92 (1.5 h)、0.84 (2 h)。因此最終確定最佳提取時(shí)間為1 h。

(2)提取溫度：將提取時(shí)間固定為1 h，水料比與提取次數(shù)不變。然后將提取溫度分別設(shè)置成50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃進(jìn)行提取試驗(yàn)與含量的測定。得出的結(jié)果分別為：50℃時(shí)苦參總堿含量0.89%，各自含量為0.79%和0.1%，綜合評(píng)分0.89；60℃時(shí)苦參堿與氧化苦參堿總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.99%，各自含量為0.88%和0.11%，綜合評(píng)分為0.94；70℃時(shí)總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.04%、苦參堿和氧化苦參堿含量分別為0.93%和0.11%，綜合評(píng)分為1.00；80℃的苦參總堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.91%，各自含量為0.78%和0.13%，綜合評(píng)分為0.79；90℃苦參總堿總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.87%，各自含量為0.73%和0.14%，綜合評(píng)分0.73；100℃總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.74%，苦參堿與氧化苦參堿的含量為0.52%和0.22%，綜合評(píng)分為0.5。綜合比較，發(fā)現(xiàn)70℃比60℃的評(píng)分略高，但是綜合實(shí)際工藝成本考慮，選擇60℃作為最佳提取溫度。

(3)提取次數(shù)：將提取溫度、提取時(shí)間、料液比分別固定為60℃、1 h、10∶1，以考察提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響。結(jié)果顯示，提取1次的總堿含量、苦參堿與氧化苦參堿的含量分別為0.74%、0.68%和0.06%，綜合評(píng)分為0.85；提取2次的總堿含量、苦參堿和氧化苦參堿各自含量分別為1.01%、0.92%和0.09%，綜合評(píng)分為0.93；提取3次的含量分別為1.05%、0.95%和0.1%，綜合評(píng)分為0.87。以上結(jié)果表明，提取2次和3次效果差別不大。綜合實(shí)際工藝成本考慮，發(fā)現(xiàn)提取2次為最佳條件。

(4)水料比：本試驗(yàn)所用提取溶劑為水，因此通過水與提取的苦參飲片原材料用量的比值體現(xiàn)溶劑的使用量。結(jié)果表明，當(dāng)提取溫度均為60℃、提取時(shí)間均為1 h、提取次數(shù)都是2次時(shí)，水料比為 8∶1的提取處理中，苦參堿與氧化苦參堿的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.97%，各自的含量分別為0.08%和0.89%，綜合評(píng)分為0.97；水料比為10∶1處理的苦參總堿含量為1.03%、苦參堿和氧化苦參堿的含量分別為0.95%和0.08%，綜合評(píng)分為0.99；12∶1 的苦參總堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.04%，各自的含量為0.93%和0.1%，綜合評(píng)分為0.87；14∶1的苦參堿與氧化苦參堿的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.03%、各自含量為0.92%和0.11%，綜合評(píng)分為0.87。綜合各評(píng)分，以及實(shí)際工藝的可行性和合理性，發(fā)現(xiàn)水料比8∶1時(shí)就能達(dá)到最佳的提取效果。

2.2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化 經(jīng)過單因素試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)最佳提取溫度為60℃。將提取時(shí)間、次數(shù)、水料比作為考察因素，對(duì)提取工藝進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化。提取效果的指標(biāo)為苦參堿與氧化苦參堿的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)、比值以及綜合評(píng)分。

稱取18份10 g苦參飲片進(jìn)行試驗(yàn)，得出結(jié)果如表1，方差分析見表2。從試驗(yàn)表格中可以發(fā)現(xiàn)最能影響常壓工藝提取效果的是提取次數(shù)，其次為提取時(shí)間，最后為溶劑用量。最佳組合方案為A1B1C3,但C對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，其他因素不明顯，因此，綜合實(shí)際生產(chǎn)情況A2B1C3更符合現(xiàn)實(shí)，為常壓提取工藝的最佳方案,即加8倍水提取3次，每次1 h，分別將3份約為10 g的苦參飲片進(jìn)行驗(yàn)證，得出的苦參總堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.19%、1.17%、1.20%，苦參堿和氧化苦參堿的含量分別為0.84%和0.35%、0.81%和0.36%、0.84%和0.36%。

表1 苦參常壓提取工藝正交試驗(yàn)安排及結(jié)果

表2 常壓提取工藝綜合評(píng)分方差分析

2.2 減壓提取工藝的分析與優(yōu)化

取18份10 g的苦參飲片，按照上述同樣的步驟進(jìn)行單因素和正交提取試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 苦參減壓提取工藝正交試驗(yàn)安排及結(jié)果

從表中結(jié)果可以看出，影響因素排序與常壓工藝一樣，最佳組合也是A1B1C3，實(shí)際生產(chǎn)工藝最佳組合也是A2B1C3，即加8倍水于70℃減壓提取3次，每次1 h。分別將3份約為10 g的苦參飲片按照以上工藝進(jìn)行驗(yàn)證，得出的苦參堿與氧化苦參堿總質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.16%、1.20%、1.17%，苦參堿和氧化苦參堿的含量依次為0.09%和1.07%、0.08%和1.12%、0.09%和1.08%。

表4 減壓提取工藝綜合評(píng)分方差分析

3 討論

經(jīng)過對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，常壓法和減壓法所得苦參堿的含量相近。這說明，常壓法和減壓法的提取能力是相同的。但是相比常壓法，減壓提取能夠顯著降低苦參堿的含量。張喻娟等[19]對(duì)苦豆子進(jìn)行了常壓與動(dòng)態(tài)減壓提取，也發(fā)現(xiàn)在減壓條件下氧化苦參堿的含量明顯高于苦參堿，并且認(rèn)為減壓-溫度是提高氧化苦參堿含量的關(guān)鍵條件，即在減壓存在下，高溫限制了氧化苦參堿向苦參堿的轉(zhuǎn)化。但是根據(jù)本研究的結(jié)果分析，也存在另一種可能，即減壓和高溫也會(huì)協(xié)同促進(jìn)苦參堿向氧化苦參堿的轉(zhuǎn)化。這也正是減壓法苦參堿與氧化苦參堿的比值顯著低于常壓法的原因，以及確定減壓提取工藝溫度為70℃的必要性?？傊瑴p壓條件是提取工藝中控制活性成分的有效手段，值得圍繞減壓工藝進(jìn)一步改進(jìn)和優(yōu)化，使其能夠真正為獲得目標(biāo)藥用成分提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支撐。

苦參堿的提取工藝經(jīng)歷了水煎法[20]、乙醇提取法[21]、氯仿提取法[22]、酸水提取法[23]的演變。但是已有的研究表明，以上幾種方法的提取能力和提取效果差別并不大[24]。綜合考慮工藝的成本、可操作性、安全性以及提取效果等因素，最終選取水作為提取溶劑。此外，通過改變其他條件如提取溫度、料液比、提取時(shí)間等，收到了較好的苦參類生物堿的提取效果，其含量達(dá)到甚至超過了已有的提取方法[25-26]。

4 結(jié)論

以水作為溶劑，通過對(duì)比試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)減壓提取工藝能夠顯著提高弱毒性成分氧化苦參堿的含量。最佳提取工藝為：水料比8∶1，提取次數(shù)為3次，每次提取時(shí)間1 h，提取溫度70℃。最佳苦參堿與氧化苦參堿的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)及各自的含量為1.20%、0.08%和1.12%。以上提取工藝安全簡便、結(jié)果穩(wěn)定可靠、成本低，適合工業(yè)化生產(chǎn)，并且能夠有效降低苦參類藥物的毒性成分，增強(qiáng)其推廣應(yīng)用價(jià)值。