抗生素對(duì)油菜種子及幼苗生物效應(yīng)研究

范 碩, 張小娜, 侯艷紅, 霍瑞朋, 王子銘, 殷凱玥, 張雪雪, 趙瑩瑩, 王巨媛

(1.聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院, 山東 聊城 252000;2.聊城大學(xué)地理與環(huán)境學(xué)院, 山東 聊城 252000)

抗生素是微生物次級(jí)代謝產(chǎn)生的具有殺滅病原微生物作用的化學(xué)物質(zhì)，在感染治療與預(yù)防中有顯著效果[1]。自20世紀(jì)弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素以來(lái)，抗生素對(duì)人類生命健康和社會(huì)發(fā)展做出卓越的貢獻(xiàn)。人們過(guò)度依賴抗生素防治病蟲(chóng)害，且缺乏對(duì)抗生素合理使用的認(rèn)識(shí)，導(dǎo)致抗生素使用量大大增加[2]。我國(guó)每年使用抗生素約16.2萬(wàn)t，約占世界用量的一半，其中52%為獸用[3]，進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)的抗生素約有一半以上通過(guò)排泄物方式，以原藥或初級(jí)代謝產(chǎn)物的形式進(jìn)入到環(huán)境中，大量抗生素殘留污染環(huán)境影響作物正常生長(zhǎng)[4-6]。有報(bào)道上海黃浦江上游通過(guò)施用糞肥進(jìn)入到土壤中的磺胺類抗生素濃度達(dá)到5.85～33.37 mg/kg[2]。在自然界，抗生素可通過(guò)多種途徑(如水、土、動(dòng)植物等)進(jìn)行傳遞，直接或間接地對(duì)環(huán)境造成不利影響[7-9]，且殘留在環(huán)境中的抗生素經(jīng)過(guò)循環(huán)累積進(jìn)入食物鏈，對(duì)食品安全埋下重大隱患，包括家禽[10]、魚(yú)類[11]、牛奶[12]、蝦類[13]食品中均已檢測(cè)到殘留。

油菜栽培遍及全國(guó)，種植面積占中國(guó)油料作物的40%，菜籽油占我國(guó)國(guó)產(chǎn)食用植物油總產(chǎn)的60%左右[12]。油菜的花粉功能強(qiáng)大，含多種營(yíng)養(yǎng)元素，具有抑制腫瘤、調(diào)節(jié)血脂等多種作用。同時(shí)油菜也具有很高的觀賞價(jià)值，近年來(lái)油菜觀光旅行已成為多地區(qū)新開(kāi)發(fā)的特色旅游項(xiàng)目。

自然界中人類處于食物鏈頂端，因此，各方面的食品安全問(wèn)題一直都是關(guān)注的焦點(diǎn)。李亞寧等[15]研究磺胺抗生素對(duì)油菜幼苗氧化酶的影響，表明ST及SMZ對(duì)油菜葉綠素含量及SOD、POD活性均被顯著誘導(dǎo)。但抗生素對(duì)油菜花種子的影響未見(jiàn)報(bào)道，本文以油菜花種子為試材，開(kāi)展SM 2、TC、NX 三種抗生素對(duì)油菜花種子及幼苗生長(zhǎng)影響的研究，分析不同抗生素對(duì)油菜花的生態(tài)毒性效應(yīng)，為抗生素環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)及規(guī)范使用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試油菜種子購(gòu)于江蘇省連云港市種子站；SM 2、TC、NX三種抗生素純度為99%，購(gòu)于上海麥克林公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

根系掃描系統(tǒng)(Win RH 220 STO 1600 Systems)——加拿大

生物熒光倒置顯微鏡(BX 51)——日本奧林巴斯株式會(huì)社

1.3 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)共設(shè)6個(gè)處理，3種抗生素濃度均為ck(無(wú)抗生素添加)、12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L。各處理重復(fù)3次。采用培養(yǎng)皿發(fā)芽法，挑選飽滿油菜種子，以3%的過(guò)氧化氫溶液浸泡消毒20 min，用去離子水反復(fù)沖洗數(shù)次，以50粒為一組置于恒溫箱內(nèi)進(jìn)行催芽，催芽溫度(25±1)℃，記錄發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)。

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽種子粒數(shù)/供試種子粒數(shù))×100%

發(fā)芽勢(shì)(%)=(發(fā)芽天數(shù)為3 d時(shí)發(fā)芽的粒數(shù)/供試種子粒數(shù))×100%

發(fā)芽結(jié)束后，每處理選出5個(gè)具有代表性的油菜種子，使用根系掃描系統(tǒng)測(cè)定根總長(zhǎng)、根表面積、根分叉數(shù)、根體積及油菜根系形態(tài)掃描圖。

根長(zhǎng)抑制率(%)=[(對(duì)照根長(zhǎng)-處理根長(zhǎng))/對(duì)照根長(zhǎng)]×100%

油菜根損傷鑒定方法：分別取各處理的油菜根部組織置于20 μmol/L 二乙酸熒光素(FDA)中，37 ℃條件下浸染20 min后，用0.05 mmol/L PBS(pH=7.0)清洗3～5次后在生物熒光倒置顯微鏡下拍照[10]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

方差分析采用SPSS 19軟件進(jìn)行，運(yùn)用ANOVA方法分析處理間差異顯著性，采用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)油菜種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的影響

種子發(fā)芽率反映種子生命力和生活力的強(qiáng)弱[16-17]。植物種子的萌發(fā)是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵階段，油菜種子萌發(fā)情況會(huì)直接影響油菜植株的生長(zhǎng)、產(chǎn)量及觀賞價(jià)值。由表1所示，SM 2表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)油菜種子發(fā)芽，12.5～50 mg/L時(shí)種子發(fā)芽率與對(duì)照相比達(dá)到顯著水平，在50 mg/L時(shí)發(fā)芽率達(dá)到最高，濃度在100 mg/L、200 mg/L時(shí)發(fā)芽率與ck差異不顯著。發(fā)芽勢(shì)在25 mg/L時(shí)最低，在200 mg/L時(shí)最高。TC濃度為12.5 mg/L時(shí)發(fā)芽率達(dá)到最高；25～200 mg/L時(shí)抑制油菜種子發(fā)芽，200 mg/L時(shí)抑制作用最強(qiáng)，發(fā)芽率最低，除12.5 mg/L處理外其他處理與ck相比均達(dá)到顯著水平，發(fā)芽勢(shì)在12.5 mg/L時(shí)最高，200 mg/L時(shí)最低。NX各處理對(duì)油菜種子發(fā)芽均表現(xiàn)抑制作用，除12.5 mg/L處理外，其他處理與ck相比均達(dá)顯著水平，發(fā)芽勢(shì)在200 mg/L時(shí)最低。

2.2 不同處理對(duì)油菜種子根長(zhǎng)、根長(zhǎng)抑制率的影響

由圖1～圖3所示抗生素對(duì)油菜種子根長(zhǎng)的影響均表現(xiàn)為抑制，根長(zhǎng)抑制率與抗生素濃度之間存在劑量效應(yīng)關(guān)系。TC的濃度變化對(duì)油菜種子根伸長(zhǎng)的抑制作用最明顯，濃度為12.5 mg/L的TC處理對(duì)根長(zhǎng)生長(zhǎng)已表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，濃度越高抑制作用越強(qiáng)；SM 2的濃度變化對(duì)種子根伸長(zhǎng)的抑制作用弱于TC處理；油菜種子根長(zhǎng)對(duì)NX的濃度變化最不敏感，在最高濃度(200 mg/L)根長(zhǎng)抑制作用最強(qiáng)。

2.3 不同處理對(duì)油菜根表面積、分叉數(shù)及根體積的影響

抗生素對(duì)油菜根表面積、分叉數(shù)、根體積及幼苗形態(tài)的影響見(jiàn)圖4～圖7。SM 2濃度為25 mg/L時(shí)根表面積、根體積達(dá)到最高值；50 mg/L時(shí)分叉數(shù)最多。隨著SM 2濃度的增大根系生長(zhǎng)受到抑制，根體積減小，側(cè)根減少。TC濃度越大對(duì)根的抑制作用越強(qiáng)，各濃度根表面積、根分叉數(shù)、根體積與ck相比整體均呈下降趨勢(shì)。NX對(duì)根生長(zhǎng)整體表現(xiàn)為抑制作用，根分叉數(shù)在50 mg/L時(shí)最多，在25 mg/L根體積達(dá)最大值，但與ck相比差異不顯著，隨濃度增加根體積變小抑制作用變強(qiáng)。

表1 抗生素對(duì)油菜種子發(fā)芽的影響Table 1 Effect of antibiotics on seed germination of rapeseed

圖1 SM 2對(duì)油菜根長(zhǎng)、根長(zhǎng)抑制率的影響Fig.1 Effect of SM 2 on root length and inhibition rate of rapeseed

圖2 TC對(duì)油菜根長(zhǎng)、根長(zhǎng)抑制率的影響Fig.2 Effect of TC on root length and inhibition rate of rapeseed

圖3 NX對(duì)油菜根長(zhǎng)、根長(zhǎng)抑制率的影響Fig.3 Effect of NX on root length and inhibition rate of rapeseed

圖4 不同抗生素對(duì)根表面的影響Fig.4 Effects of antibiotics on root surface area

抗生素與油菜種子發(fā)芽及根生長(zhǎng)指標(biāo)相關(guān)性見(jiàn)表2，發(fā)芽率、根長(zhǎng)、根表面積、根體積與抗生素濃度之間呈負(fù)相關(guān)，TC不同處理與發(fā)芽勢(shì)相關(guān)性最大(R2=0.784 1)；NX處理與根長(zhǎng)、根表面積、根體積相關(guān)性均較大(R2依次為0.817 5、0.836 4、0.828 5)。僅NX處理的根分叉數(shù)與抗生素濃度之間及SM 2與發(fā)芽勢(shì)間呈正相關(guān)，且R2值較低。

2.4 不同處理對(duì)油菜根損傷的影響

利用熒光雙醋酸酯(FDA)燃料染色植物細(xì)胞，當(dāng)FDA進(jìn)入活細(xì)胞后能生產(chǎn)綠色熒光物質(zhì)，在熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度就能夠判定油菜根系細(xì)胞活力的強(qiáng)弱。當(dāng)植物受到外界脅迫時(shí)，F(xiàn)DA染色可以作為評(píng)價(jià)外源物質(zhì)誘導(dǎo)植物細(xì)胞死亡的重要指標(biāo)之一[18]。

圖7 不同抗生素對(duì)油菜幼苗的影響Fig.7 The effect of antibiotics on Brassica campestris seedings

表2 抗生素與油菜種子發(fā)芽及根生長(zhǎng)的相關(guān)性Table 2 Correlation between antibiotics and seed germination and root length of rapeseed

圖5 不同抗生素對(duì)根分叉數(shù)的影響 Fig.5 Effects of antibiotics on root bifurcation number

圖6 不同抗生素對(duì)根體積的影響Fig.6 Effects of antibiotics on root volume

SM 2對(duì)油菜幼苗根系損傷情況見(jiàn)圖8(A)，與ck相比，12.5 mg/L處理細(xì)胞著色良好亮度高，細(xì)胞活力強(qiáng)，故濃度為12.5 mg/L處理對(duì)油菜根系細(xì)胞活力影響較小，隨著SM 2濃度的增大，油菜根系熒光區(qū)域逐漸減少，亮度也隨之減弱，表明油菜根系細(xì)胞活力逐漸減弱。TC對(duì)油菜幼苗根系損傷的影響見(jiàn)圖8(B)，與ck相比，各處理下的油菜根系細(xì)胞均有一定程度的受損，在本試驗(yàn)中隨著TC濃度增大油菜根系熒光亮度逐漸減弱，油菜根系細(xì)胞活力呈減弱趨勢(shì)。NX對(duì)油菜幼苗根系損傷的影響見(jiàn)圖8(C)，與ck相比，12.5 mg/L、25 mg/L處理下的油菜根系受到的損傷不明顯，隨濃度增大到50 mg/L后即表現(xiàn)出較為明顯的損傷，隨著NX濃度增大，油菜根系熒光亮度相應(yīng)減弱，細(xì)胞活力呈減弱趨勢(shì)。

3 討 論

種子萌發(fā)期和幼苗期是植物對(duì)外界環(huán)境因子的敏感期，直接影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。魏瑞成等[16]研究不同濃度梯度的金霉素對(duì)油菜種子發(fā)芽的影響，結(jié)果表明，不同濃度處理對(duì)其發(fā)芽率及發(fā)芽勢(shì)無(wú)顯著差異，但株高和根長(zhǎng)受到明顯抑制，根長(zhǎng)對(duì)金霉素生態(tài)毒性更為敏感[19]。張樹(shù)清等[20]研究表明，隨處理金霉素濃度的提高，大白菜的主根長(zhǎng)、單株鮮重均呈先增加后降低的趨勢(shì)。鄧世杰等[21]研究金霉素對(duì)黃瓜、西葫、冬瓜種子萌發(fā)，表明金霉素對(duì)黃瓜種子的發(fā)芽表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)，高濃度抑制。均與本研究結(jié)論大方向一致。

圖8 不同SM 2、TC、NX濃度對(duì)油菜根損傷的影響Fig.8 Effects of different SM 2、TC、NX concentrations on root injury in rape

植物根系是吸收環(huán)境中水分和養(yǎng)分的主要器官，地下部根系的形態(tài)和生長(zhǎng)狀況直接影響整株植物的生長(zhǎng)發(fā)育[22-23]。廖德潤(rùn)等[24]的研究結(jié)果反映出，低濃度抗生素對(duì)植株生長(zhǎng)具有誘導(dǎo)刺激效應(yīng)，而高濃度條件下則表現(xiàn)出抑制毒害效應(yīng)，植株中可溶性蛋白含量以及抗氧化酶活性均受到抑制。本研究結(jié)果表明，3種抗生素對(duì)油菜根生長(zhǎng)有不同影響，低濃度的SM 2對(duì)油菜種子發(fā)芽及根系發(fā)育均有促進(jìn)作用，隨抗生素濃度的提高對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用不斷增強(qiáng)，TC、NX對(duì)油菜根系生長(zhǎng)均表現(xiàn)為抑制作用，NX濃度高于25 mg/L時(shí)對(duì)油菜發(fā)芽抑制作用與ck相比達(dá)到顯著水平，NX處理下，油菜根系的根長(zhǎng)、根表面積隨抗生素濃度的增大逐漸降低，側(cè)根數(shù)減少。FDA染色法能夠反映細(xì)胞活力。在高濃度抗生素脅迫下，油菜根系活力明顯減弱，說(shuō)明抗生素一旦超過(guò)濃度限制范圍就會(huì)抑制油菜根系活力，影響根系對(duì)養(yǎng)分的吸收，根系固持能力也會(huì)不斷減弱。表明當(dāng)抗生素濃度達(dá)到一定閾值，抗生素的毒害作用會(huì)不斷表現(xiàn)出來(lái)。本研究中，3種抗生素對(duì)油菜抑制作用由強(qiáng)到弱排列依次為TC、SM 2、NX?？股貙?duì)油菜的光合、熒光等生理指標(biāo)的影響還有待進(jìn)一步探究。

綜上所述，要注意科學(xué)合理的使用抗生素，在園林、園藝、大田作物、畜牧業(yè)等生產(chǎn)加工中應(yīng)嚴(yán)控抗生素的施用量，并采用合理方法有效去除環(huán)境中殘留的抗生素及抗生素代謝物，促進(jìn)生態(tài)環(huán)境健康發(fā)展。