鉤藤再生體系優(yōu)化與遺傳轉(zhuǎn)化條件探究

賈 娜， 王曉紅， 李 林， 于曉松， 劉 智， 張明生

(貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴陽 550025)

鉤藤(Uncariarhynchophylla(Miq.)Miq. ex Havil.)為茜草科(Rubiaceae)鉤藤屬(Uncaria)植物，常以干燥帶鉤莖枝入藥[1]，具有息風(fēng)定驚，清熱平肝之功效。鉤藤在我國分布較廣，主要生長于貴州、廣西等省區(qū)，野生資源較為豐富。鉤藤中的有效成分主要有生物堿類、黃酮類、有機(jī)酸類和甙類化合物，其中以生物堿含量最為豐富且為發(fā)揮藥理作用的主要成分[2]。生物堿有效成分為鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿和異去氫鉤藤堿等，其中鉤藤堿及異鉤藤堿已被證明具有顯著的降壓、抗心律失常、鎮(zhèn)靜和治療老年癡呆癥等功效，同時(shí)對治療風(fēng)熱頭痛、頭暈?zāi)垦５劝Y具有較好的效果且副作用小[3-6]。此外，鉤藤中的三萜酯類和鉤藤酸類對結(jié)腸癌、肺癌、膀胱癌及乳腺癌等腫瘤細(xì)胞的增殖有抑制作用[7]，因此，鉤藤在醫(yī)藥領(lǐng)域具有巨大的開發(fā)潛力。

木本植物育種周期普遍較長且雜合度較高，導(dǎo)致其育種相關(guān)研究較其他植物進(jìn)展緩慢，而隨著植物組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化等技術(shù)的發(fā)展，通過建立穩(wěn)定高效的再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系來進(jìn)行基因功能驗(yàn)證及性狀改良的研究在木本植物中逐漸增多[8-10]，極大優(yōu)化并加快了木本植物的育種研究進(jìn)程。植物遺傳轉(zhuǎn)化有多種技術(shù)，其中由根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化因具有操作簡單、成本較低、周期較短及所得遺傳轉(zhuǎn)化植株可育等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用[11]。遺傳轉(zhuǎn)化體系成功構(gòu)建的前提是具有穩(wěn)定高效的組培再生體系，關(guān)于鉤藤再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究，起初毛堂芬等[12]對基本培養(yǎng)基進(jìn)行過探索，之后施力軍等[13]以鉤藤莖段為外植體探究了鉤藤的分化階段；在此基礎(chǔ)上，吳順等[14]以鉤藤莖段，葉片及葉柄為外植體對愈傷誘導(dǎo)進(jìn)行研究，初步建立了鉤藤的再生體系。對于鉤藤遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究，僅吳順等[15]以鉤藤的葉片、莖段及葉柄為外植體，利用發(fā)根農(nóng)桿菌對其進(jìn)行浸染,探討了不同鉤藤外植體、菌液濃度、AS濃度、干燥處理時(shí)間對毛狀根誘導(dǎo)率的影響。

本實(shí)驗(yàn)以鉤藤種子無菌萌發(fā)的植株葉片為外植體，探究不同因素對鉤藤組培再生體系中各階段的影響，優(yōu)化建立了穩(wěn)定高效的鉤藤組培再生體系，以鉤藤再生體系為基礎(chǔ)，采用葉盤法探究鉤藤無菌離體葉片對卡那霉素的抗壓程度，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、浸染液中AS濃度、菌液濃度、浸染時(shí)間及共培養(yǎng)時(shí)間對鉤藤遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響，經(jīng)過抗性篩選獲得陽性植株，以野生型鉤藤植株作為對照，通過PCR檢測鑒定GUS基因順利轉(zhuǎn)入。本研究成功建立鉤藤遺傳轉(zhuǎn)化體系，為鉤藤功能基因研究與定向改良奠定基礎(chǔ)，對鉤藤資源的開發(fā)利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

鉤藤種子采自貴州省黔東南州鉤藤種植基地(26°27′55″N，106°39′21″E)。實(shí)驗(yàn)采用的農(nóng)桿菌菌株為EHA 105，質(zhì)粒PBI 121，該質(zhì)粒含有GUS報(bào)告基因及卡那霉素抗性基因，菌株及載體保存于貴州大學(xué)生理生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，試驗(yàn)時(shí)間2018年9月—2020年8月。

1.2 方 法

1.2.1種子消毒

將種子在流水下沖洗2 h后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)上，用75%酒精消毒15 s后用無菌水清洗3次，再使用10%次氯酸鈉消毒8 min，無菌水清洗4～5次，接種于提前準(zhǔn)備好的平板中，種子與培養(yǎng)基間用濾紙間隔進(jìn)行萌發(fā)獲得鉤藤的無菌苗。

1.2.2愈傷組織誘導(dǎo)

將鉤藤葉片切割成約0.5 cm2大小，以WPM為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的蔗糖(10、2、30 g/L)、2,4-D(2.0、3.0、4.0 mg/L)、6-BA(1.0、1.5、2.0 mg/L)和NAA(0.5、1.0、1.5 mg/L)進(jìn)行四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，2周后統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率，篩選愈傷誘導(dǎo)適宜條件。以WPM、MS和B 5為基本培養(yǎng)基，添加優(yōu)化后的激素組合探究誘導(dǎo)鉤藤愈傷組織適宜的基本培養(yǎng)基，再將接種好的材料分成兩組，一組置于光照強(qiáng)度為31～35 μmol/(m2·s)、光照時(shí)間14 h/d、培養(yǎng)溫度(25±2)℃的條件下，另一組置于同溫度條件下遮光培養(yǎng)，探究遮光對鉤藤愈傷誘導(dǎo)的影響。每個(gè)處理20瓶，每瓶接種5片，3次重復(fù)。

愈傷誘導(dǎo)率(%)=(出愈葉片數(shù)/接種的葉片數(shù))×100%。

1.2.3不定芽的誘導(dǎo)

將鉤藤愈傷組織接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基以WPM、MS和1/2 MS為基本培養(yǎng)基并添加6-BA(1.0、2.0、3.0 mg/L)和NAA(0.1、0.5、1.0 mg/L)進(jìn)行三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽的誘導(dǎo)率。每個(gè)處理20瓶，每瓶接種4塊愈傷組織，3次重復(fù)。

不定芽誘導(dǎo)率(%)=(出芽個(gè)數(shù)/接種的愈傷塊數(shù))×100%。

1.2.4葉片對卡那霉素的抗壓篩選

取鉤藤無菌苗葉片接種于含有不同濃度的卡那霉素(0，30，50，70，90 mg/L)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，2周后統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率及葉片存活情況，將愈傷組織繼續(xù)接種至不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，統(tǒng)計(jì)不定芽的發(fā)生率，獲得適宜的卡那霉素篩選濃度。

1.2.5預(yù)培養(yǎng)時(shí)間篩選

以優(yōu)化所得的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為預(yù)培養(yǎng)基，葉片裁剪為0.5 cm2大小，接種時(shí)葉片背面接觸培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，時(shí)間設(shè)置0、2、4 d，將經(jīng)過不同時(shí)間預(yù)培養(yǎng)的葉片在OD600=0.6的浸染液中浸染10 min[10]，用濾紙吸干葉片表面菌液，共培養(yǎng)2 d，結(jié)束共培養(yǎng)后進(jìn)行GUS染色并統(tǒng)計(jì)GUS染色的陽性率以獲得最適預(yù)培養(yǎng)時(shí)間。

GUS染色的陽性率(%)=(著色葉片數(shù)/染色總數(shù))×100%。

1.2.6浸染液中AS濃度篩選

取OD600=0.6時(shí)的農(nóng)桿菌菌液，4 000 r/min離心10 min去上清，用WPM液體培養(yǎng)基重懸菌體配置成浸染液對進(jìn)行外植體浸染，浸染時(shí)間為10 min[10]，共培養(yǎng)2 d，共培養(yǎng)基中AS濃度設(shè)置為0、30、60、90、120 mg/L，將共培養(yǎng)后的葉片進(jìn)行GUS染色，以獲得共培養(yǎng)基中適宜的AS濃度。

1.2.7浸染濃度、浸染時(shí)間及共培養(yǎng)時(shí)間正交實(shí)驗(yàn)

取鉤藤無菌苗葉片裁剪為0.5 cm2大小，設(shè)置預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為0 d，浸染液中添加120 mg/L AS，以O(shè)D600(0.4、0.6、0.8)、農(nóng)桿菌浸染時(shí)間(5、10、15 min)以及共培養(yǎng)時(shí)間(2、3、4 d)設(shè)置L9(34)正交實(shí)驗(yàn)。將共培養(yǎng)結(jié)束的鉤藤葉片進(jìn)行GUS染色，再經(jīng)酒精脫色后統(tǒng)計(jì)GUS染色陽性率，獲得正交試驗(yàn)最優(yōu)組合。每個(gè)處理20皿，每皿放置8個(gè)葉片，3次重復(fù)。

1.2.8陽性植株的獲得及PCR檢測

通過上述實(shí)驗(yàn)所獲得遺傳轉(zhuǎn)化最優(yōu)條件，對鉤藤葉片采用葉盤法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化操作后，接種在含有50 mg/L卡那霉素的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上篩選抗性葉片，將篩選獲得的葉片轉(zhuǎn)接至組培再生體系來獲得抗性幼苗，利用RNA試劑盒提取抗性幼苗葉片中的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GUS基因特異性引物(F-GUS：TACCGACGAAAACGGCAAGA；R-GUS：CAACTCCTACCGTACCTCGC)進(jìn)行PCR檢測，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min預(yù)變性；94 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；再72 ℃延伸5 min，將野生型鉤藤幼苗cDNA作為對照，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用DPS及Minitab 18統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行顯著性(p<0.05)分析，使用Origin 2018軟件進(jìn)行繪圖。數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，不同小寫字母之間表示在(p<0.05)水平上有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 鉤藤組培再生體系的優(yōu)化

2.1.1不同因素對鉤藤愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表1 不同影響因素對鉤藤愈傷誘導(dǎo)率的影響Table 1 The influence of different factors on callus induction of Uncaria rhynchophylla

基本培養(yǎng)基及光照對愈傷組織的形成均有一定的影響。由圖1 A可見，當(dāng)使用WPM作為鉤藤愈傷誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基時(shí)，誘導(dǎo)效果最好且褐化率較低，其次是MS培養(yǎng)基，但通過顯著性分析可知二者并無顯著性差異，而B 5培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果最差，與前兩者相比愈傷誘導(dǎo)率顯著降低，同時(shí)褐化率較高。對外植體遮光處理后愈傷誘導(dǎo)率顯著增高且褐化率顯著降低，相對于光照條件，其出愈時(shí)間縮短(圖1 B)。

注：A為基本培養(yǎng)基對愈傷誘導(dǎo)的影響， B為遮光處理對愈傷誘導(dǎo)的影響。圖1 基本培養(yǎng)基及遮光處理對愈傷組織誘導(dǎo)的影響Fig.1 The effect of basic medium and shading treatment on callus induction

注：A為種子萌發(fā)；B為以WPM為基本培養(yǎng)基所得愈傷組織；C為遮光處理所得愈傷組織；D為愈傷分化產(chǎn)生不定芽。圖2 鉤藤組培再生過程Fig.2 Tissue culture regeneration of Uncaria rhynchophylla

2.1.2基本培養(yǎng)基及激素水平對鉤藤不定芽誘導(dǎo)的影響

基本培養(yǎng)基可以為植物提供其生長發(fā)育所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，不同植物所需的營養(yǎng)種類及所需含量不一樣，外源激素對誘導(dǎo)不定芽發(fā)生也起關(guān)鍵作用。由表2中極差分析得出，基本培養(yǎng)基相較外源激素對誘導(dǎo)不定芽發(fā)生的影響最大，其次是NAA的濃度，6-BA的影響最小，且WPM最適合進(jìn)行鉤藤的不定芽誘導(dǎo)，MS培養(yǎng)基的出芽效果最差。鉤藤不定芽的分化率會(huì)隨著6-BA濃度的增加而增加，但當(dāng)6-BA持續(xù)增長時(shí)，其出芽率也會(huì)有明顯降低的趨勢，低濃度的NAA對誘導(dǎo)鉤藤不定芽的發(fā)生有較好的效果，同時(shí)6-BA與NAA濃度的比值不斷增加時(shí)其出芽率會(huì)逐漸增高。通過顯著性分析，處理2的出芽率最高，為87.6%。

本實(shí)驗(yàn)成功優(yōu)化并建立了高效的鉤藤組培再生體系，依次獲得種子萌發(fā)的鉤藤無菌幼苗、愈傷組織及不定芽(圖2)。

表2 不同影響因素對鉤藤不定芽誘導(dǎo)的交互作用Table 2 Interaction of different influencing factors on adventitious bud induction of Uncaria rhynchophylla

2.2 鉤藤遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

2.2.1鉤藤葉片對卡那霉素的敏感性

由表3得知，不添加卡那霉素時(shí)鉤藤葉片可正常誘導(dǎo)愈傷組織進(jìn)而誘導(dǎo)不定芽的發(fā)生，當(dāng)卡那霉素濃度為30 mg/L時(shí)，抗生素已經(jīng)明顯抑制愈傷組織的發(fā)生，鉤藤葉片出現(xiàn)死亡，此時(shí)愈傷誘導(dǎo)率為48.89%，將愈傷組織轉(zhuǎn)接到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率隨之降低；卡那霉素的濃度增加至50 mg/L時(shí)，鉤藤葉片愈傷誘導(dǎo)率急劇下降，僅有7.49%，此時(shí)葉片大量死亡，不定芽的誘導(dǎo)率也極低；卡那霉素增長至70 mg/L時(shí)，鉤藤葉片的愈傷誘導(dǎo)被完全抑制，不定芽也未成功誘導(dǎo)。綜上，根據(jù)半致死劑量原則，確定篩選培養(yǎng)基中適宜的卡那霉素濃度為30 mg/L。

表3 鉤藤葉片對卡那霉素的敏感性Table 3 Sensitivity of Uncaria rhynchophylla leaves to Kanamycin

注：A為不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間下GUS染色陽性率；B為共培養(yǎng)基中添加不同濃度AS時(shí)GUS染色陽性率。圖3 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間及共培養(yǎng)基中AS濃度對鉤藤葉片遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.3 The effect of pre-cultivation time and AS concentration in the co-culture medium on the genetic transformation efficiency of Uncaria rhynchophylla leaves

2.2.2預(yù)培養(yǎng)時(shí)間及AS濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響

通過GUS染色陽性率顯示，不同的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間及共培養(yǎng)基中AS濃度對鉤藤葉片遺傳轉(zhuǎn)化效率具有顯著性的影響。當(dāng)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間不斷增加，GUS染色的陽性率先增加后降低，不進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)操作時(shí)GUS染色陽性率依舊較高，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為2 d時(shí)，GUS染色陽性率明顯升高，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間增至4 d時(shí)，GUS染色陽性率最低(圖3-A)。同時(shí)GUS染色陽性率會(huì)隨著共培養(yǎng)基中AS濃度的增加不斷增高(圖3-B)，當(dāng)浸染液中不添加AS時(shí)，雖有一定的GUS染色陽性率，但較低，當(dāng)AS的濃度不斷增加時(shí)GUS染色陽性率逐漸增加，AS濃度為120 μmol/L時(shí)，GUS染色陽性率達(dá)到最高。因此，利用鉤藤葉片進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，共培養(yǎng)基中AS的適宜濃度為120 μmol/L。

[80] [美]帕特里克·克羅寧：《南海地區(qū)的權(quán)力與秩序：美國南海政策的戰(zhàn)略框架》，《亞太安全與海洋研究》2017年第1期，第36頁。

2.2.3不同因素對轉(zhuǎn)化效率的交互影響

對正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表4)進(jìn)行極差分析可知，菌液濃度對GUS染色陽性率的影響最大，極差為37.94，其次為農(nóng)桿菌的浸染時(shí)間，而共培養(yǎng)時(shí)間對其影響最小。在農(nóng)桿菌浸染時(shí)間及共培養(yǎng)時(shí)間固定時(shí)，GUS染色陽性率隨菌液濃度的增加呈先升高后降低的趨勢。在OD600=0.8時(shí)鉤藤葉片中GUS染色陽性率較其他濃度顯著提高，在OD600=0.4時(shí)，不斷增加浸染時(shí)間及共培養(yǎng)時(shí)間，GUS染色陽性率依舊較低。浸染時(shí)間為10 min時(shí)，GUS染色陽性率比在其他時(shí)間處理下顯著提高。此外，當(dāng)OD600為0.4～0.6同時(shí)隨著浸染時(shí)間的增加，共培養(yǎng)時(shí)間逐漸增加時(shí)，GUS染色陽性率呈先增加后降低的趨勢即在共培養(yǎng)時(shí)間為3 d時(shí)，轉(zhuǎn)化效率較高。但當(dāng)OD600=0.8，共培養(yǎng)時(shí)間為2 d的條件下，GUS染色陽性率顯著高于其他同菌液濃度下的處理。通過對不同處理下的葉片進(jìn)行GUS染色如圖4，編號8的染色效果較其他處理效果較好，著色強(qiáng)度較大，而編號1的效果最差，著色強(qiáng)度極小。綜上OD600=0.8，農(nóng)桿菌浸染時(shí)間10 min,共培養(yǎng)時(shí)間2 d的條件下轉(zhuǎn)化率最高，為60.06%。

注：1～9為正交表相應(yīng)編號處理下GUS染色效果；10為野生型鉤藤葉片GUS染色效果(10×40)。圖4 正交實(shí)驗(yàn)GUS染色效果Fig.4 Effect of GUS dyeing by orthogonal experiment

注：M為DL 2 000 Marker；PC為陽性對照(PBI 121質(zhì)粒)；NC為陰性對照(野生型鉤藤幼苗)；1～7為轉(zhuǎn)化所得陽性植株反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果。圖5 轉(zhuǎn)化所得鉤藤陽性植株GUS基因PCR擴(kuò)增電泳檢測圖譜Fig.5 The GUS gene PCR amplification and electrophoresis detection pattern of the transformed U. rhynchophylla positive plants

表4 菌液濃度、浸染時(shí)間及共培養(yǎng)時(shí)間對遺傳轉(zhuǎn)化率的影響Table 4 The influence of bacterial solution concentration, dip time and co-cultivation time on genetic transformation rate

2.3 抗性幼苗的陽性檢測

取鉤藤葉片結(jié)合實(shí)驗(yàn)所得最優(yōu)條件組合進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化操作后，接種至愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基加入50 mg/L卡那霉素進(jìn)行篩選后，轉(zhuǎn)接至優(yōu)化所得再生體系中培養(yǎng)抗性鉤藤幼苗，將獲得的抗性植株切取一部分進(jìn)行GUS染色進(jìn)行初步篩選，以檢測抗性幼苗是否為轉(zhuǎn)基因陽性幼苗。再以野生型鉤藤幼苗為對照，將檢測到的7株陽性轉(zhuǎn)基因幼苗提取葉片中的RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR檢測，經(jīng)1%凝膠電泳，結(jié)果見圖4，通過抗性篩選獲得的7株陽性幼苗均擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。

3 討 論

3.1 鉤藤組培再生體系的優(yōu)化

糖原在培養(yǎng)基中除提供能源外還可調(diào)節(jié)滲透壓，而植物在進(jìn)行脫分化形成愈傷組織的過程中能源必不可少[16-17]。WPM培養(yǎng)基因其本身具有較低的無機(jī)鹽含量，更加適應(yīng)鉤藤等木本植物的生長。植物學(xué)研究表明，外植體可在暗培養(yǎng)下進(jìn)行脫分化形成愈傷組織，因此將鉤藤葉片進(jìn)行遮光培養(yǎng)時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率顯著增加。

對大部分的木本植物來說，欲使愈傷組織分化產(chǎn)生不定芽，通常需要一定外源激素的作用；同時(shí)很多木本植物在進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)時(shí)僅添加6-BA和NAA而不添加2,4-D[18]，但結(jié)果顯示，2,4-D對鉤藤愈傷誘導(dǎo)有顯著影響；當(dāng)不斷增加6-BA及NAA的濃度時(shí)，鉤藤不定芽的分化反而降低，這可能和植物種類、生長條件及組織部位等的不同，不同激素的內(nèi)生水平也不相同，因而對不定芽發(fā)生過程來說，它們所要求的外源激素的水平也會(huì)有所不同[19-20]。實(shí)驗(yàn)所得愈傷誘導(dǎo)率最高可達(dá)96.32%，同時(shí)補(bǔ)充遮光及不同培養(yǎng)基對愈傷誘導(dǎo)的影響；不定芽的誘導(dǎo)率為87.6%，較吳順等[14]研究的愈傷誘導(dǎo)率(83.3%)提高13.02%，不定芽發(fā)生率(82.3%)提高5.3%，成功優(yōu)化建立了高效的鉤藤組培再生體系。

3.2 鉤藤遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

篩選培養(yǎng)基添加卡那霉素旨在有效抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長并使其死亡，同時(shí)又要求所添加的濃度不能影響成功轉(zhuǎn)化細(xì)胞的正常生長[21-22]，因此在篩選培養(yǎng)基中所添加的卡那霉素濃度很關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，T-DNA的轉(zhuǎn)移、整合是在共培養(yǎng)階段進(jìn)行，所以需外植體在共培養(yǎng)時(shí)達(dá)到最佳的分裂狀態(tài)，而不同植物在轉(zhuǎn)化前進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)所獲得的效果有所不同，有些植物因脫分化較易且快而不用進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，但很多木本植物其自身脫分化較慢就需要進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)[23-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，鉤藤雖為木本植物，但其外植體不進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化效率反而較高，推測可能與其自身愈傷組織誘導(dǎo)較易及自身特殊性有關(guān)。

在遺傳轉(zhuǎn)化操作中，菌液濃度過低時(shí)浸染效率不高，濃度過高又會(huì)產(chǎn)生毒害作用導(dǎo)致外植體的褐化死亡[26-27]；農(nóng)桿菌是通過傷口進(jìn)入植物組織，根癌農(nóng)桿菌攜帶的目的基因，在共培養(yǎng)階段經(jīng)過加工后，向植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移,進(jìn)而整合到植物基因組中，因此浸泡時(shí)間過短不能使足夠量的農(nóng)桿菌附著于傷口處，從而降低了轉(zhuǎn)化效率，浸泡時(shí)間過長又會(huì)導(dǎo)致外植體的褐化死亡，同時(shí)導(dǎo)致后續(xù)除菌困難[28-29]；共培養(yǎng)時(shí)間的長短，對目的基因的整合及轉(zhuǎn)化細(xì)胞的數(shù)量也有著很大的影響[30]，對鉤藤而言，浸染后隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長，其轉(zhuǎn)化效率反而降低，隨著菌液濃度增加，遺傳轉(zhuǎn)化效率顯著增加，表明較高的菌液濃度適宜其進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，這可能是木本植物其自身的木質(zhì)部發(fā)達(dá)質(zhì)地堅(jiān)硬的原因，也可能是不同種類鉤藤特性及取材時(shí)幼苗的生長狀態(tài)不同，具體原因有待下一步對比探究。

4 結(jié) 論

綜上所述，鉤藤愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為WPM+3 mg/L 2,4-D+1.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+30 g/L蔗糖同時(shí)遮光培養(yǎng)；最適不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為WPM+2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA；葉片對卡那霉素抗壓篩選條件為30 mg/L；最適遺傳轉(zhuǎn)化因子組合為：預(yù)培養(yǎng)2 d，OD600=0.8，共培養(yǎng)基中加入120 μmol/L AS，浸染時(shí)間10 min，共培養(yǎng)時(shí)間2 d。經(jīng)PCR檢測證明，GUS基因可順利轉(zhuǎn)入鉤藤基因組中并作為其遺傳轉(zhuǎn)化的指示基因。表明農(nóng)桿菌介導(dǎo)的鉤藤遺傳轉(zhuǎn)化體系可以構(gòu)建，并能成功得到具有相關(guān)抗性的植株，為鉤藤后續(xù)基因功能的驗(yàn)證及品種改良奠定基礎(chǔ)。