益生菌發(fā)酵飼料對長白種公豬精液品質(zhì)的影響

程澤超，韓培源，武 丹，楊公社，胡建宏，李 曉

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100）

益生菌發(fā)酵飼料（Fermented Feed，F(xiàn)F）能夠有效提高飼料適口性、營養(yǎng)利用度、畜禽生長性能和肉品質(zhì)，是理想的抗生素替代品之一。近幾十年中，人工授精技術(shù)在生豬養(yǎng)殖中廣泛應(yīng)用，在降低疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)、提高優(yōu)良公豬的利用率、促進(jìn)優(yōu)良品種選育等方面發(fā)揮了巨大作用，同時(shí)也對精液品質(zhì)提出了更高要求。孫昌輝研究顯示，利用益生菌發(fā)酵玉米-豆粕全價(jià)飼料，極顯著提高了大白公豬精子的密度和活率，提高精液的抗氧化性能，有效改善了精液品質(zhì)。Guo 等通過16S rRNA 基因測序分析了高精液利用率和低精液利用率的杜洛克公豬糞便微生物組成，發(fā)現(xiàn)瘤胃球菌屬和鞘脂菌屬與精液利用率呈負(fù)相關(guān)，并且低利用率組公豬血清白介素6（Interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor Alpha，TNF-）等促炎因子顯著提高，這提示腸道菌群可能通過調(diào)控公豬的免疫機(jī)能影響精液品質(zhì)。本試驗(yàn)旨在探討不同替代比例的發(fā)酵飼料對公豬生殖性能和糞便菌群的影響，從而為商業(yè)化公豬發(fā)酵飼料的推廣提供試驗(yàn)依據(jù)，并為生態(tài)養(yǎng)殖和動物性食品安全提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 復(fù)合益生菌（蔚藍(lán)生物科技有限公司）包含41.67% 枯草芽孢桿菌、25% 酵母菌、16.67% 植物乳桿菌和16.67%糞腸球菌。試驗(yàn)期全程使用的玉米-豆粕型種公豬基礎(chǔ)日糧由廣西金陵農(nóng)牧集團(tuán)提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)日糧 試驗(yàn)在廣西首牧種豬育種有限公司公豬站進(jìn)行。采取單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取20 頭（150±20）日齡、體重（107.9±12.5）kg 的長白種公豬，隨機(jī)分為5 組。以玉米-豆粕型基礎(chǔ)日糧為底物，按照說明書以1 g/kg 的劑量接種益生菌，水分調(diào)至40%，使用單向排氣發(fā)酵袋密封發(fā)酵4 d 制成發(fā)酵飼料。以發(fā)酵飼料的干物質(zhì)計(jì)算，分別以5%、10%、15%、20%比例替代基礎(chǔ)日糧（5%、10%、15%、20% FF 組）。試驗(yàn)日糧的常規(guī)營養(yǎng)成分及氨基酸組成見表1。

表1 試驗(yàn)日糧營養(yǎng)成分 %

1.3 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)種公豬采用單欄飼養(yǎng)，每天分別于07:00 和17:00 各飼喂1 次，自由飲水，豬舍內(nèi)溫度控制在20℃左右，其他飼養(yǎng)管理流程和免疫流程均按照豬場中常規(guī)飼養(yǎng)管理進(jìn)行。

1.4 血液指標(biāo)測定 在飼養(yǎng)50 d 時(shí)對公豬進(jìn)行前腔靜脈采血5 mL，采集到的公豬血液靜置2 h 后置于4℃的離心機(jī)內(nèi)3 000 r/min 離心15 min，然后吸出上層血清，做好標(biāo)記后置于-20℃保存。使用全自動生化分析儀測定公豬血清的常規(guī)生化指標(biāo)，由廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院明秀分院完成測定；公豬血清免疫球蛋白IgG、IgA 和IgM含量使用ELISA 試劑盒（上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司）測定，每個(gè)樣品2 個(gè)重復(fù)。

1.5 公豬精液采集與指標(biāo)測定 試驗(yàn)第60 天分別對試驗(yàn)種公豬使用手握法采精，收集公豬射精中段部分，經(jīng)過2 層無菌濾紙過雜質(zhì)，然后將精液置于保溫瓶中送至化驗(yàn)室。

使用計(jì)算機(jī)自動分析（CASA）系統(tǒng)檢測精子活率。精子活率定義為沿直線前進(jìn)運(yùn)動的精子數(shù)占總精子數(shù)的百分比。檢測時(shí)，每組各取1 mL 精液，于1.5 mL 離心管中放入37℃水浴鍋中預(yù)熱10 min。檢測時(shí)吸取10 μL精液樣品滴于載玻片上，將載玻片放置于顯微鏡物鏡下的恒溫載物臺（37℃）上預(yù)熱30 s，隨后用CASA 系統(tǒng)進(jìn)行檢測計(jì)算。

采用姬姆薩染色法檢測精子的頂體完整率。取20 μL 待測精液于載玻片，抹片后風(fēng)干，4% 甲醛固定10～15 min，用純水沖洗，風(fēng)干。用姬姆薩染色1.5～2 h，純水沖洗2 次，風(fēng)干。40 倍鏡下觀察，從5 個(gè)不同視野中隨機(jī)檢測200 個(gè)精子進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。若頂體及精子形態(tài)完好，頂脊清晰，頂體部分均勻一致，核后帽分明，精子尾部各段完好，記為頂體完整精子；若頂體膨脹，頂脊模糊，頂體外緣不規(guī)則，或頂體部分脫落，頂體形成缺口、脫離或翻轉(zhuǎn)，或頂體完全脫離，整個(gè)精子頭部呈淡藍(lán)色，均記為頂體損傷。

采用低滲腫脹試驗(yàn)（Hypoosmotic Swelling Test，HOST）法檢測精子質(zhì)膜的完整率。取20 μL 待測精液于1.5 mL EP 管，加入200 mL 37℃預(yù)熱的HOST，37℃孵育30～35 min。取混合液20 μL，抹片后風(fēng)干，2.5%戊二醛固定15 min，純水沖洗，風(fēng)干，置于40 倍鏡下觀察。從5 個(gè)不同的視野中隨機(jī)檢測200 個(gè)精子，依據(jù)計(jì)數(shù)準(zhǔn)則計(jì)數(shù)，精子質(zhì)膜完整率=質(zhì)膜完整精子數(shù)/總精子數(shù)。

1.6 糞便樣品采集與測序 在試驗(yàn)第60 天采集公豬新鮮糞便，離心管分裝迅速置于液氮中保存，后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存至檢測，使用16S rRNA 測序?qū)S菌菌群進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 采用Microsoft Excel 2019 對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，使用單因素方差分析（SPSS 21.0 軟件）對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示，GraphPad Prim 6 軟件作圖。＜0.05 表示差異顯著，＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵飼料對公豬的血液生化指標(biāo)和免疫球蛋白的影響 如表2 所示，發(fā)酵飼料對公豬血清總蛋白、白球比、谷草/谷丙比、尿素氮、甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等均無顯著性影響。如圖1所示，10% 和15% FF 組提高了血清IgG、IgM 和IgA水平（＜0.01）；5% FF 組提高了血清IgA 和IgM 水平（＜0.05）、IgG 水平（＜0.01）；20% FF 組血清IgA 水平（＜0.05）、IgG 和IgM 水平也均提高（＜0.01）。

圖1 發(fā)酵飼料對公豬血清IgA（A）、IgG（B）和IgM（C）水平的影響

表2 發(fā)酵飼料對公豬的血液生化指標(biāo)影響

2.2 發(fā)酵飼料對公豬精液品質(zhì)的影響 發(fā)酵飼料對公豬精液品質(zhì)常規(guī)指標(biāo)的影響如表3 所示。各試驗(yàn)組公豬與對照組公豬在采精量上無顯著差異，但20% FF 組公豬的采精量低于15% FF 組（＜0.05）。與對照組公豬相比，5%、10%、15% FF 組精子活率與A 級精子的比例增高（＜0.05），而B 級精子和C 級精子減少（＜0.05）。10% 和15% FF 組公豬的A+B 級精子數(shù)高于對照組和20% FF 組（＜0.05）。

表3 發(fā)酵飼料對豬精液品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)的影響

如圖2 所示，4 個(gè)試驗(yàn)組公豬精子的頂體完整率均高于對照組公豬（＜0.01）；如圖3 所示，與對照組相比，10%和15% FF 組提高了公豬精子的質(zhì)膜完整率（＜0.01），20% FF 組也提高了公豬精子的質(zhì)膜完整率（＜0.05），但與5% FF 組無顯著差異。

圖2 發(fā)酵飼料對豬精子頂體完整率的影響

圖3 發(fā)酵飼料對豬精子質(zhì)膜完整率的影響

如圖4 所示，20% FF 組精漿果糖水平高于對照組（＜0.05），5%、10% 和15% FF 組公豬精漿果糖水平均高于對照組（＜0.01）。

圖4 發(fā)酵飼料對豬精漿中果糖水平的影響

2.3 發(fā)酵飼料公豬糞菌菌群結(jié)構(gòu)的影響 由于10% 和15% FF 組精液品質(zhì)較好，因此用于深入分析豬糞便菌群的組成。如圖5 所示，基礎(chǔ)日糧和2 個(gè)試驗(yàn)組公豬糞便菌群有9 個(gè)門類，分別是厚壁菌門、擬桿菌門、廣古菌門、螺旋體門、變形菌門、放線菌門、互養(yǎng)菌門、柔膜菌門和酸桿菌門。由表4 可見，10% FF 組豬糞中柔膜菌門低于對照組（＜0.05），15% FF 組糞便厚壁菌門豐度降低，擬桿菌門豐度升高（＜0.05）。

表4 發(fā)酵飼料對公豬糞便菌群的影響（門水平）

圖5 公豬糞便中微生物門水平的相對豐度

對公豬糞便細(xì)菌群落門和科水平的細(xì)菌豐度與精液品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。如表5 所示，在門水平上，柔膜菌門豐度與精子活率呈負(fù)相關(guān)（=-0.64,＜0.05），精漿果糖濃度與厚壁菌門豐度呈負(fù)相關(guān)（=-0.67，＜0.05），與擬桿菌門豐度顯著正相關(guān)（=0.75，＜0.05）；在科水平上，糞便芽胞桿菌科（=-0.64）豐度與精漿果糖濃度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，而擬桿菌科（=0.75）的豐度與精漿果糖濃度均正相關(guān)（＜0.05）。

表5 公豬糞便中細(xì)菌門水平和科水平的細(xì)菌豐度與精液品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討 論

3.1 發(fā)酵飼料對公豬的血液生化指標(biāo)和免疫球蛋白的影響 豬血液的生化指標(biāo)在一定程度上可反映豬的生理和免疫狀況。飼喂發(fā)酵飼料后公豬的血液生化指標(biāo)與對照組沒有顯著差異，說明發(fā)酵飼料對公豬健康沒有負(fù)面影響，這與Vadopalas 等的研究結(jié)果一致。免疫球蛋白對動物機(jī)體的免疫力具有重要作用，血清免疫球蛋白水平能夠間接反映豬只對疾病的抵抗能力。發(fā)酵飼料中的益生菌在進(jìn)入動物的胃腸道后會競爭性抑制病原微生物，益生菌及其代謝產(chǎn)物還能夠通過刺激腸道中的免疫細(xì)胞，進(jìn)而分泌免疫球蛋白和一些細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子和免疫球蛋白進(jìn)入體循環(huán)后進(jìn)一步刺激其他免疫器官；此外，益生菌產(chǎn)生的細(xì)菌素和短鏈脂肪酸（Short Chain Fatty Acids，SCFAs）等物質(zhì)也能夠刺激動物免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。本研究結(jié)果顯示，4個(gè)試驗(yàn)組的公豬血清IgA、IgG 和IgM 水平均高于對照組，與先前的研究結(jié)果一致。綜上結(jié)果表明，益生菌發(fā)酵飼料能夠提高種公豬的免疫功能。

3.2 發(fā)酵飼料對公豬精液品質(zhì)的影響 精子活率是指在所有精子中沿直線運(yùn)動精子所占的比例，只有直線運(yùn)動的精子才能到達(dá)輸卵管與卵子結(jié)合，所以精子活率反映了精液中的有效精子量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，5%、10%和15% FF 組公豬精液中有效精子數(shù)和精子的運(yùn)動性能顯著升高，與杜燁青的研究結(jié)果一致。此外，5%、10%和15% FF 組公豬精液的A 級精子顯著多于對照組，10% 和15% FF 組A+B 級精子數(shù)量顯著增加，表明發(fā)酵飼料有效提高了公豬精子活率，并改善了精子的運(yùn)動性能。

精子頂體位于精子頭的頂部。在頂體反應(yīng)過程中，只有形態(tài)完整、功能正常的頂體才能幫助精子穿過透明帶與卵子結(jié)合，因此精子頂體完整率是衡量精子成功穿透透明帶的重要參數(shù)。在本研究中，5%、10%、15%及20% FF 組公豬的精子頂體完整率極顯著高于對照組，說明發(fā)酵飼料對公豬精子頂體形態(tài)有促進(jìn)作用，有利于精卵結(jié)合。對于精子來說，質(zhì)膜在外界有害物質(zhì)侵害時(shí)保護(hù)精子的重要屏障。本試驗(yàn)結(jié)果表明，10%和15% FF 組公豬精子的質(zhì)膜完整率較對照組均極顯著提高，20% FF 組公豬精子的質(zhì)膜完整率顯著提高，表明發(fā)酵飼料能夠提高公豬精子質(zhì)膜的完整率，從而提高精子質(zhì)量。

公豬精漿為精子提供能量，其中果糖是主要的能量來源。果糖能夠維持精子的正常功能，尤其是確保精子具有足夠的運(yùn)動性。精漿中果糖水平與男性精子的質(zhì)量密切相關(guān)。也有研究結(jié)果表明，在公豬精液稀釋劑中添加果糖能夠延長精液在4℃下的保存時(shí)間，并且顯著提高精子質(zhì)量。本研究結(jié)果顯示，5%、10%和15% FF 組公豬精漿果糖水平極顯著高于對照組公豬，20% FF 組精漿果糖水平顯著高于對照組，這與飼喂發(fā)酵飼料后較高的精子活率一致。本研究表明，發(fā)酵飼料能夠有效增加精漿中的精子能量物質(zhì)，有利于精子保存和后續(xù)的人工授精。

3.3 發(fā)酵飼料對公豬糞菌菌群結(jié)構(gòu)的影響 本研究中厚壁菌門和擬桿菌門是豬糞便細(xì)菌群落中的兩個(gè)優(yōu)勢菌，這與前人的研究結(jié)果一致。在杜洛克公豬的研究中發(fā)現(xiàn)，精液利用率與糞便厚壁菌門的豐度負(fù)相關(guān)，與擬桿菌門的豐度顯著正相關(guān)，提示糞便菌群組成可能影響精液品質(zhì)。眾所周知，雄性動物的肥胖不利于精子的產(chǎn)生和成熟，同時(shí)厚壁菌門/擬桿菌門的比值隨著動物肥胖程度的增加而增加，這從側(cè)面也印證了腸道菌群與精子質(zhì)量有關(guān)。本研究中，15% FF 組公豬糞便中厚壁菌門豐度顯著下降，擬桿菌門豐度顯著增高，發(fā)酵飼料降低了厚壁菌門/擬桿菌門的比值。因此，推測發(fā)酵飼料提高精液品質(zhì)可能與改善腸道微生物群落有關(guān)。

進(jìn)一步相關(guān)性分析顯示，公豬精子活率與糞便柔膜菌門豐度顯著負(fù)相關(guān)，精漿果糖濃度與糞便中厚壁菌門、芽胞桿菌豐度顯著負(fù)相關(guān)，與擬桿菌門、擬桿菌科豐度顯著正相關(guān)。目前，尚未有腸道或糞便微生物菌群影響精漿代謝物的相關(guān)報(bào)道，但從已有的資料來看，飲食中的果糖可以改變腸道菌群組成及代謝，因此推斷果糖代謝與腸道菌群之間應(yīng)該存在某種聯(lián)系，發(fā)酵飼料可能通過改變腸道微生物組成，從而改變精漿中果糖濃度，進(jìn)而影響精子活率和精液品質(zhì)，但具體互作機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵飼料能夠顯著改善長白種公豬的免疫功能、精液品質(zhì)和糞便菌群結(jié)構(gòu)，且發(fā)酵飼料以10%和15%替代基礎(chǔ)日糧對提高公豬精液品質(zhì)效果最佳，同時(shí)發(fā)現(xiàn)公豬糞便菌群與精液品質(zhì)顯著相關(guān)。

致謝：感謝金陵農(nóng)牧集團(tuán)黃雄先生、黃宇婷女士在試驗(yàn)過程中提供的各種便利。