Myf5 基因在不同時期綿羊胎兒半腱肌和背最長肌中的表達及生物信息學分析

竇敏敏，趙迪鵬，王鶴潔，郭田燕，李俊玲，李 君，王聰慧，秦 健,2，李穎靚，杜 榮*

（1.山西農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，山西太谷 030801；2.山西農業(yè)大學實驗教學中心，山西太谷 030801）

骨骼肌主要由成束狀排列的骨骼肌纖維構成，包括肌漿網、橫小管和肌原纖維，其不僅為動物組織的葡萄糖氧化和脂肪酸氧化提供重要場所，而且也為哺乳動物的產熱和運動提供保障。在畜禽體內，骨骼肌發(fā)育是否良好還是決定肉產量和肉品質的主要因素。骨骼肌的形成發(fā)展過程是一個循序漸進、極其復雜的微觀生物學過程，包括胚胎期和幼年期的肌肉發(fā)育以及成年骨骼肌損傷再生修復過程。胚胎期是骨骼肌發(fā)育的最關鍵時期，大多數肌纖維都是在胚胎期形成。肌細胞在形成及融合過程中涉及多種因子的參與，其中生肌調節(jié)因子（Myogenic Regulatory Factors,MRFs）家族對肌管分化和成肌命運決定及骨骼肌系統(tǒng)的發(fā)育成熟發(fā)揮著關鍵的作用。

肌源性因子5（Myogenic Factors 5，Myf5）是生肌調節(jié)因子MRFs 家族的重要成員，對肌細胞生成與分化及其新陳代謝等活動都具有至關重要的調節(jié)作用?；蛟诔杉〖毎粩嘣鲋车纳L過程中迅速得到廣泛表達，主要調節(jié)肌細胞的形成、再生和穩(wěn)態(tài)。Myf5 和MyoD 一起充當骨骼肌分化的特異性轉錄因子，協(xié)同MyoD 在肌肉形成過程中發(fā)揮重要作用。Kablar等敲除小鼠的和基因后，顯著抑制了其成肌細胞和肌纖維的生成能力。缺失基因的成年小鼠，骨骼肌會發(fā)生微妙的、進行性的肌病，肌纖維直徑異質性增加，中央成核和纖維化增加?；驅∪獾恼{控包括胎兒出生前后肌肉生長發(fā)育階段中的調控和發(fā)育成熟肌肉受損后再生過程中的調控。目前，基因在胎兒發(fā)育過程中的功能研究主要集中在小鼠上，在綿羊中的研究相對較少。綿羊是重要的產肉經濟動物，但其骨骼肌在早期胚胎中形成和發(fā)育的機制尚未徹底闡明，有關綿羊基因的生物信息學分析及在綿羊胎兒不同發(fā)育時期半腱肌和背最長肌中表達規(guī)律的比較研究鮮有報道，因此，本實驗通過qRTPCR 檢測了mRNA 在綿羊胎兒不同發(fā)育時期半腱肌和背最長肌中的表達變化，并對綿羊Myf5 蛋白序列進行了一系列生物信息學分析，預測了該蛋白的結構特性和下游靶基因，旨在為深入研究綿羊基因的作用機理和表達調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及樣品采集 本實驗采取妊娠30 d（E30）、50 d（E50）和70 d（E70）小尾寒羊胎兒的半腱肌和背最長肌，每種組織各2 份，一份保存于液氮中備用，另一份置于Bouin's 固定液中，4℃保存。

1.2 主要設備和試劑 生物組織包埋機、切片機和烤片機均由上海益迪醫(yī)藥設備廠生產；光學顯微鏡由德國Leica 公司生產；熒光定量PCR 儀由美國BIO-RAD 公司生產；核酸蛋白測定儀由美國Thermo 公司生產；蘇木精染液、伊紅染液均購自北京索萊寶科技有限公司；Trizol 試劑和實時熒光定量試劑均購自TaKaRa 公司。

1.3 石蠟切片制備和HE 染色 將Bouin's 固定液中的胎羊半腱肌組織和背最長肌組織取出，流水沖洗過夜；修剪組織塊并分別用60%、70%、80%、90%、95%、100%酒精對組織進行梯度脫水；二甲苯透明處理3 次；在生物組織包埋機上用石蠟包埋組織塊，然后用切片機進行切片，厚度為6 μm；將切片貼于載玻片上進行脫蠟與水化；分別用蘇木精染液和伊紅染液對切片進行染色；脫水透明后用中性樹膠封片；將切片置于光學顯微鏡下進行拍照觀察。

1.4 引物設計及合成 根據GenBank 數據庫中綿羊-（NM_001009784.3）和（ΧM_015094556.3）基因mRNA 序列，利用Primer Premier 5.0 設計實時熒光定量PCR 引物（表1），并由北京華大基因生物技術有限公司合成。

表1 引物序列

1.5 實時熒光定量PCR 以-基因為內參，利用TB Green Premix Ex Taq II（2Χ）試劑盒采用兩步法進行qRT-PCR 檢測。實時熒光定量PCR 體系：TB Green Premix Ex Taq II（2Χ）5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，cDNA 模板（100 ng/μL）1 μL，滅菌水補足至10 μL。PCR 擴增程序：預變性95℃ 5 min，PCR反應95℃ 32 s、65℃ 35 s，共40 個循環(huán)。每組6 個動物樣本，每個樣本重復3 次。

1.6 數據統(tǒng)計和分析 根據基因和-基因的Ct 值，采用2法計算基因的相對表達量，通過SPSS 21.0 軟件進行數據統(tǒng)計分析，用GraphPad Prism 8.0 軟件制作柱狀圖。＜0.05 表示差異顯著，＜0.01 表示差異極顯著。

1.7 綿羊Myf5 蛋白生物信息學分析 運用表2 中的生物信息學相關軟件和網站，對綿羊Myf5 蛋白的結構特征及下游靶基因進行分析。

表2 綿羊Myf5 蛋白結構特征的生物信息學分析軟件

2 結果與分析

2.1 胎兒半腱肌和背最長肌組織HE 染色結果 HE 染色結果顯示，綿羊胎兒半腱肌和背最長肌組織的顯微結構變化相似，隨著綿羊胎齡的逐漸增大，肌纖維的數量和橫截面積也逐漸增大，同一時期背最長肌的增長幅度相對較大（圖1）。

圖1 綿羊胎兒不同發(fā)育階段半腱肌和背最長肌的HE 染色結果（50 μm）

2.2 實時熒光定量PCR 結果 熒光定量檢測綿羊胎兒不同發(fā)育階段半腱肌和背最長肌基因mRNA 的表達變化結果，如圖2A 和2B 所示，基因在綿羊胎兒E30～E70 時期半腱肌和背最長肌中mRNA 的表達量均呈持續(xù)上升趨勢，E50 時期相對表達量分別為E30 時期的1.28 倍和1.43 倍，差異顯著或極顯著，E70 時期相對表達量分別為E50 時期的1.64 倍和1.43 倍，差異極顯著或顯著，E70 時期相對表達量分別為E30 時期的2.12 倍和1.73 倍，差異極顯著。在同一時期與半腱肌相比，E30、E50 和E70 背最長肌中mRNA 的表達量分別高3.6 倍、3.57 倍和2.73 倍，差異極顯著（圖2C）。

圖2 Myf5 基因mRNA 在綿羊胎兒不同發(fā)育階段半腱肌和背最長肌中的表達

2.3 綿羊Myf5 蛋白生物信息學分析結果

2.3.1 綿羊Myf5 蛋白的理化性質分析結果 利用ProtParam 在線網站對綿羊Myf5 蛋白進行分析，結果顯示綿羊基因編碼255 個氨基酸，其中含量最多的是Ser（S），占比為12.94%，不含Ply（O）和Sec（U）。分子式為CHNOS，分子量為28 282.59。消光系數（280 nm）為23 545，不穩(wěn)定系數為72.99，等電點（PI）為5.72，表明綿羊Myf5 蛋白是一個不穩(wěn)定的酸性蛋白。帶負電荷的殘基數（Asp+Glu）為33，帶正電荷的殘基數（Arg+Lys）為28。脂肪系數為58.94，平均親水性系數為-0.658。在大腸桿菌體內預測Myf5 蛋白的半衰期大于10 h，在酵母菌體內的半衰期大于20 h。

2.3.2 綿羊Myf5 氨基酸序列的同源性及系統(tǒng)進化樹分析結果 運用DNAstar 和MEGA 軟件分析綿羊Myf5氨基酸序列的同源性并構建系統(tǒng)進化樹。結果表明，綿羊Myf5 氨基酸序列與山羊（NP_001273966.1）、牛（NP_776541.1）、豬（NP_001265704.1）、人（NP_005584.2）、猩猩（ΧP_002823592.1）、食蟹猴（ΧP_005571691.1）、貓（ΧP_003989125.1）、獵豹（ΧP_014919163.2）、田鼠（ΧP_005358152.1）、家犬（ΧP_038544051.1）、大鼠（NP_001100253.1）、小鼠（NP_032682.1）物種之間的同源性分別為100%、99.2%、96.1%、94.5%、94.5%、94.1%、93.3%、92.9%、91.0%、89.0%、89.0%、88.2%；變異度分別為0%、0.8%、4.0%、5.7%、5.7%、6.1%、7.0%、7.4%、9.6%、11.9%、11.9%、12.8%（圖3）。系統(tǒng)進化樹中綿羊與牛和山羊聚為一支，進化距離最近（圖4）。

圖3 綿羊Myf5 氨基酸序列同源性分析

圖4 綿羊Myf5 氨基酸序列系統(tǒng)進化樹

2.3.3 綿羊Myf5 蛋白結構預測及評估 運用SOPMA在線網站預測，結果顯示綿羊Myf5 蛋白的二級結構中螺旋有81 個，占31.76%；轉角有5 個，占1.96%；折疊有23 個，占9.02%；無規(guī)則卷曲有146 個，占57.25%（圖5A）。利用在線網站SWISS-MODEL 預測，結果顯示綿羊Myf5 蛋白的三級結構主要由螺旋和無規(guī)卷曲組成（圖5B）。利用SAVES 在線網站評估模擬蛋白結構的質量，結果顯示，殘基在[A,B,L]區(qū)域和[a,b,l,p] 區(qū)域的比例分別為84.1% 和15.9%，而在[～a,～b,～l,～p] 區(qū)域和 無標記區(qū)域的比例均為0（圖5C）。

圖5 綿羊Myf5 蛋白結構預測及評估

2.3.4 綿羊Myf5 蛋白的亞細胞定位和結構域預測結果使用在線網站PredictProtein 預測，結果顯示綿羊Myf5蛋白主要定位于細胞核（圖6A），推測綿羊Myf5 蛋白主要發(fā)揮轉錄因子的功能。通過SMART 在線網站預測，結果顯示綿羊Myf5 蛋白在100～200 氨基酸位置處存在一個bHLH 結構域（basic HLH）（圖6B）。

圖6 綿羊Myf5 蛋白亞細胞定位和結構域預測

2.3.5 綿羊Myf5 蛋白的疏水性分析結果 如圖7 所示，第207 位氨基酸（亮氨酸）處疏水指數最大為1.433，第94 位氨基酸（精氨酸）處親水指數最小為-2.622，可以看出氨基酸序列有明顯的親水性區(qū)域，表明Myf5蛋白有較強的親水性，推測綿羊Myf5 蛋白屬于親水性蛋白。

圖7 綿羊Myf5 蛋白疏水性分析

2.3.6 綿羊Myf5 蛋白的磷酸化位點分析結果 使用Netphos 3.1 在線網站預測綿羊Myf5 蛋白的磷酸化位點，結果顯示綿羊Myf5 蛋白含有41 個潛在的磷酸化位點，包括28 個絲氨酸位點，10 個蘇氨酸激酶位點，3 個酪氨酸激酶位點（圖8）。

圖8 綿羊Myf5 蛋白的磷酸化位點分析

2.3.7 綿羊Myf5 的下游靶基因預測結果 由表3 可知，綿羊調控的下游靶基因中存在和，結合位點的核心序列是E-box（CANNTG）。

表3 綿羊Myf5 下游靶基因預測結果

3 討 論

骨骼肌是哺乳動物體內數量最多的組織，主要由終末分化的肌細胞組成，具有高度可塑性，對機體的運動和代謝等生理生化功能起著重要作用。Myf5 作為肌源性調節(jié)因子，在骨骼肌發(fā)育過程中發(fā)揮關鍵作用。該基因對肌細胞增殖和分化有重要影響，當新生小鼠體內缺失基因時，成肌細胞的增殖和分化減少。Myf5 與成肌纖維的數量和大小也有著密切的聯(lián)系，可以誘導祖細胞向骨骼肌轉化。本實驗中胎羊半腱肌和背最長肌HE 染色結果表明，肌纖維大多呈短柱狀，大多數細胞核呈卵圓形且多位于細胞中央，少部分散布在細胞質邊緣，符合肌肉早期發(fā)育的特征。隨著胎羊胎齡的逐漸增大，肌纖維的數量逐漸增多，橫截面積也逐漸增大，而在此發(fā)育階段中基因在半腱肌和背最長肌E30、E50 和E70 時期均存在表達且表達量隨發(fā)育階段均呈逐漸上升趨勢，說明在綿羊胚胎早期發(fā)育階段，隨著胎齡增加骨骼肌組織對Myf5 的需求量不斷增多。韓建剛等近期研究表明生肌調節(jié)因子MyoD、MyoG、Myf5 和Myf6 在灘羊胎兒E70 發(fā)育時期骨骼肌組織中的表達均顯著高于E60 時期，說明MRFs 家族各基因表達之間的相關性。本實驗進一步的預測結果表明，綿羊Myf5 作為轉錄因子，其下游靶基因包括和等骨骼肌發(fā)育相關基因。因此，可以推測本實驗中基因表達隨發(fā)育階段E30、E50 和E70 逐漸升高的原因可能是基因作為MRFs 家族中最早被誘導表達的轉錄因子需要激活其他肌肉發(fā)育相關基因的轉錄表達，從而共同誘導肌肉表型出現以促進綿羊胎兒肌肉組織的最終形成。朱文奇通過研究鴨胸肌和腿肌中Myf5 的表達規(guī)律發(fā)現，基因的表達具有組織特異性。本實驗通過對綿羊半腱肌和背最長肌2 種骨骼肌進行比較研究發(fā)現，基因mRNA 在半腱肌和背最長肌的表達隨著E30、E50 和E70 胎兒發(fā)育時期均呈現相同的升高趨勢，但同一時期2 種組織中的表達量并不相同，在背最長肌中的表達量明顯要高，這與顯微結構中觀察到的背最長肌比半腱肌發(fā)育較快是相適應的，因為基因的表達是決定成肌細胞增殖分化并形成肌纖維的關鍵因素。在哺乳動物和鳥類正在發(fā)育的體節(jié)中，受Hedgehog 和Wnt1 信號蛋白的誘導，基因在體節(jié)背內側區(qū)域起始表達，然后進一步啟動MRFs 家族其他基因的表達，而基因起始表達的細胞將發(fā)育為背肌?？梢?，與其他物種類似，綿羊Myf5 的組織特異性不僅體現在肌肉特異性表達，而且與肌肉組織的發(fā)育部位有著密切關系。

本研究通過生物信息學預測分析表明，綿羊Myf5蛋白定位于細胞核，主要由螺旋和無規(guī)卷曲構成，含有典型的bHLH 結構域，與下游靶基因結合位點的核心序列是bHLH 結構域特異性識別的E-box 元件序列（CANNTG），為進一步研究Myf5 蛋白的調控機制奠定了基礎。該蛋白包含氨基酸總數為255 個，分子量為28 282.59，等電點（PI）為5.72，不穩(wěn)定系數為72.99，表明綿羊Myf5 蛋白是一個不穩(wěn)定的酸性蛋白，可為該蛋白的變性和復性提供一定的理論依據。Myf5 蛋白在大腸桿菌體內和酵母菌體內的半衰期均比較長。有研究表明，半衰期長的蛋白含有信號肽的比例較低，而本實驗分析得到的Myf5 蛋白沒有信號肽，與其研究結果一致。親水性平均系數為-0.658，且氨基酸序列有明顯的親水性區(qū)域，推測綿羊Myf5 蛋白屬于親水性蛋白，為后期利用基因工程菌對Myf5 體外分泌性表達提供了依據。同源性比對及系統(tǒng)進化樹結果顯示，綿羊Myf5 氨基酸序列與山羊、牛、豬、人、猩猩、食蟹猴、貓、獵豹、田鼠、相應氨基酸序列的同源性均超過90%，進化樹中綿羊與牛和山羊聚為一支，進化距離最近，該結論可為進一步通過比較研究不同物種間Myf5 的功能和結構特點、發(fā)現關鍵作用位點奠定基礎。

4 結 論

本研究通過生物信息學相關軟件對綿羊Myf5 蛋白的理化性質和蛋白特性及下游靶基因進行了預測分析，并通過實時熒光定量PCR 檢測發(fā)現，基因mRNA在胎羊半腱肌和背最長肌E30～E70 時期的表達量均呈現上升趨勢，但同一時期在背最長肌中的表達更高，這與顯微結構顯示的背最長肌發(fā)育較快相適應。