溶血性曼氏桿菌重要抗原的免疫原性分析

陸奕彤　李垚　楊發(fā)龍

摘要：旨在通過分析溶血性曼氏桿菌重要抗原的免疫原性，為疫苗和診斷試劑研制提供依據(jù)。在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，構(gòu)建溶血性曼氏桿菌lktA、ompA、plpE、plpF、ompP2和gs60基因的原核重組表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行表達(dá)，獲得重組蛋白質(zhì)。隨后用被抗溶血性曼氏桿菌感染的綿羊血清進(jìn)行Western-blot和酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA），評價各蛋白質(zhì)的免疫原性并篩選優(yōu)勢免疫原;用各重組蛋白質(zhì)免疫小鼠，評價免疫小鼠后誘導(dǎo)其產(chǎn)生的抗體水平，以評價各重組蛋白質(zhì)作為重組疫苗的潛在價值。Western-blot和ELISA檢測結(jié)果表明，各重組蛋白質(zhì)均具有良好的免疫原性，其中rLktA、rOmpA、rGs60與感染的綿羊血清結(jié)合能力最強(qiáng)，為優(yōu)勢免疫原;各重組蛋白質(zhì)免疫小鼠后均能誘導(dǎo)其產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，其中rOmpA、rPlpE和rPlpF免疫小鼠后誘導(dǎo)其產(chǎn)生的抗體在免疫后35 d仍能與全菌蛋白質(zhì)結(jié)合。研究結(jié)果為溶血性曼氏桿菌感染血清學(xué)診斷試劑的開發(fā)和新型疫苗的研制提供了重要的試驗數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：溶血性曼氏桿菌;重要抗原;免疫原性

中圖分類號：S852.61+2文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1000-4440（2022）02-0446-07

Immunogenicity analysis of major antigens of Mannheimia haemolytica

LU Yi-tong，LI Yao，YANG Fa-long

Abstract：The purpose of this study is to compare and analyze the immunogenicity of major antigens of Mannheimia haemolytica， and to provide a basis for the development of vaccines and diagnostic reagents. Based on bioinformatics analysis， prokaryotic expression vectors of lktA， ompA， plpE， plpF， ompP2 and gs60 genes were constructed and transformed into Escherichia coli BL21（DE3）， and recombinant proteins were expressed and purified. Subsequently， Western-blot and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） were performed by using sheep anti-Mannheimia haemolytica serum to evaluate the immunogenicity of each protein， and to screen the dominant immunogens. Meanwhile， mice were immunized with each recombinant protein， and the antibody levels were tested to evaluate potential value of each protein as a recombinant vaccine. The results demonstrated that all tested proteins were good immunogens， while rLktA， rOmpA and rGs60 showed the strongest binding ability to infected sheep serum， suggesting that they were the dominant immunogens of Mannheimia haemolytica. All recombinant proteins could induce humoral immune response in mice， while rOmpA， rPlpE and rPlpF could induce high titer antibody after 35 days post immunization. These results provide important data for developing serological diagnostic tools and new vaccines.

Key words：Mannheimia haemolytica;important antigen;immunogenicity

溶血性曼氏桿菌（Mannheimia haemolytica）屬于巴氏桿菌科曼氏桿菌屬，是一種革蘭氏陰性兼性厭氧球桿菌。其作為一種條件致病菌，溶血性曼氏桿菌常存在于牛、羊等反芻動物上呼吸道中。當(dāng)動物受到一些應(yīng)激因素（如天氣驟變、長途運(yùn)輸或病毒、支原體感染等）影響，造成機(jī)體免疫能力下降時，溶血性曼氏桿菌便可入侵動物肺部，引起動物發(fā)生嚴(yán)重的肺炎[1-2]。溶血性曼氏桿菌是公認(rèn)的引起牛呼吸道綜合征（Bovine respiratory disease complex，BRDC）的主要病原[3]。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，溶血性曼氏桿菌同樣是導(dǎo)致綿羊和山羊等小反芻動物發(fā)生呼吸道疾病的重要病原[4]，還可以導(dǎo)致羔羊敗血癥和母羊乳房炎的發(fā)生[5-6]。

目前，中國還缺乏針對溶血性曼氏桿菌的使用廣泛且安全有效的商品化疫苗，同時也沒有特異、敏感的血清學(xué)診斷試劑，而國外使用的商品化疫苗僅能提供部分免疫保護(hù)[7]。因此，有必要對溶血性曼氏桿菌的病原特征及其重要的免疫原進(jìn)行深入研究，從而有助于溶血性曼氏桿菌新型疫苗和血清學(xué)診斷試劑的研制。

國內(nèi)外研究者已經(jīng)在溶血性曼氏桿菌免疫原方面進(jìn)行了一些相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞毒素（LKT）及OmpA、PlpE等多個外膜蛋白質(zhì)等均具有良好的免疫原性，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)作用[8-10]。然而，雖然上述研究對一些潛在的診斷抗原和疫苗的候選蛋白質(zhì)進(jìn)行了評價，但對于其中哪些可以作為優(yōu)勢免疫原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平免疫應(yīng)答尚不清楚。此外，相關(guān)研究多以牛源菌株為對象，分析其感染牛后誘導(dǎo)牛產(chǎn)生的免疫應(yīng)答情況，而對溶血性曼氏桿菌感染羊后誘導(dǎo)羊產(chǎn)生的免疫應(yīng)答情況的報道甚少。

本研究分析比較了溶血性曼氏桿菌感染羊后LktA、OmpA、PlpE、PlpF、OmpP2、Gs60等6個重要免疫原在羊體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平以及這些免疫原的重組蛋白質(zhì)在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答水平，從而為血清學(xué)診斷試劑的開發(fā)和新型疫苗的研制提供有用的試驗數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1菌株、載體及血清

溶血性曼氏桿菌臨床分離株S4由筆者所在實驗室（西南民族大學(xué)青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點實驗室）分離鑒定和保存;pET-28α（+）載體為Novagen公司產(chǎn)品;大腸桿菌E.coil DH5α、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品;35份溶血性曼氏桿菌感染綿羊血清及3份陰性血清由筆者所在實驗室收集并保存。

1.2主要試劑

氨芐青霉素、卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購自美國Sigma公司;金牌Mix（green）Golden Star T6 Super PCR Mix（1.1×）購自北京擎科信業(yè)生物公司;核酸相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DNA marker、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品、限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ、XhoⅠ與T4 DNA連接酶購自日本TaKaRa公司;Gel Extraction Kit、Plasmid Miniprep Kit、Cycle Pue Kit購自美國Omega公司;鎳金屬螯合親和[組氨酸（His）標(biāo)簽蛋白]蛋白質(zhì)純化柱購自常州天地人和生物科技有限公司;27 mm透析袋（相對分子質(zhì)量：35 000）購自廣州賽國生物科技有限公司;辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記驢抗綿羊、HRP標(biāo)記山羊抗鼠、SuperLumia ECL HPR Substrate Kit購自美國Abbkine公司;磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、酶標(biāo)抗體稀釋液、血清稀釋液、3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色液、終止液購自武漢博士德生物工程有限公司;二喹啉甲酸（BCA）蛋白質(zhì)定量試劑購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;酶標(biāo)板購自Corning公司。

1.3引物設(shè)計

為制備原核表達(dá)重組蛋白質(zhì)，對ompA、plpE、plpF、ompP2、gs60基因全長編碼序列（CDS）進(jìn)行克隆;對于lktA基因，對其2 019～2 819位核苷酸編碼序列進(jìn)行截短表達(dá)。PCR擴(kuò)增引物用Primer Premier 5軟件設(shè)計，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物具體信息見表1。

1.4PCR擴(kuò)增

采用常規(guī)酚-三氯甲烷法從溶血性曼氏桿菌S4株中提取總DNA作為模板，利用表1中的引物對各基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)總體系為20 μl，包括Mix（green）Golden Star T6 Super PCR Mix（1.1×）（5 U/μl）10 μl，上游引物、下游引物各1 μl，DNA模板2 μl，去離子水6 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min;94 ℃變性30 s，退火30 s（lktA、ompA、plpF、plpE、ompP2、gs60基因?qū)?yīng)的退火溫度分別為60.0 ℃、58.0℃、63.0 ℃、57.7 ℃、57.8 ℃、55.9 ℃）;72.0 ℃延伸（其中g(shù)s60基因延伸1 min 30 s，其他基因均延伸40 s），共35個循環(huán);72.0 ℃延伸10 min，16 ℃結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.5原核表達(dá)載體的構(gòu)建

利用Gel Extraction Kit對上述各PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化。隨后用限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ、Xho Ⅰ對pET-28a（+）載體及純化的目的片段進(jìn)行雙酶切。利用Cycle Pue Kit純化酶切產(chǎn)物，采用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，然后將重組質(zhì)粒DH5α工程菌涂布于含有卡那霉素（50 μg/ml）的LB瓊脂選擇培養(yǎng)基上。第2 d挑取疑似陽性菌落，利用質(zhì)粒提取試劑盒Plasmid Miniprep Kit對其進(jìn)行質(zhì)粒提取，隨后進(jìn)行PCR鑒定和Bam HⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，將鑒定為陽性的樣本送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序確認(rèn)。

1.6重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)和可溶性分析

將pET-28a（+）-X轉(zhuǎn)化至Escherichia coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，獲得表達(dá)工程菌，將表達(dá)工程菌菌種按1∶100的體積比接入100 ml LB液體培養(yǎng)基（卡那霉素質(zhì)量濃度為50 μg/ml）中，將終濃度為1 mmol/L的IPTG于37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)9 h，然后取2 ml菌液，于8 000 r/min、4 ℃離心15 min，收集菌體，經(jīng)pH值為7.4的PBS重懸，與等體積的2×SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）上樣緩沖液混合，加熱煮沸5 min，通過含量為12%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

將檢測正確的樣本在冰水浴中通過超聲波破碎儀于400 W破碎20 min（超聲2 s+暫停6 s為1個循環(huán)），破碎后于12 000 r/min、4 ℃離心15 min，分別收集沉淀、上清。取少許沉淀，經(jīng)pH值為7.4的PBS重懸，然后將沉淀、上清均用含量為12%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE，對重組蛋白質(zhì)進(jìn)行可溶性分析。

1.7重組蛋白質(zhì)的純化

將上述誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液于8 000 r/min、4 ℃離心15 min，收集菌體并用PBS重懸，在冰浴中進(jìn)行超聲破碎（400 W，20 min）。破碎后于12 000 r/min、4 ℃離心15 min，棄去上清，收集沉淀，將沉淀用破碎Buffer（Binding Buffer）溶解，在冰浴中進(jìn)行二次超聲破碎，于400 W破碎20 min（超聲2 s+暫停 6 s為1個循環(huán)），破碎后于12 000 r/min、4 ℃離心20 min，收集上清液，進(jìn)行鎳瓊脂糖親和層析純化。最后將制備好的各組分蛋白質(zhì)置于-80 ℃冰箱中保存。

1.8優(yōu)勢免疫原的篩選

為評價溶血性曼氏桿菌感染羊后蛋白質(zhì)rOmpA、rPlpE、rPlpF、rOmpP2、rGs60誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力，篩選能夠與感染動物血清抗體高效結(jié)合的優(yōu)勢免疫原，以上述純化的各重組蛋白質(zhì)作為包被抗原，分別以臨床感染綿羊陽性血清、陰性血清作為一抗，進(jìn)行間接酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ELISA）。主要過程如下：每孔用100 μl、5 μg/ml重組蛋白質(zhì)包被酶標(biāo)板，用PBST（500 ml PBS+25 μl Tween-20）洗滌3次后再用5%（質(zhì)量體積比）脫脂奶粉在37 ℃作用2 h進(jìn)行封閉，洗滌3次后加入100 μl按1∶200稀釋的臨床感染動物血清或陰性血清，在37 ℃孵育1 h，洗滌5次后加入100 μl按1∶6 000稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記驢抗綿羊免疫球蛋白（IgG），37 ℃孵育45 min，洗滌5次后加入100 μl底物3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB），室溫下顯色10 min，加入100? μl終止液，并在酶標(biāo)儀上讀取OD450。

1.9重組蛋白質(zhì)的免疫原性分析

將40 μg重組蛋白質(zhì)與ISA 201佐劑按等體積混合進(jìn)行乳化，分別免疫6只6～8周齡的雌性BALB/c小鼠，并設(shè)PBS對照組。首次免疫14 d后用相同劑量進(jìn)行二次免疫，并分別于首次免疫后0 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d采集小鼠血清。以各重組蛋白質(zhì)作為包被抗原（1孔50 ng），以按1∶50比例稀釋的小鼠血清為一抗進(jìn)行間接ELISA檢測，從而評價各重組蛋白質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平（用OD450表示）。

2結(jié)果與分析

2.1溶血性曼氏桿菌重要抗原編碼基因的PCR擴(kuò)增

為了構(gòu)建重要抗原編碼基因的原核表達(dá)載體，利用表1中的引物對各基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果均獲得與預(yù)期大小一致的條帶，詳見圖1。

2.2原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定結(jié)果

對目的片段和pET-28a（+）載體進(jìn)行雙酶切后，將酶切所得基因分別與pET-28a（+）連接，并用連接后的載體分別轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，再用含有卡那霉素的LB瓊脂平板篩選疑似陽性菌落，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，對質(zhì)粒進(jìn)行特異性PCR鑒定，且使用Bam HⅠ和XhoⅠ對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。結(jié)果表明，除了在相應(yīng)位置出現(xiàn)與預(yù)期相符的目的條帶外，還在5 800 bp左右處出現(xiàn)了條帶。此外，測序結(jié)果顯示，6個質(zhì)粒均為陽性質(zhì)粒，表明本研究成功構(gòu)建了6個重組原核表達(dá)載體。

2.3重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)和可溶性分析

將誘導(dǎo)的菌液離心，用PBS重懸沉淀并洗滌沉淀后在冰水浴中進(jìn)行超聲破碎，破碎完成后，離心分離上清液和沉淀，分別使用上清液、沉淀進(jìn)行SDS-PAGE?？扇苄苑治鰴z測結(jié)果顯示，6個重組蛋白質(zhì)破碎后的上清液中均沒有出現(xiàn)條帶，而沉淀中出現(xiàn)與預(yù)期相符的目的條帶（圖2），說明6個重組蛋白質(zhì)都以包涵體的形式表達(dá)。

2.4重組蛋白質(zhì)的純化

將菌體經(jīng)過第1次PBS重懸破碎洗滌后，留下的沉淀再用含有8 mol/L尿素的Buffer Ⅱ 溶解破碎，將離心后留下的上清液過鎳柱，進(jìn)行鎳柱親和層析純化。在洗雜和洗脫過程中，使用具有不同咪唑濃度（20 mmol/L、50 mmol/L和500 mmol/L）的Wash Buffer進(jìn)行梯度洗脫，對收集到的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE檢測。由圖3可以看出，各基因?qū)?yīng)的重組蛋白質(zhì)經(jīng)電泳后均有單一且符合預(yù)期大小的目的條帶，表示重組蛋白質(zhì)的純化效果良好。對純化結(jié)果良好的蛋白質(zhì)組分進(jìn)行透析復(fù)性、濃縮及二喹啉甲酸（BCA）試劑盒蛋白質(zhì)濃度檢測，以便進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

2.5優(yōu)勢免疫原的篩選結(jié)果

使用按上述步驟制備的純化重組蛋白質(zhì)作為包被抗原，以臨床感染動物血清及陰性血清作為一抗，進(jìn)行間接ELISA檢測，其目的是為了能夠篩選與感染動物血清高效結(jié)合的優(yōu)勢免疫原。由圖4可以看出，溶血性曼氏桿菌感染羊后，本研究選擇的6種免疫原蛋白質(zhì)在綿羊體內(nèi)產(chǎn)生的6種抗體水平存在明顯差異，可見不同重組蛋白質(zhì)與感染血清的結(jié)合能力也有差異，按OD值從高到低排序為 rOmpA、rLktA、rGs60、rPlpE、rOmpP2、rPlpF。由此可見，rOmpA、rLktA和rGS60是進(jìn)行溶血性曼氏桿菌血清學(xué)診斷試劑開發(fā)的良好候選蛋白質(zhì)。

2.6重組蛋白質(zhì)疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的抗體水平

為了評價制備的重組蛋白質(zhì)作為亞單位疫苗候選蛋白質(zhì)的潛力，將具有相同蛋白質(zhì)劑量（40 μg）并且經(jīng)無菌檢驗及物理性狀檢驗的重組蛋白質(zhì)疫苗分組后經(jīng)皮下注射免疫小鼠，以免疫后不同時間的小鼠血清作為一抗，以純化的重組蛋白質(zhì)作為包被抗原，進(jìn)行間接ELISA檢測，以評價重組蛋白質(zhì)免疫小鼠后能否使小鼠產(chǎn)生特異性抗體、抗體水平的變化及抗體的持續(xù)時間。由圖5可以看出，6個重組蛋白質(zhì)均能使小鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答，其中rLktA、rOmpA、rPlpE、rPlpF、rGs60經(jīng)過2次免疫后，抗體水平不斷上升，并持續(xù)至試驗首免后35 d仍未下降。其中，rOmpA產(chǎn)生的抗體水平較高;rOmpP2產(chǎn)生的抗體水平較低，并且持續(xù)時間較短，在首免后28 d開始下降。由此可見，除rOmpP2外，其他重組蛋白質(zhì)均具有作為亞單位疫苗候選蛋白質(zhì)的潛力。

2.7抗重組蛋白質(zhì)抗體與溶血性曼氏桿菌全菌蛋白質(zhì)結(jié)合能力的評價

為了評價各重組蛋白質(zhì)免疫后產(chǎn)生的抗體能否與溶血性曼氏桿菌的菌體結(jié)合，從而具有潛在的免疫保護(hù)作用，以各重組蛋白質(zhì)免疫小鼠后的血清作為一抗、以制備的溶血性曼氏桿菌全菌蛋白質(zhì)作為包被抗原進(jìn)行ELISA檢測。由圖6可以看出，rOmpA、rPlpE、rPlpF免疫后誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體能與溶血性曼氏桿菌的全菌蛋白質(zhì)高效結(jié)合，抗體水平明顯高于陰性對照，并且在免疫后35 d仍能與全菌蛋白質(zhì)結(jié)合。由此可見，rOmpA、rPlpE、rPlpF可能具有潛在的免疫保護(hù)作用。

3討論

溶血性曼氏桿菌作為引起牛、羊等反芻動物呼吸道疾病的重要病原，給國內(nèi)外養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[11-13]，僅在北美地區(qū)，每年給肉牛養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失就高達(dá)數(shù)十億美元[14]，因此對該病進(jìn)行有效控制尤為緊迫。開發(fā)敏感的診斷工具和高效的疫苗是對該病進(jìn)行防控的重要措施[15]，目前國外使用的商品化疫苗僅能提供部分免疫保護(hù)[7]。因此，為了更好地對該病進(jìn)行防控，有必要對溶血性曼氏桿菌的免疫原分子進(jìn)行更全面的認(rèn)識，國內(nèi)外學(xué)者已進(jìn)行了一些相關(guān)研究。例如，2010年Ayalew等[16，9]通過免疫蛋白質(zhì)組學(xué)分析證實了55種可能具有免疫原性的溶血性曼氏桿菌的外膜蛋白質(zhì)，包括OmpA、OmpP2、LktA、PlpE等。其中，脂蛋白PlpE是最早發(fā)現(xiàn)于溶血性曼氏桿菌中的一種脂蛋白，Yalew等[17]通過對PlpE的研究發(fā)現(xiàn)，重組PlpE免疫牛后可誘導(dǎo)牛產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答，隨后他們用重組溶血性曼氏桿菌OmpA對牛進(jìn)行免疫，用補(bǔ)體介導(dǎo)的方式刺激機(jī)體產(chǎn)生了高抗體反應(yīng)[8]。Omaleki等[18]后來將PlpE與LktA進(jìn)行融合表達(dá)，結(jié)果表明，融合表達(dá)后免疫小鼠能夠使其產(chǎn)生良好的保護(hù)效果。為了進(jìn)一步評價溶血性曼氏桿菌中各重要功能蛋白質(zhì)在感染動物后的免疫原性，并篩選適合的免疫原蛋白質(zhì)，后續(xù)進(jìn)行血清學(xué)診斷方法的研究和新型疫苗的研制。本研究從綿羊源溶血性曼氏桿菌中對lktA、ompA、plpE、plpF、ompP2、gs60等6個基因進(jìn)行了克隆和原核表達(dá)，隨后評價了各蛋白質(zhì)的免疫原性及重組蛋白質(zhì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答水平。

建立血清學(xué)檢測方法的關(guān)鍵是所采用的抗原能否與大多數(shù)臨床感染血清反應(yīng)，并且能夠高效結(jié)合。為了篩選溶血性曼氏桿菌中適合作為診斷抗原的優(yōu)勢免疫原蛋白質(zhì)，本研究采用間接ELISA方法分析比較了6種免疫原與35份臨床感染陽性血清和3份陰性血清的結(jié)合反應(yīng)能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然所有6種蛋白質(zhì)均能不同程度地與臨床感染血清結(jié)合，但各自的結(jié)合能力有差別。其中rOmpA、rLktA、rGs60可與絕大多數(shù)感染動物血清反應(yīng)，且具有很強(qiáng)的結(jié)合能力，說明它們是優(yōu)勢免疫原，可以作為溶血性曼氏桿菌血清學(xué)診斷試劑開發(fā)的良好候選蛋白質(zhì)。但是，各蛋白質(zhì)作為診斷抗原的特異性還需要進(jìn)行進(jìn)一步的驗證。

開發(fā)新型亞單位疫苗是溶血性曼氏桿菌疫苗研發(fā)的重要方向。作為疫苗候選蛋白質(zhì)，必須在免疫后能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈和持續(xù)的免疫應(yīng)答。本研究采用制備的6種重組蛋白質(zhì)免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)所有重組蛋白質(zhì)均可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的體液抗體。其中，rLktA、rOmpA、rPlpE、rPlpF、rGs60免疫后產(chǎn)生的抗體水平高，且在試驗結(jié)束時（免疫后35 d）仍可保持較高水平，說明上述5種重組蛋白質(zhì)，特別是rOmpA具有作為亞單位疫苗候選蛋白質(zhì)的潛力。

本研究在優(yōu)勢免疫原篩選評價中rLktA能夠檢測出更多的陽性血清，是作為血清學(xué)診斷試劑開發(fā)的良好候選蛋白質(zhì)。然而，采用rLktA免疫小鼠后產(chǎn)生的特異性抗體與溶血性曼氏桿菌全菌蛋白質(zhì)的結(jié)合能力較弱，可能是由于白細(xì)胞毒素（LKT）在溶血性曼氏桿菌生長的對數(shù)期分泌于培養(yǎng)液的上清液中[19]，作為釋放于胞外的毒素蛋白質(zhì)，在全菌蛋白質(zhì)中其成分含量很低。因此，作為溶血性曼氏桿菌最為重要的毒力因子，在開發(fā)新型亞單位疫苗時，將OmpA、PlpE與LKT進(jìn)行融合表達(dá)將是重要的策略之一。

本研究對6個重要的溶血性曼氏桿菌免疫原蛋白質(zhì)的免疫原性及其重組蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答水平進(jìn)行了比較分析，為進(jìn)一步將這些蛋白質(zhì)作為抗原開發(fā)血清學(xué)診斷試劑和新型疫苗提供了重要的參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

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（責(zé)任編輯：徐艷）

收稿日期：2021-09-06

基金項目：四川省重點研發(fā)項目（2021YFN0008）;西南民族大學(xué)研究生創(chuàng)新項目（CX2020SZ57）

作者簡介：陸奕彤（1996-），女，遼寧錦州人，碩士研究生，研究方向為動物病原生物學(xué)。（E-mail）981489868@qq.com

通訊作者：楊發(fā)龍，（E-mail）yang.falong@swun.edu.cn