基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析愈創(chuàng)木酚對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌機(jī)制

張瑤　高弢　馬桂珍　史建榮

摘要：植物源酚類(lèi)化合物愈創(chuàng)木酚可以顯著抑制禾谷鐮刀菌的生長(zhǎng)，本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析愈創(chuàng)木酚對(duì)禾谷鐮刀菌的作用機(jī)制，采用RNA-Seq技術(shù)從轉(zhuǎn)錄組水平分析禾谷鐮刀菌在0.4 μl/ml愈創(chuàng)木酚脅迫下的響應(yīng)機(jī)制。結(jié)果顯示，共篩選到905個(gè)差異表達(dá)基因表達(dá)量發(fā)生了變化，其中表達(dá)量上調(diào)的基因?yàn)?64個(gè)，表達(dá)量下調(diào)的基因?yàn)?41個(gè)。差異表達(dá)基因的COG、GO及Pathway功能分析發(fā)現(xiàn)，愈創(chuàng)木酚影響禾谷鐮刀菌氧化應(yīng)激反應(yīng)、膜組分及離子運(yùn)輸途徑。表明，愈創(chuàng)木酚處理后，禾谷鐮刀菌的細(xì)胞膜完整性受到了破壞，Ca2+運(yùn)輸途徑受到破壞，同時(shí)愈創(chuàng)木酚作為抗氧化劑也能顯著影響禾谷鐮刀菌的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：禾谷鐮刀菌;愈創(chuàng)木酚;轉(zhuǎn)錄組;抑菌機(jī)制

中圖分類(lèi)號(hào)：Q946.887文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2022）02-0343-09

Analysis on the antifungal mechanism of Fusarium graminearum treated by guaiacol based on transcriptome sequencing

ZHANG Yao GAO Tao MA Gui-zhen SHI Jian-rong

[1.Jiangsu Ocean University， Lianyungang 222000， China;2.Institute of Food Safety and Nutrition， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Control Technology and Standard for Agro-Products Safety and Quality， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Key Lab of Agro-product Safety Risk Evaluation（Nanjing）， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Key Laboratory of Food Quality and Safety， Nanjing 210014， China]

Abstract：The plant derived phenolic compound guaiacol can significantly inhibit the growth of Fusarium graminearum. In this study， the action mechanism of guaiacol on F. graminearum was analyzed by transcriptome sequencing， and the response mechanism of F. graminearum under 0.4 μl/ml guaiacol stress was analyzed by RNA-Seq technique at transcriptome level. The results showed that， 905 differentially expressed genes （DEGs） were screened to be varied in expression quantity， of which 464 were up-regulated and 441 were down-regulated. Analysis on the function of COG， GO and pathway of DEGs showed that， guaiacol affected oxidative stress response， membrane components and ion transport pathways of F. graminearum. In conclusion， the integrity of the cell membrane and Ca2+ transport pathway of F. graminearum were damaged after treated with guaiacol， and guaiacol could also significantly affect the oxidative stress response of F. graminearum as an antioxidant.

Key words：Fusarium graminearum;guaiacol;transcriptome;antifungal mechanism

江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)2022年第38卷第2期

張瑤等：基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析愈創(chuàng)木酚對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌機(jī)制

主要由禾谷鐮刀菌復(fù)合種（Fusarium graminearum species complex）引起的小麥赤霉病是世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生的一種主要病害[1]。小麥赤霉病不僅會(huì)造成小麥產(chǎn)量降低，還會(huì)產(chǎn)生多種鐮刀菌毒素，嚴(yán)重影響小麥質(zhì)量安全，威脅人畜健康。篩選、培育和種植具有穩(wěn)定抗赤霉病和抗毒素積累的小麥品種是防控鐮刀菌危害最安全有效的措施之一，但目前尚未開(kāi)發(fā)出可以商業(yè)化種植的抗病品種。利用化學(xué)藥劑進(jìn)行防控是控制鐮刀菌毒素產(chǎn)生和累積的最有效的措施之一[2]。自20世紀(jì)70年代以來(lái)，中國(guó)使用的多菌靈等苯并咪唑類(lèi)和戊唑醇等三唑類(lèi)殺菌劑，在控制病害流行、穩(wěn)定小麥生產(chǎn)上發(fā)揮了重要作用[3]。但是，長(zhǎng)期單一使用化學(xué)農(nóng)藥導(dǎo)致中國(guó)長(zhǎng)江中下游部分小麥產(chǎn)區(qū)病原菌產(chǎn)生明顯的抗藥性[4]，嚴(yán)重威脅了環(huán)境生態(tài)健康。因此，探尋針對(duì)禾谷鐮刀菌的新型高效殺菌劑，已成為目前有效防治小麥赤霉病的關(guān)鍵突破口之一。

愈創(chuàng)木酚（2-甲氧基酚），別名甲基兒茶酚，是一種白色或微黃色結(jié)晶或無(wú)色至淡黃色透明油狀液體，在自然界中主要存在于愈創(chuàng)樹(shù)脂或松油中，也是木材干餾所得雜酚油中的主要成分[5]。愈創(chuàng)木酚在工業(yè)上用途廣泛，常用愈創(chuàng)木酚來(lái)生產(chǎn)各種香料，如丁香酚、香蘭素和人造麝香[6]。愈創(chuàng)木酚在醫(yī)藥上也有大量應(yīng)用，它可被用于合成苯磺酸愈創(chuàng)木酚（愈創(chuàng)木酚磺酸鉀）、用于制作局部麻醉劑或防腐劑[7]，還可用于制備祛痰口服液和治療消化不良[8]。目前，利用愈創(chuàng)木酚抑制植物病原菌方面的研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)，一些含有取代酚（丁香酚、百里香酚、卡瓦克酚和愈創(chuàng)木酚）的精油表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗菌和抗氧化作用[9]，而多種具有抑菌作用的植物提取物及木醋液中均含有大量的愈創(chuàng)木酚[10-12]。前期研究發(fā)現(xiàn)愈創(chuàng)木酚能夠抑制禾谷鐮刀菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)毒，但是抑菌機(jī)制尚不明確。本研究借助轉(zhuǎn)錄組測(cè)序手段初步分析愈創(chuàng)木酚對(duì)禾谷鐮刀菌的殺菌作用及其抑菌機(jī)制，為禾谷鐮刀菌的防治提供新思路，為開(kāi)發(fā)新的、具有優(yōu)良防效的植物源農(nóng)藥提供應(yīng)用基礎(chǔ)。

轉(zhuǎn)錄組，是指特定生長(zhǎng)階段某組織或細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，主要包括mRNA和非編碼RNA（ncRNA）[13]。利用新一代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序RNA-Seq （RNA-sequencing）分析愈創(chuàng)木酚處理后的禾谷鐮刀菌轉(zhuǎn)錄組的變化，篩選鑒定差異基因，并通過(guò)GO功能和KEGG途徑注釋分析，探究禾谷鐮刀菌響應(yīng)愈創(chuàng)木酚脅迫的關(guān)鍵基因，可為后續(xù)闡明愈創(chuàng)木酚作用機(jī)制的基因組學(xué)研究提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試菌株為禾谷鐮刀菌標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)H-1;供試藥劑為99%愈創(chuàng)木酚（Macklin），4 ℃保存?zhèn)溆?。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L。YEPD培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g/L，酵母粉 3 g/L，胰蛋白胨10 g/L，調(diào)pH至7.0，高溫高壓滅菌后常溫保存。PrimeScript TM RT反轉(zhuǎn)試劑盒 （寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，貨號(hào)：DRR036A）用于RNA反轉(zhuǎn)成cDNA;TB Green TM Premix Ex TaqTM Ⅱ（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，貨號(hào)：DRR820A）用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1禾谷鐮刀菌菌絲處理與RNA提取收集禾谷鐮刀菌分生孢子（1 ml 105個(gè)）接種至YEPD培養(yǎng)基中，25 ℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，加入愈創(chuàng)木酚提取液使其終濃度為0.4 μl/ml，以不加愈創(chuàng)木酚為對(duì)照組，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)24 h后收集菌絲并凍干研磨成粉末。使用TRIzol 試劑從組織中提取總RNA，并使用DNA酶（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，貨號(hào)：2270A）去除基因組DNA。

1.2.2構(gòu)建文庫(kù)及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序提取樣品的總RNA送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。首先使用fastx_toolkit_0.0.14軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)的相關(guān)質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，包括堿基質(zhì)量分布統(tǒng)計(jì)、堿基錯(cuò)誤率分布統(tǒng)計(jì)和堿基（A、T、G、C）含量分布統(tǒng)計(jì);隨后，使用SeqPrep和Sickle軟件對(duì)測(cè)序接頭序列、低質(zhì)量讀段、不確定堿基信息率較高序列及長(zhǎng)度過(guò)短序列進(jìn)行去除，獲得質(zhì)控后的原始數(shù)據(jù)，即clean data（reads），利用TopHat2和HISAT2將clean reads與參考基因組Fusarium_graminearum （GCF_000240135.3）進(jìn)行比對(duì)，獲得用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄本組裝、表達(dá)量計(jì)算等的 mapped data（reads），同時(shí)對(duì)該轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。使用StringTie或Cufflinks軟件對(duì)Mapped Reads進(jìn)行拼接和組裝。

1.2.3差異表達(dá)基因分析及功能分析將轉(zhuǎn)錄組組裝獲得的所有基因和轉(zhuǎn)錄本在六大數(shù)據(jù)庫(kù)（NR、Swiss-Prot、Pfam、EggNOG、GO和KEGG）中進(jìn)行比對(duì)分析，獲得基因和轉(zhuǎn)錄本的功能信息。通過(guò)與NR數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，可以查看轉(zhuǎn)錄本序列與相近物種的相似情況，以及同源序列的功能信息;通過(guò)與Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，可以了解轉(zhuǎn)錄本注釋中蛋白質(zhì)的功能、轉(zhuǎn)錄后修飾、特殊位點(diǎn)和區(qū)域、二級(jí)結(jié)構(gòu)、四級(jí)結(jié)構(gòu)。通過(guò)Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)可以對(duì)組裝出來(lái)的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行蛋白質(zhì)家族的注釋;EggNOG提供了更細(xì)致的OG分析，可以根據(jù)物種所屬的進(jìn)化分支選擇參考數(shù)據(jù)集;利用GO數(shù)據(jù)庫(kù)可以獲得轉(zhuǎn)錄本的功能分類(lèi)情況;通過(guò)與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，獲得基因或轉(zhuǎn)錄本可能參與的具體生物學(xué)通路情況。使用RSEM、Kallisto和Salmon軟件對(duì)基因的表達(dá)量進(jìn)行定量分析，隨后根據(jù)基因/轉(zhuǎn)錄本在不同樣本間的表達(dá)情況，對(duì)樣本間共有與特有表達(dá)基因/轉(zhuǎn)錄本（venn分析）、相關(guān)性和主成分（PC）進(jìn)行分析。

在獲得基因/轉(zhuǎn)錄本的Read Counts數(shù)后，采用DESeq2、DEGseq或edgeR 軟件，對(duì)多樣本項(xiàng)目進(jìn)行樣本間或組間基因/轉(zhuǎn)錄本差異表達(dá)分析，鑒定出差異表達(dá)的基因/轉(zhuǎn)錄本。在EggNOG、GO和KEGG 3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分類(lèi)分析，隨后利用Goatools軟件進(jìn)行GO富集分析，從而分析獲得的顯著差異表達(dá)基因主要具有哪些GO功能，分析方法為Fisher精確檢驗(yàn)，當(dāng)經(jīng)過(guò)校正的P值<0.05時(shí)，認(rèn)為此GO功能存在顯著富集情況;采用R腳本對(duì)差異富集基因/轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行KEGG Pathway富集分析，計(jì)算原理同GO功能富集分析，當(dāng)經(jīng)過(guò)校正的P值<0.05時(shí)，認(rèn)為此KEGG Pathway功能存在顯著富集情況。

1.2.4熒光定量PCR驗(yàn)證分別提取愈創(chuàng)木酚處理和對(duì)照組的禾谷鐮刀菌RNA，并反轉(zhuǎn)為 cDNA，反應(yīng)程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存?？傮w系10.0 μl：2.0 μl 5×PrimeScriptTM Buffer，0.5 μl PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I，0.5 μl Oligo dT Primer （50 μmol/L），0.5 μl Random 6 mers （100 μmol/L），2.0 μl total RNA，4.5 μl RNase Free dH2O。以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序：96 ℃預(yù)變性120 s;94 ℃變性5 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，45個(gè)循環(huán)。融合階段：94 ℃變性20 s; 56 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s?？傮w系25.0 μl：12.5 μl TB Green Premix Ex Taq，1.0 μl PCR Forward Primer，1.0 μl PCR Reverse Primer，2.0 μl cDNA;8.5 μl dH2O。反應(yīng)所用引物見(jiàn)表1。獲得的所有數(shù)據(jù)參照GAPDH基因（編號(hào)：FGSG_06257.1）進(jìn)行校準(zhǔn)，目的基因的相對(duì)表達(dá)水平利用LightCycler 96 SW 1.1分析軟件生成。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

2結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

試驗(yàn)設(shè)置對(duì)照（CK）和愈創(chuàng)木酚處理（Gua），各有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，建立了6個(gè)cDNA文庫(kù)。經(jīng)過(guò)測(cè)序后，禾谷鐮刀菌在對(duì)照、愈創(chuàng)木酚處理下的平均Clean reads分別為42 887 328和45 133 555，Q20（測(cè)序質(zhì)量在99.0%以上的堿基占總堿基的比例）分別平均達(dá)到98.86%和98.59%，Q30（測(cè)序質(zhì)量在99.9%以上的堿基占總堿基的比例）分別平均達(dá)到94.18%和93.94%，G+C平均含量分別為52.63%、52.76%。以上結(jié)果說(shuō)明，本次測(cè)序所得cDNA文庫(kù)質(zhì)量高，可以進(jìn)行后續(xù)生物信息學(xué)的進(jìn)一步研究。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

2.2轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量差異分析

共檢測(cè)到表達(dá)基因12 611個(gè)，其中已知基因12 000個(gè)，新基因611個(gè)。分析對(duì)照組的樣品和處理組的基因表達(dá)量，默認(rèn)參數(shù)為：P<0.05 & |log2FC|≥1（FC表示2個(gè)樣品間基因表達(dá)量的比值）。愈創(chuàng)木酚處理禾谷鐮刀菌后，共有905個(gè)基因表達(dá)量發(fā)生了變化（圖1），其中表達(dá)量上調(diào)的基因?yàn)?64個(gè)，表達(dá)量下調(diào)的基因?yàn)?41個(gè)（圖1A）。表達(dá)差異倍數(shù)大于5的基因有65個(gè)，占比7.18%，其中表達(dá)量上調(diào)的基因23個(gè)，表達(dá)量下調(diào)的基因42個(gè);表達(dá)差異倍數(shù)小于5的基因占比92.82%，其中表達(dá)差異倍數(shù)在1～2倍的基因有378個(gè)，表達(dá)差異倍數(shù)在2～5倍的基因有462個(gè)，表達(dá)量上調(diào)的基因210個(gè)，表達(dá)量下調(diào)的基因252個(gè)。

2.3轉(zhuǎn)錄組的COG注釋

對(duì)愈創(chuàng)木酚處理后的差異表達(dá)基因進(jìn)行COG功能分析，差異表達(dá)基因共參與了25個(gè)代謝過(guò)程。如圖2所示，除去652個(gè)功能不明的差異表達(dá)基因，其余差異表達(dá)基因中39個(gè)與翻譯后修飾、蛋白質(zhì)翻轉(zhuǎn)、伴侶相關(guān)，35個(gè)與碳水化合物的代謝運(yùn)輸相關(guān)，30個(gè)與RNA的轉(zhuǎn)錄相關(guān)。

2.4差異表達(dá)基因的GO功能富集分析

對(duì)愈創(chuàng)木酚處理后的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋分析，將差異表達(dá)基因分為參與的生物學(xué)過(guò)程、構(gòu)成細(xì)胞的組分、實(shí)現(xiàn)的分子功能三大類(lèi)。結(jié)果如圖3所示，共有706個(gè)差異表達(dá)基因?qū)儆谏飳W(xué)功能類(lèi)，其中有285個(gè)差異表達(dá)基因?yàn)榇x過(guò)程相關(guān)基因;共有681個(gè)差異表達(dá)基因?qū)儆跇?gòu)成細(xì)胞的組分，其中有252個(gè)差異表達(dá)基因?qū)儆谀そM分相關(guān)基因;共有609個(gè)差異表達(dá)基因?qū)儆趯?shí)現(xiàn)的分子功能類(lèi)，其中有294個(gè)差異表達(dá)基因?yàn)榇呋钚韵嚓P(guān)基因。

對(duì)注釋完的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析，在差異顯著（P<0.05） 的前提下總結(jié)基因差異富集度排名前20位的基因功能，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要富集在氧化還原相關(guān)生物進(jìn)程、膜整體組成成分以及離子運(yùn)輸途徑等（圖4）。表明愈創(chuàng)木酚能夠影響禾谷鐮刀菌代謝過(guò)程，使細(xì)胞膜組分發(fā)生變化。

2.5差異表達(dá)基因的KEGG Pathway富集分析

將愈創(chuàng)木酚處理后的差異表達(dá)基因按照參與的通路或行使的功能進(jìn)行分類(lèi)，結(jié)果如圖5所示。上調(diào)表達(dá)基因的功能主要為新陳代謝途徑中的氨基酸代謝途徑、碳水化合物代謝途徑及能量代謝途徑，遺傳信息處理途徑中的折疊、分類(lèi)和降解途徑，細(xì)胞過(guò)程途徑中的運(yùn)輸和分解代謝途徑;下調(diào)表達(dá)基因的功能主要為新陳代謝途徑中的碳水化合物代謝途徑和脂質(zhì)代謝途徑。

采用R腳本對(duì)獲得的差異表達(dá)基因/轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行KEGG Pathway富集分析，按P<0.05的前提下顯示顯著的富集結(jié)果，P值越小表示越顯著。主要富集途徑如表3所示，差異表達(dá)基因主要富集在新陳代謝途徑的氮代謝通路和谷胱甘肽代謝通路中。

2.6差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中表達(dá)量差異倍數(shù)為5倍以上的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選分析，除去功能未知的蛋白質(zhì)后，選取另外14個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，基因編號(hào)及表達(dá)量上調(diào)、下調(diào)結(jié)果見(jiàn)表4和圖6。這14個(gè)基因在愈創(chuàng)木酚處理后發(fā)生不同程度的表達(dá)。與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相比，除FGSG_05882表達(dá)量由下調(diào)變?yōu)樯险{(diào)外，其余基因的表達(dá)量變化趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果相符，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的分析結(jié)果是可靠的。

2.7Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)量分析

有研究發(fā)現(xiàn)，作為當(dāng)歸的有效活性成分，愈創(chuàng)木酚已被證實(shí)可以通過(guò)抑制破骨細(xì)胞中NF-κB、MAPK和AKT信號(hào)通路，抑制Ca2+外排，引起胞內(nèi)Ca2+紊亂，影響破骨細(xì)胞的形成，最終達(dá)到治療骨質(zhì)疏松等疾病的目的[14]。在本研究中亦發(fā)現(xiàn)愈創(chuàng)木酚處理后Ca2+-ATPase 3（PMCA3）基因表達(dá)量顯著下調(diào)，對(duì)測(cè)序結(jié)果中PMCA相關(guān)基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)

0.4 μl/ml愈創(chuàng)木酚處理禾谷鐮刀菌后4個(gè)PMCA基因均表現(xiàn)為下調(diào)（表5）。利用qRT-PCR驗(yàn)證不同濃度愈創(chuàng)木酚處理后4個(gè)PMCA基因的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)愈創(chuàng)木酚不同程度地抑制了這4個(gè)基因的表達(dá)，其中PMCA1基因（FGSG_00508）和2個(gè)PMCA3基因（FGSG_08985、FGSG_04919）的表達(dá)量整體上隨著藥劑處理濃度的升高而逐漸降低;另一個(gè) PMCA3基因（FGSG_04245）在低濃度處理下表達(dá)量顯著提高，隨后又逐漸降低（圖7）。

3討論

近年來(lái)，通過(guò)比較藥劑處理后基因表達(dá)差異情況可以分析藥劑的潛在作用途徑。已有研究結(jié)果表明，以愈創(chuàng)木酚為主要成分的各種木醋液對(duì)多種病原真菌均表現(xiàn)出一定的抑菌作用[15]，但愈創(chuàng)木酚的作用機(jī)制尚不明確。本研究利用RNA-seq技術(shù)研究愈創(chuàng)木酚處理后禾谷鐮刀菌基因表達(dá)的差異，旨在探尋愈創(chuàng)木酚的有效作用途徑，為今后開(kāi)發(fā)以愈創(chuàng)木酚為主要成分的禾谷鐮刀菌殺菌劑提供理論依據(jù)。

測(cè)序結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)藥劑處理后有905個(gè)基因表達(dá)量發(fā)生變化，其中表達(dá)差異倍數(shù)大于5的基因有65個(gè)，上調(diào)表達(dá)基因23個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因42個(gè)，表明藥劑處理后表達(dá)量變化較大的基因變化趨勢(shì)以下調(diào)表達(dá)為主。已有研究結(jié)果表明，作為木質(zhì)素生物油主要成分的愈創(chuàng)木酚具有很好的還原能力和自由基清除能力[16]。同時(shí)在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)方面，愈創(chuàng)木酚作為植物營(yíng)養(yǎng)素的主要成分，可以清除活性氧，調(diào)節(jié)植物體氧化應(yīng)激反應(yīng)[17]，愈創(chuàng)木酚亦作為牙科常用藥物被驗(yàn)證具有較強(qiáng)的抗氧化作用[18]。在生物體中，谷胱甘肽的代謝途徑與氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)，可以還原細(xì)胞內(nèi)的活性氧自由基，生成氧化型谷胱甘肽來(lái)行使抗氧化的功能[19-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，愈創(chuàng)木酚處理禾谷鐮刀菌后，差異表達(dá)基因的GO功能主要富集在氧化還原相關(guān)生物進(jìn)程上，Pathway 途徑主要富集在谷胱甘肽代謝途徑上，表明愈創(chuàng)木酚能夠顯著影響禾谷鐮刀菌的氧化應(yīng)激反應(yīng)途徑。

一般的植物源酚類(lèi)化合物均具備較強(qiáng)的疏水性，可以通過(guò)破壞細(xì)胞膜的完整性進(jìn)而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)[23]，而當(dāng)真菌受到外來(lái)藥物作用時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白又可以將有毒有害物質(zhì)運(yùn)輸至細(xì)胞外，保護(hù)真菌細(xì)胞的生長(zhǎng)[24]。因此，用愈創(chuàng)木酚處理禾谷鐮刀菌后，細(xì)胞膜組分及細(xì)胞運(yùn)輸相關(guān)的差異表達(dá)基因數(shù)量較多，且膜本體基因表達(dá)量顯著下調(diào)，推測(cè)愈創(chuàng)木酚破壞了禾谷鐮刀菌細(xì)胞膜的完整性，影響病原菌的生長(zhǎng)。差異表達(dá)基因GO功能富集分析結(jié)果表明，愈創(chuàng)木酚處理禾谷鐮刀菌后離子運(yùn)輸相關(guān)的差異表達(dá)基因較多，同時(shí)對(duì)表達(dá)差異基因進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)亦發(fā)現(xiàn)Ca2+-ATPase3基因（FGSG_04919）在藥劑處理后表達(dá)量顯著下調(diào)。在真菌細(xì)胞中，Ca2+作為第二信使影響了真菌的生長(zhǎng)、細(xì)胞器的定位等一系列過(guò)程[25]。細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度不平衡會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞器內(nèi)環(huán)境紊亂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會(huì)出現(xiàn)蛋白質(zhì)合成問(wèn)題，而囊泡則會(huì)出現(xiàn)蛋白質(zhì)降解問(wèn)題，這些問(wèn)題都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[26]。真菌細(xì)胞中影響鈣離子運(yùn)輸?shù)闹饕槟ど系拟}離子運(yùn)輸ATP酶（PMCA）相關(guān)基因[27]，對(duì)不同濃度愈創(chuàng)木酚處理后的禾谷鐮刀菌的4個(gè)PMCA基因進(jìn)行qRT-PCR分析驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高濃度愈創(chuàng)木酚顯著抑制此類(lèi)基因的表達(dá)，由此推測(cè)愈創(chuàng)酚處理后PMCA基因表達(dá)量的下調(diào)破壞了細(xì)胞內(nèi)Ca2+的平衡，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡，影響病原菌的生長(zhǎng)。

本研究中，我們?cè)谵D(zhuǎn)錄組水平上研究了愈創(chuàng)木酚對(duì)禾谷鐮刀菌的作用機(jī)制，結(jié)果表明，愈創(chuàng)木酚能夠通過(guò)影響禾谷鐮刀菌的氧化應(yīng)激反應(yīng)途徑、破壞細(xì)胞膜的完整性以及破壞細(xì)胞內(nèi)Ca2+的穩(wěn)態(tài)等方式來(lái)影響病原菌的生長(zhǎng)，研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示愈創(chuàng)木酚作用的分子機(jī)制、挖掘作用靶標(biāo)提供了參考。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）

收稿日期：2021-05-26

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2018YFE0206000）;國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31901936）

作者簡(jiǎn)介：張瑤 （1997-），女，江蘇連云港人，碩士研究生，主要從事食品加工與安全方面的研究。（E-mail）1912682939@qq.com

通訊作者：馬桂珍， （E-mail）guizhenma@sohu.com;史建榮， （Tel）025-84392001，（E-mail）shiji@ jaas.ac.cn