響應(yīng)面法優(yōu)化玉米浸液蛋白提取工藝及單細胞蛋白發(fā)酵的研究

駱楊慶，吳增林，李升福，張俊杰，段 蕊,

（1.江蘇海洋大學食品科學與工程學院，江蘇連云港 222005；2.連云港環(huán)?；び邢薰?，江蘇連云港 222066；3.羅蓋特（中國）營養(yǎng)食品有限公司，江蘇連云港 222005；4.江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室，江蘇連云港 222005）

玉米浸液是玉米深加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物[1]，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如可溶性蛋白質(zhì)、游離脂肪酸、可溶性糖類和維生素等[2]。目前玉米浸液用途單一，一般經(jīng)過濃縮后作為工業(yè)發(fā)酵的氮源使用，沒有充分體現(xiàn)其營養(yǎng)價值[3]。近幾年，學者做了關(guān)于玉米浸液用途的研究。利用玉米浸液為原料，通過樹脂吸附、離心分離去除雜質(zhì)，采用兩次加堿法生產(chǎn)醫(yī)用植酸鈣，提高了玉米浸液的附加值[4]。用玉米浸液生產(chǎn)植物蛋白調(diào)味液[5?7]。高健等研究了玉米蛋白雙酶水解產(chǎn)物的體外脾淋巴細胞增殖活性[8]。Gudina Eduardo J和Danyelle Khadydja F等以玉米浸液為原料，用芽孢桿菌、酵母菌生產(chǎn)表面活性劑[9?10]。李小雨等以玉米浸液和廢糖蜜為原料，用混合酵母菌生產(chǎn)單細胞蛋白[11]。Lin等用玉米皮渣的酸水解液為主要原料，加入適量玉米浸液及無機鹽，通過發(fā)酵生產(chǎn)藥用單細胞蛋白[12]。玉米浸液中含有40%蛋白質(zhì)，可以作為優(yōu)質(zhì)的蛋白來源。2020年國內(nèi)消耗2.9億噸玉米，產(chǎn)生上億噸的玉米浸液，如將該部分蛋白質(zhì)充分利用，開發(fā)具有附加值產(chǎn)品，可進一步增加玉米加工企業(yè)的經(jīng)濟效益[13]。

本文用等電點法[14]提取玉米浸液中的蛋白質(zhì)，并以釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵提取蛋白質(zhì)后的上清液，生產(chǎn)單細胞蛋白。通過單因素實驗、響應(yīng)面試驗確定等電點法提取蛋白質(zhì)的工藝參數(shù)，并研究了用釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵離心上清液生產(chǎn)單細胞蛋白的條件。以期進一步開發(fā)利用玉米浸液，使其營養(yǎng)成分得到更加廣泛的應(yīng)用，促進我國玉米深加工的發(fā)展[15]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米浸液 羅蓋特（中國）營養(yǎng)食品有限公司；產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis） 中國普通微生物菌種保藏管理中心；釀酒酵母（Saccharomyces cereviae） 安琪酵母股份有限公司；蛋白胨、酵母膏 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；其它常規(guī)試劑 國藥集團化學試劑有限公司。

YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司；BM-1000生物顯微鏡 南京江南永新光學有限公司；754N紫外可見分光光度計 上海奧譜勒儀器有限公司；CP313電子精密天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；D-37520冷凍離心機 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；TC-2102C振蕩培養(yǎng)箱 上海?，斣O(shè)備有限公司；PB-10 pH計 上海精密科學儀器有限公司；磁力攪拌器 丹瑞儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 等電點法提取玉米浸液蛋白工藝

取適量玉米浸液，用NaOH調(diào)節(jié)pH，在一定溫度下靜置一段時間，采用離心機以轉(zhuǎn)速5000 r/min、離心時間20 min分離粗蛋白及離心上清液，通過雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量并計算粗蛋白提取率。以離心上清液培養(yǎng)釀酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母，生產(chǎn)單細胞蛋白。

1.2.1.1 提取pH試驗單因素設(shè)計 參照李曉明、孫小斐等[16?17]的方法并作適當修改。取80 mL玉米浸液，用10 mol/L NaOH溶液將其pH分別調(diào)至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，15 ℃靜置15 min。采用離心機5000 r/min、20 min分離粗蛋白，通過雙縮脲法分別檢測玉米浸液、離心上清液的蛋白質(zhì)含量，依據(jù)粗蛋白提取率確定最佳提取pH。

1.2.1.2 提取溫度試驗單因素設(shè)計 取80 mL玉米浸液，用10 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)玉米浸液pH為7.0，分別于5、15、30、45、60 ℃下靜置15 min。采用離心機5000 r/min、20 min分離粗蛋白，通過雙縮脲法分別檢測玉米浸液、離心上清液的蛋白質(zhì)含量，依據(jù)粗蛋白提取率確定最佳提取溫度。

1.2.1.3 提取時間試驗單因素設(shè)計 取80 mL玉米浸液，用10 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)玉米浸液pH至7.0，15 ℃分別靜置5、10、15、20、25、30 min。離心測定蛋白質(zhì)含量，確定最佳提取時間。

1.2.1.4 等電點法提取玉米浸液蛋白工藝優(yōu)化響應(yīng)面設(shè)計 使用Design Expert 8.0.6軟件進行響應(yīng)面設(shè)計。以pH、提取溫度、提取時間3個考察因素及其變化水平設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面方案，試驗因素設(shè)計如表1[18?20]。

表1 響應(yīng)面設(shè)計因子水平表Table 1 Factors and levels of the response surface analysis

1.2.1.5 粗蛋白提取率的計算 取適量玉米浸液、離心上清液樣品，以1:4的比例加入雙縮脲試劑，混勻后置于25 ℃水浴鍋發(fā)色30 min，用紫外分光光度計在波長為560 nm處測定其吸光值，通過牛血清蛋白標準曲線計算出玉米浸液中的蛋白質(zhì)量C1、離心上清液中的蛋白質(zhì)量C2，并以下列公式計算粗蛋白的提取率W。

式中：W表示粗蛋白提取率，%；C1表示玉米浸液中的蛋白質(zhì)量，g；C2表示離心上清液中的蛋白質(zhì)量，g。

1.2.2 單細胞蛋白發(fā)酵工藝

1.2.2.1 種子培養(yǎng)液制備 制備酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（YPD培養(yǎng)基）：酵母膏1.0%、蛋白胨2.0%、葡萄糖2.0%、瓊脂1.5%，pH6.8。將2 g葡萄糖溶于100 mL蒸餾水中，分別向溶液中加入1 g釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母，放入30 ℃的水浴鍋中活化30 min，并在YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑選菌落大、菌體壯的純酵母制成種子培養(yǎng)液供發(fā)酵使用。

1.2.2.2 上清液中干物質(zhì)濃度對發(fā)酵的影響 參照裴璞花、劉延波等[21?22]的方法并作適當修改。將離心后的上清液干物質(zhì)濃度分別配制成5%、8%、10%，調(diào)pH至6.5，分別接種10%的釀酒酵母菌種、產(chǎn)朊假絲酵母菌種，置于震蕩培養(yǎng)箱中，在溫度29 ℃、轉(zhuǎn)速160 r/min下培養(yǎng)24 h，依據(jù)平板計數(shù)法得出菌落數(shù)量，確定最佳上清液的發(fā)酵濃度。

1.2.2.3 葡萄糖添加量對發(fā)酵的影響 將干物質(zhì)濃度為10%的離心上清液pH調(diào)至6.5，分別接種10%釀酒酵母菌種、產(chǎn)朊假絲酵母菌種，并以添加量0、0.5%、1%、1.5%加入葡萄糖，在溫度29 ℃、轉(zhuǎn)速160 r/min下培養(yǎng)24 h，依據(jù)平板計數(shù)法得出菌落數(shù)量，確定最佳葡萄糖添加量。

1.2.2.4 pH對發(fā)酵的影響 將干物質(zhì)濃度為10%的離心上清液，pH分別調(diào)至5.0、5.5、6.0、6.5，并接種10%釀酒酵母菌種、產(chǎn)朊假絲酵母菌種，在溫度29 ℃、轉(zhuǎn)速160 r/min下培養(yǎng)24 h，依據(jù)平板計數(shù)法得出菌落數(shù)量，確定最佳發(fā)酵pH。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗每次數(shù)據(jù)重復(fù)3次，取平均值，用Microsoft Excel進行數(shù)據(jù)圖表處理，用SPSS 23.0軟件進行顯著性分析，用Design Expert 8.0.6進行響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)分析[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 等電點法提取玉米浸液蛋白工藝研究結(jié)果

2.1.1 pH對蛋白提取率的影響 玉米浸液的pH對蛋白質(zhì)提取有重要影響，蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)，在酸性、堿性條件下，其表面的帶電性質(zhì)增強了其溶解性，當溶液達到其等電點時，溶液呈電中性，分子間的斥力消除，蛋白質(zhì)分子慢慢結(jié)合成大分子，形成沉淀[13,24]。蛋白質(zhì)在不同pH下的提取率如圖1所示，當pH由5.5上升至7.5時，蛋白質(zhì)提取率顯著上升（P<0.05），這是因為溶液慢慢接近其等電點，蛋白質(zhì)分子間的氫鍵被打破，促進了蛋白質(zhì)分子的溶出，形成大分子沉淀[25]；當pH為7.5時，蛋白提取率達到72.4%；但是隨著pH由7.5上升至9.0，蛋白質(zhì)的提取率差異不顯著（P>0.05），這是因為pH7.5時，大部分蛋白質(zhì)已經(jīng)形成大分子沉淀，當溶液pH超過蛋白質(zhì)的等電點后，溶液中剩余的蛋白質(zhì)重新帶電，出現(xiàn)斥力[26?27]。因此，初步判定玉米浸液的等電點為7.5。

圖1 不同pH條件下玉米浸液中蛋白提取率Fig.1 Protein extraction rate of corn steep liquor under different pH

2.1.2 溫度對蛋白提取率的影響 蛋白質(zhì)在熱變性過程中，吸收熱量時由一個有序狀態(tài)變成無序狀態(tài)，蛋白質(zhì)變性是它的構(gòu)象以任何方式的改變（二級、三級或四級），它并不伴隨著一級結(jié)構(gòu)中肽鍵的斷裂而改變。熱是引起蛋白質(zhì)變性最普通的物理因素[15,28]。由圖2可知，提取溫度在15到30 ℃范圍時，粗蛋白提取率顯著上升（P<0.05），這是因為適當?shù)臏囟扔欣谟衩捉褐械鞍踪|(zhì)沉淀。當溫度高于45 ℃時，玉米浸液中的蛋白質(zhì)發(fā)生變性，提取率下降[29]。因此，初步判定提取溫度為30 ℃。

圖2 不同溫度條件下玉米浸液中蛋白提取率Fig.2 Protein extraction rate of corn steep liquor under different temperature

2.1.3 靜置時間對蛋白提取率的影響 由圖3可以看出，蛋白質(zhì)提取率隨著靜置時間呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當靜置時間為5～20 min之間時，蛋白質(zhì)提取率隨靜置時間的升高顯著上升（P<0.05）。分析原因可能是液堿與蛋白質(zhì)接觸需要一定時間才能使蛋白質(zhì)逐步沉淀，時間過短液堿與蛋白質(zhì)接觸不充分，蛋白沉淀效果不好。而隨著靜置時間繼續(xù)增長時，提取率呈現(xiàn)下降趨勢，這可能是由于在該pH條件下，部分蛋白質(zhì)沒有達到等電點，隨著時間增長，分子間的斥力增加[15]。根據(jù)圖3判定最佳的提取時間為20 min。

圖3 不同靜置時間玉米浸液中蛋白提取率Fig.3 Protein extraction rate of corn steep liquor under different standing time

2.1.4 等電點法提取玉米浸液蛋白工藝優(yōu)化響應(yīng)面設(shè)計結(jié)果 以pH、提取溫度、提取時間為變量，以粗蛋白提取率為響應(yīng)值，設(shè)計響應(yīng)面分析試驗，試驗結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 2 Response surface test results

表3 響應(yīng)面方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance results of response surface test

用Design Expert 8.0.6軟件對表2中的相應(yīng)值進行多元二次分析，得到粗蛋白提取率的回歸模型方程如下：

該方程的R2為99.42%，模型達到顯著水平（P<0.0001），失擬項不顯著，表明該模型擬合性能良好、方法可靠[30]。模型的R2=99.42%，說明響應(yīng)值變化的99.42%與選擇的變量相關(guān)，模型校正決定系數(shù)R2Adj=0.9866，表明此回歸方程可以表示響應(yīng)值變化具有可行性[31]。

根據(jù)以上回歸方程繪制響應(yīng)面交互作用曲面圖，研究pH、提取溫度、提取時間三個因素對粗蛋白提取率的影響，響應(yīng)面如圖4～圖6。

圖4 pH和提取溫度對粗蛋白提取率的交互影響Fig.4 Interactive effects of pH and extraction temperature on the extraction rate of crude protein

圖5 pH和提取時間對粗蛋白提取率的交互影響Fig.5 Interactive effects of pH and extraction time on the extraction rate of crude protein

圖6 提取溫度和提取時間對粗蛋白提取率的交互影響Fig.6 Interactive effects of extraction temperature and time on the extraction rate of crude protein

pH、提取溫度、提取時間對粗蛋白提取率的影響趨勢可以通過圖4～圖6直接得出，pH對粗蛋白提取率的影響較大，表現(xiàn)為曲線較陡；提取溫度、提取時間對粗蛋白提取反映率的影響較小，表現(xiàn)為曲線相對平滑。通過軟件分析，確定等電點法提取玉米浸液蛋白工藝的最佳提取條件：pH為7.6、提取溫度為26.4 ℃、提取時間為20 min，在此條件下粗蛋白提取率為77.8%。驗證試驗得到的粗蛋白提取率為77.5%，這與模型預(yù)測值的相對偏差為0.39%，說明該模型的提取條件可以反映粗蛋白提取率，具有較好的實際應(yīng)用價值。

2.2 單細胞蛋白發(fā)酵試驗研究結(jié)果

2.2.1 種子培養(yǎng)基 圖7是經(jīng)過活化、平板涂布及三區(qū)劃線得到的釀酒酵母與產(chǎn)朊假絲酵母菌種形態(tài)。釀酒酵母菌落圓潤飽滿，表面光滑、濕潤、黏稠，質(zhì)地均勻柔軟，邊緣與中央部位的顏色較一致，為乳白色，有酒香味；產(chǎn)朊假絲酵母的菌落呈灰奶油色，半暗，軟而平滑，符合酵母菌的特征[32]。

圖7 釀酒酵母與產(chǎn)朊假絲酵母三區(qū)劃線Fig.7 Zone marking of Saccharomyces cerevisiae and Candida utilis

2.2.2 上清液濃度對發(fā)酵的影響 用釀酒酵母與產(chǎn)朊假絲酵母對不同干物質(zhì)濃度的離心上清液進行發(fā)酵培養(yǎng)。由圖8可知，離心上清液干物質(zhì)濃度為5%、8%時，釀酒酵母發(fā)酵得到的菌落數(shù)量不顯著（P>0.05）；干物質(zhì)濃度為8%時，釀酒酵母發(fā)酵得到的菌落數(shù)為7.5×107CFU/mL；干物質(zhì)濃度為10%時，釀酒酵母發(fā)酵得到的菌落數(shù)量下降顯著（P<0.05），為5.8×107CFU/mL。離心上清液干物質(zhì)濃度由5%增加至8%時，產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵得到的菌落數(shù)量上升顯著（P<0.05），干物質(zhì)濃度為5%時得到的菌落數(shù)為1.24×108CFU/mL，濃度為8%時得到的菌落數(shù)為1.93×108CFU/mL。對比數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)朊假絲酵母的菌落數(shù)量比釀酒酵母的菌落數(shù)量多，這是由于產(chǎn)朊假絲酵母能夠同化六碳糖、五碳糖，能夠耐受高濃度的SO2，菌體中含有大量的蛋白質(zhì), 并含有大量賴氨酸和較多的維生素及多種微量元素[33]。釀酒酵母的蛋白質(zhì)含量高, 發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生醇、醛、酸、酯等風味物質(zhì)，賦予飼料特殊的酸甜、香味, 但是釀酒酵母不耐亞硫酸鹽，微量SO2即可阻礙其生長[34]。兩種酵母中產(chǎn)朊假絲酵母優(yōu)于釀酒酵母。離心上清液干物質(zhì)濃度為8%時，產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵得到的菌落數(shù)量最大，故選干物質(zhì)濃度為8%的離心上清液進行發(fā)酵。

圖8 兩種酵母對不同上清液濃度的發(fā)酵效果Fig.8 Fermentation effects of two yeasts on different supernatant concentrations

2.2.3 不同葡萄糖添加量對發(fā)酵的影響 由圖9可知，隨著葡萄糖添加量增加，釀酒酵母發(fā)酵得到的菌落數(shù)量顯著增加（P<0.05），當葡萄糖添加量為1.5%時，釀酒酵母發(fā)酵得到的菌落數(shù)量最大，達到1.54×108CFU/mL。這說明釀酒酵母在離心上清液中的發(fā)酵需要額外添加碳源，適宜的糖濃度可使釀酒酵母的代謝更旺盛[35]。隨著葡萄糖添加量增加，產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵得到的菌落數(shù)量變化不顯著（P>0.05），這說明產(chǎn)朊假絲酵母利用離心上清液進行發(fā)酵時不需要額外增加碳源，菌落數(shù)量可以達到1.8×108CFU/mL，比添加量為1.5%葡萄糖時，釀酒酵母得到的菌落數(shù)量還要多。由此可得，不增加碳源情況下，產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵要優(yōu)于釀酒酵母。

圖9 不同葡萄糖添加量對發(fā)酵的影響Fig.9 Effects of different glucose additions on fermentation

2.2.4 pH對發(fā)酵的影響 從圖10可以得出，當pH由5.0升至5.5時，釀酒酵母發(fā)酵得到的菌落數(shù)量顯著增加（P<0.05）；pH由5.5升至6.0時，釀酒酵母發(fā)酵得到的菌落數(shù)量顯著下降（P<0.05），之后菌落數(shù)量變化不明顯，pH為5.5時，菌落數(shù)量最高，為7.6×107CFU/mL。產(chǎn)朊假絲酵母菌落數(shù)量的變化為：當pH由5.0升至5.5時，產(chǎn)朊假絲酵母菌落數(shù)量增長極顯著（P<0.01），達到1.58×109CFU/mL，當pH由5.5升至6.0時，產(chǎn)朊假絲酵母菌落數(shù)量顯著下降（P<0.05）。圖中產(chǎn)朊假絲酵母菌落數(shù)量比釀酒酵母菌落數(shù)量多，說明該pH條件下，產(chǎn)朊假絲酵母更容易利用離心上清液進行發(fā)酵。由圖10可知，pH為5.5時，產(chǎn)朊假絲酵母菌落數(shù)量最大，為其最適發(fā)酵pH[36]。

圖10 不同pH對發(fā)酵的影響Fig.10 Effects of different pH on fermentation

3 結(jié)論

在本課題研究中，探索了用等電點法提取玉米浸液中蛋白質(zhì)的方法，并把提取粗蛋白后的上清液也充分利用來生產(chǎn)單細胞蛋白。結(jié)果顯示，等電點法提取蛋白的優(yōu)化條件為：pH7.6、提取溫度26.4 ℃、提取時間20 min，此條件下粗蛋白的提取率可以達到77.5%。釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵離心上清液的研究可以得出：產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵不需要額外添加碳源，更適合用于離心上清液生產(chǎn)單細胞蛋白，上清液濃度為8%，發(fā)酵pH為5.5，該條件下菌落數(shù)量可以達到1.6×109CFU/mL。本試驗用到的試劑、酵母較為常見，操作簡單，可提高玉米浸液的附加值，為玉米浸液的綜合利用提供了一定的理論依據(jù)。