過(guò)敏性鼻炎患者外周血CDCA5、HLA-DPB1、IL-23水平差異及意義研究*

黃 輝，蔣勁松，周明朗，代國(guó)勝，冀慶軍，何 苗，柴 偉，孫敬武

1.亳州市人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，安徽亳州 236800；2.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院/安徽省立醫(yī)院，安徽合肥 230032

過(guò)敏性鼻炎(AR)是臨床中較為常見(jiàn)的嚴(yán)重變態(tài)反應(yīng)性鼻炎，一般情況下AR多指外界刺激機(jī)體后導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)過(guò)敏原感應(yīng)性增高的應(yīng)激反應(yīng)，在臨床中主要表現(xiàn)為鼻黏膜病變[1]。有研究指出，AR的臨床發(fā)病率呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)，且臨床中多表現(xiàn)為鼻塞、鼻炎及連續(xù)性噴嚏[2]。雖然 AR對(duì)患者生命無(wú)法造成威脅，但由于其根治難度大且反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[3]。因此，尋找AR患者發(fā)病的影響因素，對(duì)其制訂針對(duì)性干預(yù)措施以降低AR發(fā)病率和改善患者臨床癥狀具有重要意義。有研究表明，多類細(xì)胞及因子參與AR的發(fā)展，其中一類細(xì)胞的失衡為主要因素，這類細(xì)胞有嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等，由于這類細(xì)胞產(chǎn)生的炎性因子，導(dǎo)致呼吸道慢性炎癥發(fā)生[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白5(CDCA5)在哮喘患者表達(dá)水平增高[5]，但CDCA5表達(dá)水平與AR關(guān)系鮮見(jiàn)報(bào)道。人類白細(xì)胞抗原(HLA)是人類免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有高度的多態(tài)性，是免疫遺傳學(xué)研究的重要組成部分。早期研究顯示，HLA基因多態(tài)性與AR發(fā)病有一定相關(guān)性[6]。細(xì)胞白細(xì)胞介素-23(IL-23)在Th17細(xì)胞的分化中具有重要作用，IL-23-Th17與多種疾病的發(fā)生相關(guān)，如關(guān)節(jié)炎、鼻竇炎、鼻息肉等[7-10]，但目前關(guān)于IL-23水平與AR的研究報(bào)道較少。筆者選取AR患者和健康者外周血單個(gè)核細(xì)胞，進(jìn)行CDCA5、HLA-DPB1差異表達(dá)基因分析及IL-23血清水平差異分析，以期探討外周血CDCA5、HLA-DPB1、IL-23表達(dá)水平與AR發(fā)病的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集亳州市人民醫(yī)院耳鼻喉科AR患者52例作為病例組，其中男33例，女19例；年齡22～63歲；鼻炎病程2～10年；伴哮喘13例；有AR家族史15例；工作環(huán)境：室內(nèi)28例，室外24例。另選取同期36例體檢健康者作為對(duì)照組，其中男22例，女14例；年齡20～60歲；工作環(huán)境：室內(nèi)21例，室外15例。兩組年齡、性別、工作環(huán)境比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病例組：由亳州市人民醫(yī)院醫(yī)生根據(jù)《變應(yīng)性鼻炎診斷和治療指南(2015年，天津)》[11]AR診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為AR患者；(2)對(duì)照組：無(wú)呼吸道相關(guān)疾病,無(wú)過(guò)敏性疾病如鼻竇炎、皮炎等。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在糖尿病、肝腎功能不全、免疫缺陷疾病或營(yíng)養(yǎng)不良。根據(jù)《變應(yīng)性鼻炎診斷和治療指南(2015年，天津)》[11]將患者分為輕度組(間斷性鼻癢、打噴嚏3～5個(gè)/次)、中度組(鼻癢頻繁但能忍受，打噴嚏>5～10個(gè)/次，出現(xiàn)間斷性鼻塞)、重度組(出現(xiàn)蟻行感鼻癢，打噴嚏>10個(gè)/次，鼻子堵塞嚴(yán)重)。

1.2方法

1.2.1外周血淋巴細(xì)胞分離 取2 mL外周血，新鮮肝素抗凝血加入等體積磷酸鹽緩沖液混勻后，滴加細(xì)胞分離液，使用離心機(jī)2 000 r/min，離心20 min。管內(nèi)層次分明，第2層為淋巴細(xì)胞層，取出第2層加入生理鹽水混勻后，離心20 min，得到淋巴細(xì)胞。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)檢測(cè)CDCA5 mRNA相對(duì)表達(dá)水平 提取細(xì)胞總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行，所需引物序列為：CDCA5上游引物5′-CTC CAA ACT CAC CGA GGT CC-3′，CDCA5下游引物5′-GCA GCT TCA AAC TCG GCA TT-3；GAPDH上游引物5′-CCT GCA CCA CCA ACT GCT TA-3′，GAPDH下游引物5′-AGT GAT GGC ATG GAC TGT GG-3′。每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔，并繪制溶解曲線，計(jì)算ΔCT值。

1.2.3HLA-DPB1基因分型 取血液2 mL，用試劑盒提取樣品基因組DNA。PCR-SBT為主的分型方法對(duì)HLA-DPB1基因進(jìn)行DNA序列測(cè)定和等位基因分型。DPBl序列特異性引物是參考文獻(xiàn)[12]的方法設(shè)計(jì)合成的。

1.2.4血清IL-23及IgE檢測(cè) 通過(guò)雙抗體夾心-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對(duì)血清IL-23水平進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)IgE水平，根據(jù)操作說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1兩組CDCA5 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較 對(duì)照組CDCA5 mRNA相對(duì)表達(dá)水平為1.25±0.12，病例組為1.62±0.16，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.49，P<0.05)，見(jiàn)圖1。進(jìn)一步以CDCA5 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的中位數(shù)為界值，分析CDCA5 mRNA相對(duì)表達(dá)水平高低不同者患AR的概率，結(jié)果顯示，CDCA5高表達(dá)組患AR的比例為95.4%，明顯高于CDCA5低表達(dá)組(5.89%)(P<0.05)。

圖1 兩組CDCA5相對(duì)表達(dá)水平比較

2.2兩組HLA-DPB1基因分型比較 檢測(cè)020102、0202、040101、0501、0502、0602、0901、13010902 8種HLA-DPB1等位基因，檢測(cè)結(jié)果符合Hadry-Weinberg平衡。HLA-DPB1*0502和HLA-DPBI*040101在病例組和對(duì)照組中頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.63，P<0.05)，見(jiàn)表1。經(jīng)Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，HLA-DPBI*040101基因(OR=0.48，95%CI=0.300～1.555)、HLA-DPB1*0502基因(OR=0.57，95%CI=0.040～0.934)提升了患AR的風(fēng)險(xiǎn)。

表1 HLA-DPB1等位基因分布比較[n(%)]

2.3兩組血清IL-23和IgE水平比較 與對(duì)照組比較，病例組IL-23、IgE水平升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。AR患者血清IL-23水平和血清總IgE水平呈正相關(guān)(r=0.479，P<0．001)，見(jiàn)圖2。

表2 兩組血清IL-23和IgE水平比較

圖2 IL-23與IgE相關(guān)性散點(diǎn)圖

2.4不同程度AR患者CDCA5 mRNA相對(duì)表達(dá)水平及IL-23、IgE水平比較 重度組CDCA5 mRNA相對(duì)表達(dá)水平、IL-23及IgE水平高于中度組和輕度組，中度組CDCA5 mRNA相對(duì)表達(dá)水平、IL-23及IgE水平高于輕度組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同程度AR患者CDCA5 mRNA相對(duì)表達(dá)水平、IL-23及IgE水平比較

3 討 論

AR是一種炎癥疾病，它是由IgE介導(dǎo)的鼻黏膜病變。有研究發(fā)現(xiàn)，AR患者機(jī)體炎性反應(yīng)水平升高[13]。AR臨床癥狀以閉塞、連續(xù)性噴嚏和鼻癢為主，病情嚴(yán)重時(shí)會(huì)累及周圍組織器官，對(duì)患者造成嚴(yán)重不良影響[14]。分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，某些基因的不同等位基因與AR發(fā)展相關(guān)聯(lián)，但由于AR發(fā)病受家族遺傳及環(huán)境等諸多因素影響[15]，研究者還不能得出普遍性結(jié)論。因此，本研究探討CDCA5、HLA-DPB1差異表達(dá)及IL-23血清水平差異與AR發(fā)病的相關(guān)性十分有意義。

CDCA5屬于細(xì)胞分裂周期相關(guān)家族蛋白的一員。CDCA5是細(xì)胞分裂周期中染色單體分離與結(jié)合所必需的一種調(diào)節(jié)因子。CDCA5保證了細(xì)胞減數(shù)分裂與有絲分裂中染色體有序分離，在DNA修復(fù)中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，CDCA5與乳腺癌、胃癌等腫瘤發(fā)生及疾病預(yù)后相關(guān)[16-17]。有研究發(fā)現(xiàn)，CDCA5與哮喘有關(guān)，在哮喘患者中CDCA5表達(dá)水平明顯升高[5],而AR與哮喘兩類疾病在發(fā)病機(jī)制病理改變中有很大程度相似。在AR發(fā)病過(guò)程中存在廣泛的淋巴細(xì)胞增殖和分化，但CDCA5在調(diào)節(jié)AR炎性反應(yīng)中發(fā)揮的作用需進(jìn)一步研究分析。筆者發(fā)現(xiàn)，與體檢健康者比較，AR患者的外周血淋巴細(xì)胞中CDCA5 mRNA相對(duì)表達(dá)水平升高，說(shuō)明CDCA5表達(dá)水平可能與AR發(fā)生相關(guān)。筆者進(jìn)一步比較CDCA5 mRNA相對(duì)表達(dá)水平與AR發(fā)生的概率發(fā)現(xiàn)，CDCA5 mRNA高表達(dá)者患AR的比例明顯高于CDCA5 mRNA低表達(dá)者。以上結(jié)果說(shuō)明CDCA5可能與AR的發(fā)生密切相關(guān)，相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

近年來(lái)有研究者發(fā)現(xiàn)，HLA基因在免疫性疾病中發(fā)揮了重要作用，其與哮喘、過(guò)敏性皮炎都存在一定關(guān)系[6]。也有研究報(bào)道顯示，HLA基因與鼻息肉發(fā)病的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)HLA基因是鼻息肉發(fā)病的易感基因與保護(hù)基因[18]，但目前關(guān)于HLA基因與AR的研究較少。有學(xué)者研究韓國(guó)人HLA-DPB1與哮喘可能相關(guān)，HLA-DPB1*0301是哮喘伴阿司匹林耐受不良的一項(xiàng)易感標(biāo)志物[19]。本研究結(jié)果顯示，病例組與對(duì)照組檢測(cè)出8種等位基因，頻率最高的等位基因?yàn)镠LA-DPB1*0501，在病例組和對(duì)照組中的頻率分別為34.6%和55.6%。孫筱放等[20]進(jìn)行了HLA-DPB1基因DNA分型的檢測(cè)，檢測(cè)出12種等位基因，其中頻率最高等位基因?yàn)镠LA-DPB1*0501(基因頻率37.4%)。最高頻率基因型與本研究一致，本研究只檢測(cè)出8種基因型，推測(cè)是由于此次選取的樣本太小及其余等位基因在人群中占比較低。筆者比較病例組與對(duì)照組各等位基因頻率，共發(fā)現(xiàn)有HLA-DPB1*0502與HLA-DPB1*040101，在組間差異明顯，經(jīng)過(guò)Logistic回歸分析有HLA-DPB1*040101基因(OR=0.48，95%CI=0.300～1.555)、HLA-DPB1*0502基因(OR=0.57，95%CI=0.040～0.934)提升了患AR的風(fēng)險(xiǎn)。

部分研究者根據(jù)“IgE依賴性機(jī)制學(xué)說(shuō)”，認(rèn)為IgE與AR患病相關(guān)，IgE通過(guò)肥大細(xì)胞脫顆粒分泌出多種炎性介質(zhì)，引發(fā)鼻黏膜炎癥[7]。IL-23是IL-12細(xì)胞因子家族的成員，它除了具有與IL-12相同的p40亞基外，還具有一個(gè)IL-12沒(méi)有的p19亞基[8]。IL-23主要產(chǎn)生于活化的巨噬細(xì)胞，其參與T淋巴細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞分泌免疫因子，對(duì)免疫相關(guān)功能起調(diào)節(jié)作用，與人體諸多自身免疫疾病有關(guān)聯(lián)[9-10]。有研究表明，大鼠敲除IL-23基因后，機(jī)體免疫受損，機(jī)體內(nèi)抗原提呈刺激T淋巴細(xì)胞分泌炎癥因子的能力下降明顯[21]。本研究結(jié)果表示，AR患者IL-23水平升高，且IL-23與IgE呈正相關(guān)，這表明IL-23可能是觸發(fā)IgE介導(dǎo)Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)產(chǎn)生的調(diào)節(jié)因子。提示IL-23與AR發(fā)病密切相關(guān)，具體機(jī)制有待后續(xù)研究。本研究結(jié)果顯示，AR重度患者CDCA5 mRNA相對(duì)表達(dá)水平、IL-23、IgE水平高于AR輕、中度患者。猜測(cè)IL-23可能通過(guò)調(diào)節(jié)JAK/STAT3信號(hào)途徑，抑制相關(guān)凋亡因子表達(dá)，引起嗜酸性粒細(xì)胞的聚集浸潤(rùn)，從而參與AR的發(fā)展。IL-23作用于嗜酸性粒細(xì)胞促進(jìn)其凋亡，當(dāng)IL-23水平降低時(shí)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡延遲從而導(dǎo)致AR病情加重。這也表明了CDCA5、IL-23與AR疾病的發(fā)展有關(guān)，這可能成為判斷AR疾病走向的預(yù)測(cè)性指標(biāo)，若要運(yùn)用于臨床，后續(xù)還需補(bǔ)充大量試驗(yàn)證明。

綜上所述，CDCA5、HLA-DPB1基因及血清IL-23水平可能在AR的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步研究。CDCA5、HLA-DPB1、IL-23可能作為評(píng)價(jià)AR疾病進(jìn)展的預(yù)測(cè)分子，并作為治療和預(yù)防AR的潛在分子靶標(biāo)。