血清miR-499-5p、鐵調(diào)素20聯(lián)合檢測在急性心肌梗死診斷中的應用*

周 云，鎮(zhèn)海濤，郭 芬，李 軍,魏家興,彭藝靈

湖北科技學院醫(yī)學部國家級全科醫(yī)學實驗教學示范中心，湖北咸寧 437100

急性心肌梗死(AMI)是由心肌持續(xù)性缺血所致的急性組織壞死，具有極高的發(fā)病率和死亡率[1]。微小RNA(miRNA)是非編碼RNA分子，在血液和組織中均能穩(wěn)定表達，對脂類代謝及染色體重構(gòu)等過程均具有調(diào)控作用[2]。miR-499-5p主要在哺乳動物的心肌和骨骼肌中高度表達，正常生理條件下機體血清中的miR-499-5p水平較低[2]。ZHOU等[3]發(fā)現(xiàn)，miR-499-5p能夠作用于多種心肌細胞特征性基因靶點，從而調(diào)控心肌細胞的凋亡、增生及分化等過程。鐵調(diào)素(Hepc)是一種由肝臟合成的抗菌多肽，由25個氨基酸組成，對機體內(nèi)鐵離子的穩(wěn)定具有關鍵的調(diào)節(jié)作用[4]。HAN等[5]發(fā)現(xiàn)，炎性反應能夠刺激機體釋放大量的白細胞介素-6(IL-6)進入血液循環(huán)，從而促進Hepc-20合成。因此，本研究旨在探討miR-499-5p和Hepc-20聯(lián)合檢測對AMI的診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年6月至2021年6月于本中心收治的AMI患者96例作為AMI組，并根據(jù)心電圖ST段是否抬高將其分為ST抬高型心肌梗死(STEMI)組(48例)和非ST抬高型心肌梗死(NSTEMI)組(48例)。同時，選取同年齡段的心絞痛患者及健康者各96例，作為心絞痛組和健康組。納入標準：(1)AMI組符合文獻[6]中對AMI的診斷標準，且均經(jīng)冠脈造影證實；(2)無心肌梗死既往史；(3)相關實驗室檢查及基本資料完整；(4)從發(fā)病到入院搶救的時間不超過6 h。排除標準：(1)合并慢性心力衰竭；(2)兩周內(nèi)服用過鐵劑或接受了輸血治療；(3)合并其他惡性腫瘤(如白血病、惡性淋巴瘤及腎癌等)；(4)合并心臟瓣膜疾病、急性心肌炎及心肌病等嚴重心臟疾?。?5)合并凝血功能障礙。本研究經(jīng)本中心醫(yī)學倫理委員會批準，且所有受試者或其家屬均簽署知情同意書。

1.2標本采集 所有受試者均于肘靜脈處抽取10 mL靜脈血置于抗凝管中，通過離心機(生產(chǎn)廠家：山東博科科學儀器有限公司；型號：TD-6M)以6 000 r/min離心5 min，取其上層清液置于試管中，于-80 ℃冰箱中保存。

1.3檢測方法 采用miRNA分離試劑盒(美國Invitrogen公司，批號：20200513)提取總RNA，嚴格遵循試劑盒的操作規(guī)定。將提取的總RNA滴入20 μL無核糖核酸酶的水中溶解，通過紫外分光光度儀(美國Promega公司)檢測A260值和A280值，計算其RNA的純度和濃度，選取A260/A280比值在1.8～2.0的標本用于后續(xù)試驗。利用HG TaqMan miRNA試劑盒(新?；驒z測有限公司，批號：20200526)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(購自德國Qiagen公司，批號：20200516)定量檢測miR-499-5p的表達量。miR-499-5p的反應條件均為16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。PCR擴增體系為：SYBR Premix 10 μL、cDNA標本3.0 μL、ddH2O 5.0 μL、正向引物1.0 μL及反向引物1.0 μL，共計20 μL。miR-499-5p的正向引物序列為5′-CGT GTC GAC CAA GTC TGG GGT GAA AGA GAA G-3′、反向引物序列為5′-TGT GTC GAC GGT CAT GAG CTT GTT GAG GTT C-3′。內(nèi)參基因U6的正向引物序列為5′-ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT-3′、反向引物序列為5′-GGA ACG CTT CAC GAA TTT G-3′。miR-499-5p的PCR反應條件均為預變性95 ℃ 20 s、變性95 ℃ 20 s、退火60 ℃ 30 s、延伸70 ℃ 5 s，擴增40個循環(huán)。每個標本設置3個復孔。引物序列由蘇州瑞博生物技術股份有限公司合成。以相對Ct值法檢測miR-499-5p的相對表達水平，相對于U6的比值為2-ΔΔCt，以ΔCt值為結(jié)果，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。

總膽固醇(TC)、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、高密度脂蛋白(HDL)、三酰甘油(TG)、血肌酐(Cr)及低密度脂蛋白(LDL)采用全自動生化分析儀(瑞士羅氏公司，型號：COBAS INTEGRA 800)檢測。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清中Hepc-20水平，嚴格遵守試劑盒(上海古朵生物科技有限公司，批號：20200522)流程操作，其中線性范圍為12.5～300.0 μg/L。

2 結(jié) 果

2.13組受試者的一般資料 AMI組血清中的miR-499-5p、Hepc-20、cTnI、LDL水平較心絞痛組和健康組升高(P<0.05)；AMI組血清中的HDL水平較心絞痛組和健康組降低(P<0.05)；AMI組和心絞痛組TG水平較健康組升高(P<0.05)。見表1。

表1 3組受試者的一般資料[n/n或或n(%)]

組別nHDL(mmol/L)TG(mmol/L)TC(mmol/L)Cr(μmol/L)cTnI(μg/L)miR-499-5pHepc-20(μg/L)AMI組961.03±0.24ab1.98±0.95a4.23±1.8583.52±33.164.23±1.96ab1.37±0.25ab94.66±21.23ab心絞痛組961.66±0.31a1.85±0.86a4.12±1.9966.03±31.051.33±0.51a0.95±0.18a63.21±16.99a健康組963.16±1.251.56±0.724.01±1.9271.39±35.661.16±0.420.69±0.2222.06±6.78

2.2STEMI和NSTEMI組患者血清miR-499-5p和Hepc-20水平比較 兩組血清中的miR-499-5p和Hepc-20水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 STEMI和NSTEMI組患者血清miR-499-5p和Hepc-20水平比較

2.3二元Logistic回歸模型分析發(fā)生AMI的獨立影響因素 二元Logistic回歸分析結(jié)果顯示，miR-499-5p、Hepc-20、cTnI及LDL水平升高是影響AMI發(fā)生的獨立危險因素(P均<0.05)，見表3。

表3 二元Logistic回歸模型分析發(fā)生AMI的獨立影響因素

2.4AMI患者血清中miR-499-5p和Hepc-20與cTnI的相關性分析 miR-499-5p和Hepc-20均與cTnI呈正相關(r=0.746、0.871，P<0.05)。

2.5血清中miR-499-5p、Hepc-20對AMI的診斷效能 將AMI組和心絞痛組作為分析對象，以是否發(fā)生AMI為前提繪制ROC曲線，miR-499-5p和Hepc-20的最佳截斷值分別為1.27、90.00 μg/L，miR-499-5p和Hepc-20的曲線下面積(AUC)分別為0.806、0.838。miR-499-5p和Hepc-20聯(lián)合檢測的AUC為0.877，明顯大于miR-499-5p或Hepc-20單項檢測的AUC，聯(lián)合檢測的靈敏度和特異度分別為90.24%、78.05%，見表4、圖1。

表4 血清中miR-499-5p、Hepc-20對AMI的診斷效能

圖1 血清中miR-499-5p、Hepc-20診斷AMI的ROC曲線

3 討 論

AMI是冠心病最嚴重的結(jié)果，據(jù)流行病學統(tǒng)計，世界范圍內(nèi)每年因AMI死亡人數(shù)已達3 000 000～4 000 000，且呈不斷上升的趨勢[1]。人口老齡化、飲食結(jié)構(gòu)的改變及遺傳易感性是導致AMI的重要因素。雖然冠狀動脈造影對確診AMI具有重要意義，但其在臨床實踐中受諸多限制，且屬于有創(chuàng)操作。目前，cTnI是診斷AMI最常用的生化指標，其對心臟損傷的靈敏度和特異度均較高，但終末期腎臟疾病或腎損傷也會導致cTnI水平升高，影響結(jié)果準確度[7]。同時，cTnI通常在AMI發(fā)生后的4～8 h才升高，且在12～24 h才能達到峰值，這不利于AMI早期診斷，使再灌注治療的間隔延長，增加患者的死亡風險[7]。因此，cTnI的實際應用存在一定弊端，需要更多有效指標輔助診斷AMI。

miRNA屬于內(nèi)源性小RNA分子，不能編碼RNA，其長度為21～26個核苷酸，能結(jié)合靶基因的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)，從而影響轉(zhuǎn)錄后的分子活動。體內(nèi)循環(huán)血液中miRNA的分子長度較短，并具有抗酸、抗堿及抗RNA酶的能力，使其能夠穩(wěn)定存在于血液中[2]。miR-499-5p屬于肌球蛋白Myh7b家族，在心肌細胞的外泌體中分泌較多，對心肌細胞凋亡、心肌纖維化及心室重構(gòu)具有重要的調(diào)控作用，與心血管疾病關系密切[2]。動物實驗表明，在家兔模型中，阻遏miR-499-5p表達能夠提高心肌細胞中線粒體膜的穩(wěn)定程度，延緩家兔心臟重構(gòu)過程[8]。李世櫻等[9]發(fā)現(xiàn)，導入miR-499-5p抑制劑后，受損的心肌細胞膜電位逐漸恢復，房顫誘發(fā)率明顯下降。研究表明，miR-499-5p高表達能夠降低心肌細胞對應激刺激的敏感性，導致心臟壓力超負荷，心肌細胞受損，誘導小鼠出現(xiàn)嚴重的心功能不全[10]。本研究結(jié)果顯示，AMI組血清miR-499-5p相對表達水平較心絞痛組和健康組升高(P均<0.05)。其原因可能是心肌細胞損傷、壞死后，細胞破裂，使其內(nèi)外泌體合成并存儲的大量miR-499-5p釋放入血，導致AMI患者血清miR-499-5p相對表達水平升高[9]。Hepc的基因位于19號染色體上，由2個內(nèi)含子和3個外顯子組成，其中Hepc由第3個外顯子編碼。Hepc分為Hepc-20、Hepc-22、Hepc-25，其中Hepc-20和Hepc-25屬于同一基因的異構(gòu)體[5]。Hepc-20主要存在于血液和尿液中，包含2條β鏈，以二硫鍵的連接方式形成穩(wěn)固的階梯狀結(jié)構(gòu)[5]。研究表明，肝細胞在合成促紅細胞生成素(EPO)時，機體內(nèi)紅細胞含量增加，這能夠使肝臟合成Hepc-20的過程受阻[11]。心肌細胞外的過量鐵離子能夠激活氧化應激反應，從而釋放活性氧(ROS)，增加心肌損傷的易感性[12]。本研究結(jié)果顯示，AMI組血清Hepc-20水平較心絞痛組和健康組升高(P均<0.05)。其原因可能是發(fā)生AMI時，機體因免疫系統(tǒng)的作用能夠誘導巨噬細胞、中性粒細胞分化，從而釋放大量的炎癥因子和趨化因子，促進Hepc-20合成增加并釋放入血[13]。

cTnI是一種與心肌肌肉收縮相關的調(diào)節(jié)蛋白，是臨床診斷心肌損傷最常用的生化指標，其在健康人體血清中水平較低，但當發(fā)生心肌細胞損傷時，其水平會升高[7]。LDL是一種運載膽固醇的脂蛋白顆粒，當其過量時會使膽固醇堆積在冠狀動脈血管壁上，造成冠狀動脈痙攣[14]。二元Logistic回歸分析顯示，miR-499-5p、Hepc-20、cTnI及LDL水平升高是影響AMI發(fā)生的獨立危險因素(P均<0.05)，提示血清中miR-499-5p、Hepc-20、cTnI及LDL的水平對AMI的發(fā)生至關重要，可能成為篩查AMI的潛在生化指標。而STEMI和NSTEMI患者血清miR-499-5p和Hepc-20水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，提示miR-499-5p和Hepc-20只能反映AMI可能存在，但無法判別AMI的具體類別。miR-499-5p和Hepc-20均與cTnI呈正相關(P均<0.05)，提示miR-499-5p、Hepc-20與臨床常用指標cTnI具有較好的一致性。其原因可能是miR-499-5p高表達時，能夠抑制肌球蛋白重鏈表達，降低心肌氧代謝和耐受性，使心肌損傷風險增加，這與cTnI的作用具有相似性，二者之間可能存在協(xié)同作用[3,15]。Hepc-20與cTnI之間存在的具體作用機制目前尚不清楚，需要后續(xù)基礎實驗進一步研究，但可能與AMI誘導的機體炎性反應使Hepc-20水平升高，同時心肌細胞溶解后釋放cTnI入血有關[13,16]。ROC曲線結(jié)果顯示，miR-499-5p聯(lián)合Hepc-20檢測的AUC明顯高于miR-499-5p或Hepc-20單項檢測的AUC，其靈敏度和特異度分別為90.24%和78.05%(P<0.05)，提示miR-499-5p和Hepc-20聯(lián)合檢測能夠提高對AMI的鑒別診斷價值，且靈敏度和特異度均較高，對于區(qū)別心絞痛和AMI具有重要的臨床意義。本研究結(jié)果顯示，miR-499-5p聯(lián)合Hepc-20檢測的靈敏度較單項檢測明顯提高，提示二者聯(lián)合對早期篩查AMI具有較高價值。

AMI患者血清中miR-499-5p和Hepc-20水平均升高，且是AMI發(fā)生的獨立危險因素。在輔助診斷AMI時，miR-499-5p、Hepc-20與臨床常用指標cTnI具有較好的一致性。miR-499-5p聯(lián)合Hepc-20檢測對AMI具有良好的診斷效能，且診斷的真實性可靠，為臨床實施進一步治療提供有利支持。但AMI患者血清中miR-499-5p和Hepc-20水平變化的具體機制尚不清楚，需要在接下來的研究中逐步證實。