ccfDNA中RERG甲基化狀態(tài)檢測在診斷鼻咽癌中的臨床意義*

李宏豐，李 剛，云惟琳，張前飛，張秋葉

文昌市人民醫(yī)院：1.耳鼻咽喉科；2.檢驗(yàn)科，海南文昌 571300

鼻咽癌在我國南方和東南亞地區(qū)高度流行，年發(fā)病率為15/100 000～50/100 000[1]。然而，由于發(fā)病部位隱匿，多數(shù)患者早期無癥狀或僅表現(xiàn)出非特異性癥狀，80%以上的鼻咽癌患者在晚期(Ⅲ或Ⅳ期)才被首次確診，這導(dǎo)致患者生存率大大降低[2-3]。因此，鼻咽癌的早期診斷是一個(gè)重大的臨床挑戰(zhàn)。異常的DNA甲基化已被報(bào)道為鼻咽癌等癌癥的一種重要病變機(jī)制，甚至在癌變早期就能夠檢測到[4]。循環(huán)細(xì)胞游離DNA(ccfDNA)是存在于循環(huán)體液中游離狀態(tài)的DNA，被認(rèn)為與細(xì)胞的壞死、凋亡等相關(guān)[5]。近年來ccfDNA甲基化檢測作為一種液體活組織檢查技術(shù)已成為疾病診療中的研究熱點(diǎn)[6]。在許多癌癥類型中，RAS樣雌激素調(diào)節(jié)生長因子(RERG)基因普遍以“全基因組”或“整體”DNA高甲基化的形式出現(xiàn)，進(jìn)而導(dǎo)致RERG蛋白低表達(dá)。因此，RERG基因高甲基化是許多癌癥常見的特征性甲基化變化之一[7-8]。在本研究中，筆者利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法DNA甲基化分析(qAMP)評(píng)估ccfDNA中RERG mRNA甲基化狀態(tài)作為預(yù)期的鼻咽癌篩選生物標(biāo)志物的潛力?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1月至2021年6月本院100例經(jīng)組織學(xué)確診的原發(fā)性鼻咽癌患者作為鼻咽癌組，另選取97例年齡、性別相匹配的非癌志愿者作為對(duì)照組。本研究已獲本院醫(yī)學(xué)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)通過(批準(zhǔn)號(hào)：2019-10-07)。所有參與者均簽署書面知情同意書，并接受內(nèi)窺鏡檢查。鼻咽癌組納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理活檢和影像學(xué)檢查確診為鼻咽癌，為初診患者且具有完整的病歷資料。鼻咽癌組排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往接受過放化療或有其他惡性腫瘤病史，如非鼻咽癌頭頸部惡性腫瘤或下腔靜脈癌；(2)合并有嚴(yán)重心腦血管疾病、肝、腎、肺、胃腸等基礎(chǔ)疾病。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡、性別與鼻咽癌組患者人群相匹配，經(jīng)血液和超聲等相關(guān)檢查排除任何惡性腫瘤的臨床證據(jù)。對(duì)照組排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在惡性腫瘤的臨床證據(jù)和高危因素(鼻咽癌病史、吸煙、飲酒、經(jīng)常食用腌制或鹽漬食品)；(2)存在有毒化學(xué)品等職業(yè)暴露；(3)合并有嚴(yán)重心腦血管疾病、肝、腎、肺、胃腸等基礎(chǔ)疾病。鼻咽癌組中男67例，女33例；年齡19～78歲，平均(51.27±14.99)歲；根據(jù)AJCC/UICC第8版分期系統(tǒng)[9]，進(jìn)行臨床分期：TNM分期Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ～Ⅳ期66例；T1分期25例，T2分期34例，T3分期30例，T4分期11例；N0/1分期55例，N2/3分期45例；M0分期100例；Charlson合并癥指數(shù)中位值1分(范圍：0～3分)。對(duì)照組中男63例，女34例；年齡19～81歲，平均(50.79±15.19)歲；Charlson合并癥指數(shù)中位值1分(范圍：0～3分)，對(duì)照組EB病毒(EBV)檢測均為陰性。兩組年齡、性別構(gòu)成、Charlson合并癥指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1血液采集 采集患者入院時(shí)靜脈外周血5 mL于乙二胺四乙酸(EDTA)管中。血液在4 ℃下3 500 r/min離心10 min，收集血漿，然后在4 ℃下20 000 r/min離心10 min，去除額外的細(xì)胞碎片和來自受損血細(xì)胞的基因組核酸污染。活檢標(biāo)本和血漿保存在-80 ℃，備用。另外收集鼻咽癌組患者EBV檢測結(jié)果，包括衣殼抗原-早期抗原免疫球蛋白A(VCA-IgA)、早期抗原-早期抗原免疫球蛋白A(EA-IgA)、核心抗原(EBNA1-IgA)、EBV DNA拷貝數(shù)。

1.2.2活檢組織DNA和ccfDNA提取 將活檢標(biāo)本用核糖核酸酶處理后，利用QIAamp DNA Mini試劑盒(德國Qiagen公司)提取總RNA游離基因組DNA。組織DNA用超凈水洗脫。對(duì)于血漿樣品，用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)測定414 nm處的光密度值(溶血臨界值為0.13)。使用QIAamp MinElute ccfDNA Mini試劑盒(德國Qiagen公司)提取ccfDNA，每個(gè)受試者的血漿標(biāo)本2 mL(1毫升/柱)用于DNA提取，每個(gè)色譜柱用30 μL超凈水洗脫。從一份200 μg的組織標(biāo)本中提取的組織DNA平均水平為50～240 ng，從一份血漿標(biāo)本中提取的ccfDNA平均水平為3 ng。

1.2.3RERG基因甲基化率檢測 通過qAMP法量化基因啟動(dòng)子甲基化率[10]。使用EpiTect Methyl Ⅱ DNA restriction Kit(德國Qiagen公司)，用甲基化敏感和/或甲基化依賴的限制性內(nèi)切酶對(duì)分離的ccfDNA進(jìn)行處理，包括非酶(Mo)、甲基化敏感酶(Ms)、甲基化依賴酶(Md)和甲基化敏感依賴酶(Msd)。反應(yīng)消化液在37 ℃孵化過夜。培養(yǎng)后，在65 ℃加熱滅活酶20 min后停止反應(yīng)。采用 RT2 SYBR Green ROX qPCR Mastermix(德國Qiagen公司)和EpiTect Methyl Ⅱ PCR Primer Assay(德國Qiagen公司)分別對(duì)Mo、Ms、Md和Msd 4項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行甲基化定量PCR。數(shù)據(jù)分析模板用于計(jì)算甲基化率和數(shù)據(jù)質(zhì)量控制。甲基化定量PCR的閾值周期值由制造商提供的數(shù)據(jù)分析電子表格計(jì)算，只有當(dāng)單錯(cuò)校正和雙錯(cuò)校驗(yàn)結(jié)果為“通過”(意味著限制性內(nèi)切酶是活躍的，能有效地消化DNA)時(shí)，才使用目標(biāo)基因的甲基化率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4生物信息學(xué)分析 這項(xiàng)研究包括來自TCGA數(shù)據(jù)庫(https：//portal.gdc.cancer.gov)的兩組數(shù)據(jù)，RNA-Seq轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)和來自頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSC)標(biāo)本的相應(yīng)患者臨床數(shù)據(jù)(HTSeq-FPKM類型)通過數(shù)據(jù)傳輸工具(GDC癌癥數(shù)據(jù)共享系統(tǒng))獲得，共下載了528例HNSC患者HNSC組織和44例正常組織的RNA-Seq數(shù)據(jù)。將HTSeq-FPKM數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為TPM(每百萬轉(zhuǎn)錄本讀數(shù))進(jìn)行分析。根據(jù)HNSC患者RERG mRNA的中位表達(dá)值，分為低表達(dá)組和高表達(dá)組。這項(xiàng)研究使用R軟件從GEO數(shù)據(jù)庫中下載了GSE41613數(shù)據(jù)表中的RERG mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，作為生存分析的外部驗(yàn)證。通過Kaplan-Meier 分析評(píng)估RERG mRNA 的預(yù)后意義。此外RERG mRNA的拷貝數(shù)變異(CNV)和甲基化水平數(shù)據(jù)是通過 cBioPortal網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)(https：//www.cbioportal.org/)獲得的。利用SMART網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)(http：//www.bioinfo-zs.com/smartapp/)分析和比較TCGA數(shù)據(jù)中RERG mRNA在HNSC組織和正常組織中的甲基化水平。使用MethSurv在線工具(https：//biit.cs.ut.ee/methsurv/)分析RERG mRNA甲基化水平的預(yù)后價(jià)值。β值表明DNA甲基化程度從0(未甲基化)到1(完全甲基化)不等。不同的β值最佳截?cái)嘀狄驯徽J(rèn)為表明超甲基化(β值：0.50～0.70)或低甲基化(β值：0.25～0.30)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析，呈偏態(tài)分布的計(jì)量資料以M(P25，P75)表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。繪制受試者工作特征(ROC)曲線，并分析曲線下面積(AUC)、靈敏度及特異度以確認(rèn)RERG mRNA甲基化率的診斷效能。采用Spearman相關(guān)分析ccfDNA和組織中RERG mRNA甲基化率的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1TCGA數(shù)據(jù)庫資料分析 基于TCGA數(shù)據(jù)庫的兩組數(shù)據(jù)，HNSC組織中RERG mRNA表達(dá)明顯低于正常組織，見圖1A。RERG mRNA在HNSC組織中的表達(dá)情況與患者總生存預(yù)后無關(guān)(P>0.05)，見圖1B。此外，HNSC組織中RERG mRNA甲基化β值高于正常組織(P<0.001)，見圖1C、D。

注：A為RERG在HNSC組織和正常組織中的表達(dá)差異；B為Kaplan-Merei曲線分析RERG mRNA表達(dá)與HNSC患者生存預(yù)后的關(guān)系；C為RERG mRNA在HNSC組織和正常組織中甲基化差異；D為RERG mRNA在HNSC組織及其配對(duì)的癌旁組織中甲基化差異。圖1 基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析RERG mRNA在HNSC組織中的表達(dá)和甲基化情況

2.2鼻咽癌組和對(duì)照組ccfDNA中RERG mRNA甲基化率比較 鼻咽癌組和對(duì)照組ccfDNA中RERG mRNA甲基化率分別為0.127(0.095，0.175)和0.023(0.014，0.036)，鼻咽癌組ccfDNA中RERG mRNA甲基化率高于對(duì)照組(Z=-11.881，P<0.001)，見圖2。經(jīng)ROC曲線分析，ccfDNA中RERG mRNA甲基化率診斷鼻咽癌的AUC為0.990(95%CI：0.980～0.999)，最佳截?cái)嘀禐?.059，此時(shí)靈敏度和特異度分別為93.0%和100.0%，見圖3。

圖2 兩組ccfDNA中RERG mRNA甲基化率比較

圖3 ccfDNA中RERG mRNA甲基化率診斷鼻咽癌的ROC曲線

2.3鼻咽癌患者ccfDNA和腫瘤組織中RERG mRNA甲基化率情況及相關(guān)性 鼻咽癌組ccfDNA中RERG mRNA甲基化率低于腫瘤組織[0.127(0.095，0.175)vs.0.278(0.184，0.364)，Z=-8.369，P<0.001]。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，ccfDNA和腫瘤組織中RERG mRNA甲基化率呈正相關(guān)(r=0.407，P<0.001)，見圖4。

注：A為腫瘤組織和ccfDNA中RERG mRNA甲基化率比較；B為Spearman相關(guān)分析散點(diǎn)圖。圖4 鼻咽癌組患者ccfDNA和組織中RERG mRNA甲基化率的關(guān)系

2.4ccfDNA中RERG mRNA甲基化狀態(tài)與鼻咽癌患者臨床特征的關(guān)系 鼻咽癌患者ccfDNA中RERG mRNA甲基化率在不同腫瘤T分期、N分期、TNM分期及EBV DNA狀態(tài)人群之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 鼻咽癌患者ccfDNA中RERG mRNA甲基化率與臨床病理特征的關(guān)系[M(P25,P75)]

續(xù)表1 鼻咽癌患者ccfDNA中RERG mRNA甲基化率與臨床病理特征的關(guān)系[M(P25,P75)]

3 討 論

鼻咽癌是一種發(fā)生于鼻咽組織的高度浸潤性腫瘤，由于鼻咽癌早期相對(duì)無癥狀，很多患者在疾病晚期才被確診。篩查識(shí)別早期鼻咽癌可能會(huì)改善患者治療結(jié)果，因此尋求新的能夠預(yù)測鼻咽癌的生物指標(biāo)對(duì)于及時(shí)采取措施進(jìn)行預(yù)防和治療鼻咽癌具有重要的臨床意義。

癌癥診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”是組織活檢，這種方法為侵入性，可能造成患者不適，且存在潛在并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)[11]。此外，腫瘤活檢的可及性有限，不能反映腫瘤內(nèi)部的異質(zhì)性或腫瘤進(jìn)化過程中新的亞克隆的出現(xiàn)。然而，液體活檢是一種很有前途的方法，可以克服這些缺點(diǎn)。世界范圍內(nèi)人類癌癥的發(fā)病率和死亡率較高，大部分與確診較晚而導(dǎo)致治療干預(yù)效果較差有關(guān)。而ccfDNA則為癌癥患者的早期診斷提供了一種非侵入性的途徑[12]。ccfDNA是由與細(xì)胞或細(xì)胞片段無關(guān)的雙鏈核酸短片段組成。ccfDNA在血漿和血清中以0.1～20.0 kb的多核苷酸鏈存在。創(chuàng)傷、腦卒中及劇烈運(yùn)動(dòng)等刺激因素都可以引起ccfDNA水平明顯增加[13]。健康人血液中ccfDNA水平范圍為0～100 ng/mL。相比之下，癌癥患者體內(nèi)的ccfDNA水平平均高出4～40倍，上限超過1 000 ng/mL。腫瘤細(xì)胞普遍存在無限增殖能力，這也部分解釋了患者較高的血漿ccfDNA水平[14]。RERG位于12p12染色體上，編碼一個(gè)小的Ras超家族GTP結(jié)合和水解蛋白(GTPase)。RERG在多種正常組織中廣泛表達(dá)，但在胰腺癌、乳腺癌、食管癌等腫瘤組織中則缺失表達(dá)[8,15-16]。此外，ZHAO等[17]結(jié)合甲基DNA結(jié)合域捕獲技術(shù)和cDNA微陣列分析，發(fā)現(xiàn)了一種在鼻咽癌組織中表達(dá)下調(diào)的特異性高甲基化基因-RERG，并借助于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)RERG在HK1、C666-1細(xì)胞株中的異位表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力，以及外細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)/核因子κB(NF-κB)具有明顯的抑制作用，說明RERG在鼻咽癌組織中常因?yàn)镃pG島甲基化而表達(dá)沉默，并通過抑制ERK/NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抑癌基因的活性。上述數(shù)據(jù)都支持RERG作為鼻咽癌治療新的分子靶點(diǎn)。在本研究中，筆者利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析，證實(shí)RERG mRNA在HNSC組織中表達(dá)下調(diào)，且普遍存在基因高甲基化。然后進(jìn)一步利用qAMP檢測了臨床標(biāo)本中RERG mRNA甲基化率，證實(shí)鼻咽癌組ccfDNA中RERG mRNA甲基化率高于對(duì)照組，腫瘤組織和ccfDNA中RERG mRNA甲基化率呈正相關(guān)，且ccfDNA中RERG mRNA甲基化率與腫瘤進(jìn)展及EBV感染有關(guān)。ZHAO等[17]研究曾證實(shí)，在EBV相關(guān)的NPC細(xì)胞系中，RERG經(jīng)常被甲基化，導(dǎo)致RERG表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而通過ERK/NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖、集落形成和遷移。本研究結(jié)果顯示，ccfDNA中RERG mRNA甲基化率略低于腫瘤組織，原因之一可能是ccfDNA不僅來自腫瘤細(xì)胞，部分也可能來自正常細(xì)胞。同時(shí)，標(biāo)本類型之間的這種差異可能也包含生物學(xué)檢測技術(shù)的偏差，例如限制性脫氧核糖核酸進(jìn)入血液循環(huán)，或次優(yōu)的血漿標(biāo)本處理導(dǎo)致溶血。為了盡量控制誤差，本研究中使用的非溶血性血漿可以防止血細(xì)胞中的核酸污染。此外經(jīng)ROC曲線分析，ccfDNA中RERG mRNA甲基化率用于診斷鼻咽癌的AUC為0.990(95%CI：0.980～0.999)，說明其具有較好的診斷效能。

綜上所述，ccfDNA中RERG mRNA甲基化鼻咽癌篩查中一個(gè)潛在的血液學(xué)生物標(biāo)志物；雖然本研究標(biāo)本數(shù)量有限，而且缺乏連續(xù)監(jiān)測數(shù)據(jù)，但是最終的結(jié)果也為評(píng)估利用qAMP檢測ccfDNA中基因甲基化率作為鼻咽癌特異性表觀遺傳標(biāo)志物的大標(biāo)本篩選方法提供了科學(xué)依據(jù)。