腦梗死急性期患者血清miR-493表達(dá)水平及其與溶栓后預(yù)后的關(guān)系研究

康梅娟, 溫昌明， 張保朝， 孫 軍， 劉義鋒， 張東煥， 黃 芳， 趙 磊

急性腦梗死(acute cerebral infarction，ACI)是一種發(fā)病率、死亡率、致殘率、復(fù)發(fā)率均高的神經(jīng)血管性疾病，其發(fā)病率約占所有腦卒中的77%，具有起病急、進(jìn)展快的特點(diǎn)，是影響人類(lèi)身體健康的全球性健康問(wèn)題[1,2]。

目前臨床治療ACI的原則是第一時(shí)間開(kāi)通血管，盡早恢復(fù)缺血腦組織的血流灌注，促進(jìn)神經(jīng)功能損傷修復(fù)[3]。因此，如何促進(jìn)ACI后血管新生、改善腦血流灌注成為了研究熱點(diǎn)。有報(bào)道[4]指出，微小RNA-493(microRNA-493，miR-493)具有調(diào)控腦梗死后血管新生的作用，可作為腦梗死后治療的新靶點(diǎn)。此外，靜脈溶栓治療是ACI患者唯一經(jīng)批準(zhǔn)的全身再灌注治療方法[5]，國(guó)內(nèi)外相關(guān)指南[6,7]均推薦早期采用阿替普酶靜脈溶栓治療。實(shí)際工作中早期預(yù)測(cè)ACI預(yù)后，對(duì)臨床制定針對(duì)性治療方案、改善預(yù)后具有重要指導(dǎo)價(jià)值，基于此，本研究嘗試探究ACI患者血清miR-493表達(dá)水平及其與溶栓后預(yù)后的關(guān)系。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 經(jīng)我院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，前瞻性選取2019年10月-2021年3月我院70例ACI患者作為研究組，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)參照《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2018》[8]診斷為ACI；(2)發(fā)病至治療時(shí)間≤4.5 h；(3)首次患ACI；(4)無(wú)腦出血傾向；(5)對(duì)本研究藥物無(wú)禁忌；(6)患者知曉本研究，已簽署同意書(shū)。其中男42例，女28例；年齡47～72歲，平均(60.15±5.92)歲；體質(zhì)量指數(shù)19.5～28.3 kg/m2，平均(25.21±1.54)kg/m2。依據(jù)1∶1配對(duì)試驗(yàn)原則，另選同期70例健康體檢者作為對(duì)照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)于我院進(jìn)行全身體檢未發(fā)現(xiàn)明顯異常；(2)自主行為能力良好，能配合完成研究；(3)無(wú)頭部嚴(yán)重創(chuàng)傷史、手術(shù)史及腦血管疾病史；(4)患者知曉本研究，已簽署同意書(shū)。其中男38例，女32例；年齡43～70歲，平均(58.83±5.58)歲；體質(zhì)量指數(shù)18.9～27.8 kg/m2，平均(24.81±1.49)kg/m2。兩組排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)血液系統(tǒng)疾病患者；(2)感染性疾病患者；(3)惡性腫瘤患者；(4)長(zhǎng)期服用激素類(lèi)藥物者；(5)自身免疫性疾病患者；(6)近期有嚴(yán)重創(chuàng)傷或手術(shù)史者；(7)心肺肝腎等臟器嚴(yán)重功能障礙者。

1.2 方法 阿替普酶靜脈溶栓：研究組患者入院后常規(guī)開(kāi)展抗血小板凝聚、補(bǔ)液、補(bǔ)充電解質(zhì)等對(duì)癥治療，發(fā)病4.5 h內(nèi)行阿替普酶(德國(guó)勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司，注冊(cè)證號(hào)S20110051)靜脈溶栓，總劑量0.9 mg/kg(最大劑量90 mg)，使用前用附帶的稀釋劑臨時(shí)配置，濃度為1 mg/ml，其中10%于1 min內(nèi)靜脈推注，剩余部分60 min內(nèi)靜脈滴注完成。溶栓24 h后檢查無(wú)出血，常規(guī)給予抗血小板藥物治療。溶栓治療3個(gè)月后，根據(jù)改良Rankin量表評(píng)分(modified Rankin scale，mRS)[9]評(píng)估預(yù)后，mRS總分0～6分，0分：無(wú)癥狀；1分：盡管有癥狀，但未見(jiàn)明顯殘障；2分：輕度殘障；3分：中度殘障；4分：重度殘障；5分：嚴(yán)重殘障；6分：死亡。本研究將mRS評(píng)分≤3分判定為預(yù)后良好，>3分判定為預(yù)后不良。

實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)：研究組分別于治療前、治療后3 d、7 d采集外周靜脈血3 ml，對(duì)照組于體檢時(shí)采集外周靜脈血3 ml，取血液標(biāo)本，離心處理取血清，采用熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)血清miR-493水平，檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，應(yīng)用公式2-ΔΔct計(jì)算miR-493相對(duì)表達(dá)水平(Δct=ct目標(biāo)-ct內(nèi)參，ΔΔct=Δct實(shí)驗(yàn)-Δct對(duì)照)；采用免疫比濁法測(cè)定血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular epithelial growth factor，VEGF)、血管生成素-2(Angiopoietin-2，Ang-2)水平，試劑盒購(gòu)自廣州奧維斯生物技術(shù)有限公司；采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清C反應(yīng)蛋白(Creactive protein，CRP)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)水平，試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司。以上檢測(cè)操作均由專(zhuān)業(yè)人員嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)完成。

1.3 觀察指標(biāo) (1)兩組一般資料(性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、入院時(shí)收縮壓、舒張壓、血糖水平、吸煙、飲酒情況)、血清miR-493水平;(2)研究組不同神經(jīng)功能缺損程度患者治療前血清血管生長(zhǎng)因子(VEGF、Ang-2)、炎性因子(CRP、IL-6)及miR-493水平，分析miR-493水平與神經(jīng)功能缺損程度、血清血管生長(zhǎng)因子、炎性因子的相關(guān)性;(3)研究組不同預(yù)后患者治療前、治療后3 d、7 d血清miR-493水平，分析血清miR-493預(yù)測(cè)ACI患者溶栓治療預(yù)后的價(jià)值。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料 血清miR-493水平比較 治療前、治療后3 d、7 d血清miR-493水平呈逐漸升高趨勢(shì)，但均低于對(duì)照組(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 兩組臨床資料、血清miR-493水平比較

2.2 研究組不同神經(jīng)功能缺損程度患者血清各指標(biāo)比較 研究組神經(jīng)功能輕度缺損23例，中度缺損31例，重度缺損16例；不同神經(jīng)功能缺損程度患者治療前血清miR-493、VEGF、Ang-2、CRP、IL-6水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 研究組不同神經(jīng)功能缺損程度患者血清各指標(biāo)比較

2.3 血清miR-493水平與神經(jīng)功能缺損程度的相關(guān)性 經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)治療前血清miR-493水平與ACI患者神經(jīng)功能缺損程度間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.520，P<0.05)。

2.4 血清miR-493水平與血管生長(zhǎng)因子、炎性因子的相關(guān)性 經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)治療前血清miR-493水平與ACI患者VEGF、Ang-2、CRP、IL-6水平間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.565、-0.529、-0.475、-0.634，P<0.05)。

2.5 不同預(yù)后患者血清miR-493水平比較 溶栓治療3個(gè)月后，研究組預(yù)后良好患者51例，預(yù)后不良患者19例；預(yù)后良好患者治療前、治療后3 d、7 d血清miR-493水平均較預(yù)后不良患者高(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 研究組不同預(yù)后患者血清miR-493水平比較

2.6 血清miR-493預(yù)測(cè)ACI預(yù)后的價(jià)值 以預(yù)后不良患者為陽(yáng)性樣本，預(yù)后良好患者為陰性樣本，繪制治療前、治療后3 d、7 d血清miR-493預(yù)測(cè)ACI患者溶栓治療預(yù)后為不良的ROC曲線(xiàn)，結(jié)果顯示其預(yù)測(cè)曲線(xiàn)下面積(Area under the curve，AUC)分別為0.748、0.851、0.879，其中治療后7 d血清miR-493預(yù)測(cè)的AUC最大(見(jiàn)圖1)。

3 討 論

ACI是由供血不足引起局部腦組織缺血缺氧導(dǎo)致的一系列神經(jīng)功能障礙癥狀，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，涉及動(dòng)脈粥樣硬化、血管新生、炎癥反應(yīng)等多方面[10]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外大量研究[11,12]指出，miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，具有組織特異性及相對(duì)穩(wěn)定性高、體液豐度高的特點(diǎn)，參與腦梗死等多種疾病的發(fā)生發(fā)展。

相關(guān)動(dòng)物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死后miR-493表達(dá)明顯降低，其表達(dá)下調(diào)可負(fù)向調(diào)控巨噬細(xì)胞游走抑制因子的下游AKT、ERK通路，從而促進(jìn)梗死周?chē)苄律?，并指出miR-493可作為腦梗死后治療的新靶點(diǎn)[13]。但miR-493在ACI患者血清中的表達(dá)水平如何，截至目前尚無(wú)研究報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)ACI患者急性期血清miR-493水平明顯低于健康人群，而阿替普酶靜脈溶栓治療后3 d、7 d，血清miR-493水平呈逐漸升高趨勢(shì)，但均未恢復(fù)至正常水平。提示miR-493在ACI急性期的表達(dá)水平明顯降低，阿替普酶靜脈溶栓治療后患者血清miR-493水平逐漸上調(diào)。本研究通過(guò)相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)ACI患者治療前血清miR-493水平與神經(jīng)功能缺損程度呈負(fù)相關(guān)，即患者神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重，miR-493表達(dá)的抑制作用越大，血清miR-493水平越低。

本研究還發(fā)現(xiàn)，ACI患者治療前血清miR-493水平與VEGF、Ang-2間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。其中VEGF是血管新生的關(guān)鍵因子，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有較強(qiáng)的特異性親和作用，在機(jī)體血管生成的環(huán)節(jié)中起著不可替代的作用[14]。國(guó)外一項(xiàng)薈萃分析[15]顯示，缺血性腦卒中患者的血清VEGF水平明顯升高，且不同的檢測(cè)天數(shù)不會(huì)顯著影響其血清濃度。國(guó)內(nèi)學(xué)者陳亞男等[16]研究指出，VEGF是ACI患病后血管新生的重要因子，具有擴(kuò)張血管、增加血管通透性等多種生物學(xué)活性，從而促進(jìn)梗死部位血流恢復(fù)，改善神經(jīng)功能的作用。Ang-2同樣具有促進(jìn)血管新生的作用，在腦梗死患病急性期其表達(dá)水平較高，與VEGF可發(fā)揮協(xié)同作用，共同促進(jìn)血管重塑或新生[17]。ACI發(fā)生后，患者梗死腦部處于缺血缺氧狀態(tài)，在低氧、炎癥等因素刺激下，機(jī)體為保護(hù)腦組織大量釋放VEGF、Ang-2，二者含量增加均可促進(jìn)梗死部位及其周?chē)苌?，進(jìn)而提高血流灌注水平，促進(jìn)損傷神經(jīng)元細(xì)胞的修復(fù)和再生[18,19]。筆者認(rèn)為，隨著患者病情加重，miR-493表達(dá)的抑制作用越大，其表達(dá)下調(diào)可上調(diào)巨噬細(xì)胞游走抑制因子的下游AKT、ERK通路。而AKT、ERK通路是目前研究血管內(nèi)皮細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程的主要途徑，其相關(guān)蛋白激酶的活性越強(qiáng)，提示VEGF濃度越高[20]。據(jù)此推測(cè)血清miR-493水平降低可負(fù)向調(diào)節(jié)VEGF、Ang-2的生成。

然而，血清miR-493水平越低提示患者神經(jīng)根腦損傷越嚴(yán)重，雖然血清VEGF、Ang-2水平較高，可促進(jìn)血管新生，改善局部血流灌注，但部分神經(jīng)根腦損傷是不可逆的。且本研究結(jié)果顯示血清miR-493水平與血清CRP、IL-6水平同樣存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，可見(jiàn)ACI急性期血清miR-493水平越低，患者炎癥反應(yīng)越嚴(yán)重，而炎癥可加重神經(jīng)根腦損傷，影響患者預(yù)后[21]。因此本研究結(jié)果中預(yù)后良好ACI患者的治療前、治療后3 d、7 d血清miR-493水平均高于預(yù)后不良患者。基于上述研究結(jié)果，本研究認(rèn)為ACI患者急性期血清miR-493水平與患者預(yù)后有關(guān)，可能對(duì)預(yù)后情況進(jìn)行預(yù)測(cè)，進(jìn)一步通過(guò)ROC曲線(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)治療前、治療后3 d、7 d血清miR-493預(yù)測(cè)ACI患者溶栓治療預(yù)后為不良的AUC均在0.7以上，其中治療后7 d血清miR-493預(yù)測(cè)的AUC達(dá)到0.879，預(yù)測(cè)效能較高，可為臨床早期預(yù)測(cè)患者預(yù)后轉(zhuǎn)歸方向提供一定參考。

綜上可知，ACI患者急性期血清miR-493表達(dá)水平明顯降低，其表達(dá)水平與患者神經(jīng)功能缺損程度、血清血管生長(zhǎng)因子、炎性因子水平密切相關(guān)，且能輔助臨床預(yù)測(cè)患者溶栓治療預(yù)后情況。但本研究未進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪(fǎng)，且樣本量有限，一定程度上限制了研究結(jié)果的泛化，仍需通過(guò)大樣本的前瞻性研究進(jìn)一步驗(yàn)證。