胱抑素C對缺血再灌注損傷大鼠腦水腫和微血管的影響

陳 萌, 梁秀軍， 王江南， 馬凱旋

腦血管疾病是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，該病嚴(yán)重威脅人類的健康。它的基本病理變化是發(fā)生腦缺血再灌注損傷，損傷后血腦屏障(blood brain-barrier,BBB)通透性增高，導(dǎo)致血漿蛋白和水分外滲引起血管源性腦水腫和繼發(fā)性出血改變[1,2]。有研究表明BBB的通透性和基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinases-2,MMP-2)之間存在密切的關(guān)系[3]。血腦屏障的完整性是防止血管源性腦水腫的基礎(chǔ)，如果BBB的結(jié)構(gòu)和功能失調(diào)將導(dǎo)致繼發(fā)的細(xì)胞外腦水腫[4,5]。水通道蛋白4(aquaporin,AQP4)是腦內(nèi)最主要的特異性水通道蛋白，與滲透壓調(diào)節(jié)、腦脊液的重吸收和腦水腫形成的生理、病理過程密切相關(guān)[6]。近年來發(fā)現(xiàn)胱抑素C(cystatin C,Cys C)參與了腦血管系統(tǒng)的病理和生理過程[7]。因此，本研究設(shè)計動物實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用Cys C干預(yù)腦缺血再灌注大鼠，觀察效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理 成年雄性SPF級SD大鼠100只，體質(zhì)量260～280 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXK(京)2016-0011。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組、Cys C低、中、高濃度組，每組20只。所有大鼠術(shù)前禁食12 h，Cys C組于術(shù)前60 min鼠尾靜脈分別注射Cys C(2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L)，假手術(shù)組和缺血再灌注組注射等量生理鹽水。

1.2 藥品與試劑 藥物Cys C(Enzo life Sciences，瑞士)，兔抗AQP4多克隆抗體(Santa Cruz，美國)，兔抗MMP-2多克隆抗體(Arigo，臺灣)，小鼠抗β-actin抗體(北京中杉金橋公司)，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG(KPL，美國)，HRP標(biāo)記的羊抗小鼠抗體(北京中杉金橋公司)，BCA蛋白定量試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)，兔SP檢測試劑盒、PBS緩沖液干粉(北京索萊寶生物科技有限公司)，檸檬酸鹽修復(fù)液(北京中杉金橋公司)。ECL Western blot發(fā)光液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)。2636A4型線拴(北京泰科蘭博生物技術(shù)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動物模型制備 各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉后固定在手術(shù)臺上。缺血再灌注組和Cys C各組采用Zea-Longa改良線栓法[8]制備右側(cè)局灶性腦缺血再灌注損傷模型。假手術(shù)組僅分離頸總、頸內(nèi)和頸外動脈，不插入線拴。術(shù)后大鼠單籠飼養(yǎng)，燈照保暖。缺血2 h后拔出線拴至頸外動脈殘端實(shí)現(xiàn)再灌注，各組大鼠于再灌注24 h后進(jìn)行取材。術(shù)后大鼠出現(xiàn)右眼瞼下垂，行走時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈或傾倒，提尾時左前肢屈曲內(nèi)收為模型成功標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2 腦組織含水量測定 采用干濕重法。每組取6只大鼠麻醉后迅速取腦，去除小腦和腦干后，分別處理右側(cè)大腦。用電子天平秤其濕重后，置于60 ℃烤箱中烤干至恒重，腦組織含水量計算公式：(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.3 BBB通透性測定 采用伊文思藍(lán)(EB)作為示蹤劑測BBB的損傷程度。各組取6只大鼠，經(jīng)大鼠尾靜脈注入2%的EB(2 ml/kg)，大鼠球結(jié)膜、皮膚等部分變藍(lán)表示注射成功。取缺血再灌注側(cè)腦組織秤濕重后放入甲酰胺溶液(每100 mg腦組織加入1 ml 甲酰胺)中，60 ℃水浴孵育24 h，取出5000 r/min 離心20 min，取上清10000 r/min再次離心10 min，取上清200 μl加入酶標(biāo)板測定其630 nm處的吸光度。甲酰胺溶液做空白對照，腦組織EB含量計算公式：腦組織EB含量(μg/g腦組織)=待測樣品EB含量(μg/ml)×甲酰胺量(ml)/腦濕重(g)，待測樣品EB含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求得。

1.3.4 Western blot檢測損傷腦皮質(zhì)組織中AQP4蛋白表達(dá) 將每組3只大鼠用10 %水合氯醛(300 mg/kg)麻醉后于冰上切取損傷側(cè)腦皮質(zhì)組織，Sham組取同側(cè)對應(yīng)部位新鮮腦皮質(zhì)組織。加入1 ml RIPA裂解緩沖液，冰上勻漿，12000 r/min離心15 min，取上清。BCA法蛋白定量，計算蛋白濃度。蛋白定量后按照4∶1加入5×SDS buffer，95 ℃煮沸5 min 變性，迅速冰浴，-80 ℃保存。每孔40 μg蛋白上樣，經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加入TBST稀釋的一抗：兔抗AQP4(1∶1000)、小鼠抗β-actin(1∶1000)，4 ℃孵育過夜。次日洗膜后分別加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶5000)和羊抗小鼠(1∶2000)室溫孵育1 h。將顯色劑按說明書比例配制，振蕩器搖勻，顯影，以β-actin作為內(nèi)參照。應(yīng)用Image-Pro-Plus 6.0軟件分析目的條帶的灰度值，以AQP4條帶與對應(yīng) β-actin條帶的積分光密度(Integral optical density,IOD)比值作為AQP4蛋白的相對表達(dá)量。

1.3.5 免疫組化法檢測腦皮質(zhì)組織MMP-2的表達(dá) 每組3只大鼠用4%多聚甲醛固定大腦24 h，腦組織常規(guī)石蠟包埋后冠狀切片(片厚5 μm)。按照試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用稀釋液將一抗兔抗MMP-2多克隆抗體按(1∶100)稀釋，滴加稀釋的一抗37 ℃ 孵育1 h。PBS洗滌3次，每次2 min。滴加Bio-羊抗兔IgG工作液，37 ℃ 孵育30 min。PBS洗3次，每次2 min。滴加鏈霉親和素-POD工作液，37 ℃ 孵育30 min。PBS洗4次，每次5 min。DAB室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時間。蒸餾水洗終止反應(yīng)。顯微鏡下觀察并拍攝5個400倍互不重疊視野的照片，Image-Pro Plus 6.0軟件圖像分析，免疫反應(yīng)強(qiáng)度以平均光密度(OD)值表示。

1.3.6 透射電下觀察大鼠血腦屏障超微結(jié)構(gòu) 取大鼠右側(cè)損傷腦皮質(zhì)細(xì)切成1 mm3的小塊，投入到預(yù)冷的3.1%戊二醛固定液中前固定2 h，緩沖液漂洗后浸入后固定液中1.5 h。常規(guī)透射電鏡生物樣品處理。超薄切片機(jī)下切取厚度為70 nm的薄片。醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀察各組大鼠腦皮質(zhì)血腦屏障的超微結(jié)構(gòu)。

1.3.7 掃描電鏡下觀察大鼠腦皮質(zhì)毛細(xì)血管表面形貌 取右側(cè)腦組織行冠狀切，取10 mm左右的厚片用緩沖液充分漂洗后梯度脫水。經(jīng)叔丁醇干燥后離子濺射鍍膜，在掃描電鏡下觀察各組大鼠腦組織的毛細(xì)血管開放情況及其周圍組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié) 果

2.1 Cys C對缺血再灌注大鼠腦組織含水量的影響 缺血再灌注組大鼠腦組織含水量較假手術(shù)組明顯增加(P<0.01)；Cys C低、中濃度組腦組織含水量較缺血再灌注組有顯著減少(P<0.01)，而Cys C高濃度組含水量較低、中組明顯增加(見表1)。

表1 各組大鼠腦組織含水量、EB含量的比較

2.2 Cys C對缺血再灌注大鼠腦組織BBB通透性的影響 缺血再灌注組大鼠BBB通透性較假手術(shù)組顯著增高(P<0.01)；Cys C低、中濃度組大鼠BBB通透性較缺血再灌注組明顯降低(P<0.01)，而Cys C高濃度組BBB通透性明顯增高(P<0.01)(見表1)。

2.3 Cys C對缺血再灌注大鼠腦皮質(zhì)AQP4表達(dá)的影響 Western blot 結(jié)果顯示：假手術(shù)組有少量AQP4表達(dá)(0.88±0.08)，缺血再灌注組AQP4表達(dá)為(1.77±0.12)，較假手術(shù)組顯著升高(P<0.01)；Cys C低、中濃度組AQP4表達(dá)分別為(1.33±0.06)、(1.20±0.06)，較缺血再灌注組明顯降低(P<0.01)；而Cys C高濃度組AQP4表達(dá)(1.62±0.11)，較低、中濃度組明顯增高(P<0.01)(見圖1)。

圖1 各組大鼠腦皮質(zhì)組織AQP4 蛋白印跡結(jié)果

2.4 Cys C對缺血再灌注大鼠腦皮質(zhì)組織MMP-2表達(dá)的影響 免疫組化染色顯示陽性為細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒，主要表達(dá)于纖維母細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的胞漿和近胞膜處。檢測各組腦皮質(zhì)組織MMP-2表達(dá)的OD值，缺血再灌注組MMP-2表達(dá)的OD值為0.242±0.013，明顯高于假手術(shù)組0.156±0.008；Cys C低、中濃度組MMP-2表達(dá)的OD值較缺血再灌注組有不同程度的降低，分別為0.201±0.011和0.179±0.009，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而Cys C高濃度組MMP-2的OD值為0.248±0.024，較低、中濃度組明顯增高(P<0.05)(見圖2)。

A：假手術(shù)組；B：缺血再灌注組；C：Cys C低濃度組；D：Cys C中濃度組；E：Cys C高濃度組圖2 各組大鼠腦皮質(zhì)MMP-2免疫組化染色結(jié)果(×400)

2.5 Cys C對缺血再灌注大鼠BBB形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 假手術(shù)組毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞呈扁平梭形，其核膜、核仁形態(tài)規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)密度均一?；ね暾?、清晰，厚薄均勻；缺血再灌注組有毛細(xì)血管腔明顯狹窄，周圍可見有大片胞質(zhì)溶解空白區(qū)；內(nèi)皮細(xì)胞明顯水腫，部分基膜發(fā)生溶解、疏松或分層。Cys C低濃度組較缺血再灌注組胞質(zhì)溶解空白區(qū)明顯減少，毛細(xì)血管基膜溶解有明顯的改善，部分內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生水腫；Cys C中濃度組毛細(xì)血管較為通暢，內(nèi)皮細(xì)胞稍有水腫，管腔中可見有紅細(xì)胞。而Cys C高濃度組毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞大量溶解，殘存的內(nèi)皮細(xì)胞線粒體發(fā)生空泡變性，星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯腫脹，胞質(zhì)有大量溶解空白區(qū)(見圖3)。

A：假手術(shù)組；B：缺血再灌注組；C：Cys C低濃度組；D：Cys C中濃度組；E：Cys C高濃度組圖3 各組大鼠腦皮質(zhì)組織血腦屏障的超微結(jié)構(gòu)(×20000)

2.6 Cys C對腦缺血再灌注大鼠腦微血管開放情況的影響 假手術(shù)組毛細(xì)血管基本正常開放，腦皮質(zhì)組織結(jié)構(gòu)清晰。缺血再灌注組有大片毛細(xì)血管管腔明顯閉塞，腦組織結(jié)構(gòu)紊亂損傷嚴(yán)重。Cys C低、中濃度組毛細(xì)血管張開數(shù)量較缺血再灌注組明顯增多且較為通暢，腦組織損傷程度較缺血再灌注組有明顯改善。而Cys C高濃度組大部分毛細(xì)血管管腔閉合，僅少數(shù)開放，腦皮質(zhì)組織結(jié)構(gòu)較為紊亂(見圖4)。

A：假手術(shù)組；B：缺血再灌注組；C：Cys C低濃度組；D：Cys C中濃度組；E：Cys C高濃度組圖4 各組大鼠腦組織微血管的超微結(jié)構(gòu)(×500)

3 討 論

AQP4存在于腦組織星形膠質(zhì)細(xì)胞的表面，而星形膠質(zhì)細(xì)胞也是構(gòu)成血腦屏障的主要細(xì)胞。所以AQP4是介導(dǎo)水分子進(jìn)出血腦屏障的非常重要的蛋白[9]。血腦屏障的破壞程度與AQP4的表達(dá)上調(diào)密切相關(guān)。AQP4的表達(dá)增強(qiáng)是膠質(zhì)細(xì)胞的適應(yīng)性反應(yīng)，促進(jìn)了血管源性腦水腫的發(fā)生。王秀輝[10]等在研究大鼠腦缺血/再灌注后AQP4的表達(dá)與腦水腫的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)：24 h內(nèi)隨著時間的推移，AQP4表達(dá)水平不斷升高，24 h達(dá)到最高峰；而腦含水量同樣隨著時間的推移而不斷升高，并在24 h到達(dá)最高峰，兩者變化的趨勢基本一致。我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，再灌注24 h后缺血再灌注組腦皮質(zhì)組織AQP4蛋白的表達(dá)顯著升高，其腦組織含水量也有明顯增高的趨勢。在應(yīng)用不同濃度的藥物Cys C預(yù)防性處理大鼠后，Cys C低、中濃度組AQP4蛋白表達(dá)較缺血再灌注組明顯降低(P<0.01)；而Cys C高濃度組AQP4的表達(dá)較低、中組顯著增高。各組大鼠腦組織含水量的變化以及血腦屏障通透性的改變程度(EB含量)和AQP4表達(dá)的變化，它們的趨勢是基本一致的。

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一組鋅離子依賴蛋白酶，主要分為4類，其中明膠酶MMP-2、MMP-9主要降解明膠、Ⅳ型膠原等基底膜成分，參與組織損傷與修復(fù)。腦缺血再灌注后MMPs的表達(dá)增加，其中MMP-2與再灌注損傷的關(guān)系較為密切[11]。在神經(jīng)組織中MMP-2以無活性前體由血管內(nèi)皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞分泌，它的主要作用是降解腦微血管細(xì)胞外基質(zhì)，引起血腦屏障開放，通透性增加，導(dǎo)致血管源性腦水腫的出現(xiàn)[12]。Rosenberg[13]等研究證實(shí)，MMP-2和MMP-9的水解作用可破壞毛細(xì)血管緊密連接和基底膜的蛋白，這可能是其血腦屏障通透性增加的主要原因。

Cys C是一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，在體內(nèi)發(fā)揮著非常廣泛的作用；多種實(shí)驗(yàn)表明外源性補(bǔ)充Cys C對腦卒中具有預(yù)防及潛在的治療價值[14]。但是提高溶酶體內(nèi)Cys C的含量及活性必須把它控制在一個安全的范圍內(nèi)，才能將該藥應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也顯示：給予缺血再灌注損傷大鼠預(yù)防性注射低、中濃度的Cys C可以抑制MMP-2和AQP4的表達(dá)，使腦組織水腫的程度減輕，毛細(xì)血管開放的數(shù)量明顯增多；而高濃度的Cys C 使損傷腦皮質(zhì)組織MMP-2和AQP4的表達(dá)明顯增強(qiáng)，腦組織的含水量顯著增多，毛細(xì)血管管腔大多閉合。因此，Cys C在一定濃度范圍內(nèi)干預(yù)可減輕腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致的腦水腫，其發(fā)生機(jī)制可能與AQP4蛋白表達(dá)降低及MMP-2蛋白表達(dá)OD值減少有一定的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)從形態(tài)學(xué)的角度也加以證實(shí)。若該藥物應(yīng)用有效濃度來預(yù)防臨床腦水腫等相應(yīng)疾病，還需要增加其他指標(biāo)的檢測進(jìn)行綜合性的評價。