重組人AMH對卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響*

司秀文 羅麗卿 宋向芹 陳洪娜

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1 檢驗(yàn)科 2 血液科，山東省濱州市 256603

卵巢癌是女性生殖器官中最常見的惡性腫瘤之一[1-2]，可發(fā)生于任何年齡，其組織學(xué)類型多樣，卵巢腫瘤主要來源于卵巢上皮細(xì)胞，其惡性腫瘤稱為上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer,EOC)。在婦科惡性腫瘤中，卵巢癌是致死率最高的惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮體癌。由于早期其無癥狀發(fā)展，不易發(fā)現(xiàn)，確診時(shí)大部分患者已是晚期(Ⅲ期或Ⅳ期),錯(cuò)過了最佳的手術(shù)時(shí)間，預(yù)后很差[3-4]。盡管卵巢癌對基于鉑類化合物和紫杉類化合物等的一線化療藥物反應(yīng)良好，但大多數(shù)患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或者呈現(xiàn)化療耐藥[5-6]。對于大多數(shù)癌癥而言，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是患者死亡的一大特征。有研究表明，重組人AMH可抑制乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌等細(xì)胞的增殖[7],本實(shí)驗(yàn)研究重組人AMH對人卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響，為卵巢癌診斷和治療提供新的思路，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)中心)；Gibco公司的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基；杭州四季青公司的胎牛血清；R&D公司的重組AMH抗原；Corning公司的Transwell小室。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)條件：溫度為37℃、飽和濕度、細(xì)胞培養(yǎng)箱CO2濃度為5%、培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，熒光顯微鏡高倍鏡下觀察細(xì)胞的生長情況。當(dāng)細(xì)胞生長到融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，用0.25%胰酶消化細(xì)胞并傳代培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞創(chuàng)傷愈合試驗(yàn)檢測卵巢癌細(xì)胞遷移能力 通過預(yù)實(shí)驗(yàn)得出濃度為200nmol/L重組人AMH對SKOV3細(xì)胞的抑制率可達(dá)到65%，選擇將濃度是200nmol/L重組人AMH 1ml加入培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)48h，經(jīng)處理的卵巢癌細(xì)胞株SKOV3作為觀察組，未經(jīng)重組人AMH處理的卵巢癌細(xì)胞株作為陰性對照組，兩組細(xì)胞分別接種6孔板中，每組平行3個(gè)孔，在顯微鏡下觀察，待細(xì)胞生長至平鋪滿地板時(shí)，用加樣槍把孔板中的培養(yǎng)液吸去，再用PBS沖洗細(xì)胞3次，用100μl加樣槍的槍尖在融合至完全的單層細(xì)胞中間劃“(每孔5×105個(gè)細(xì)胞)一字形”的創(chuàng)傷，此為細(xì)胞創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)的模型。每組每個(gè)標(biāo)本做3個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行劃痕后，顯微鏡下觀察并記錄劃痕區(qū)間的距離，用PBS溶液沖洗3次，再用低血清濃度的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。在劃痕0h、24h、48h分別在200倍鏡下拍照，并用專門的電子尺軟件計(jì)算劃痕細(xì)胞兩側(cè)的距離，根據(jù)遷移速度=遷移距離/遷移時(shí)間計(jì)算出遷移速度，比較觀察組和對照組兩組細(xì)胞的遷移能力。

1.4 Transwell小室體外細(xì)胞侵襲試驗(yàn)檢測卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力 用Transwell培養(yǎng)小室對卵巢癌細(xì)胞的體外侵襲能力進(jìn)行檢測。將基質(zhì)膠Matrigel放于4℃冰箱過夜解凍，在24孔板中放入配套的Transwell小室，每個(gè)小室加稀釋好的基質(zhì)膠60μl，放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中，孵育5h，形成人工基底膜。每組平行3個(gè)小室。分別接種重組人AMH處理48h后的細(xì)胞和未處理的陰性對照細(xì)胞100μl(調(diào)整細(xì)胞密度5×105/ml)于小室上室，下室中加入600μl含20%胎牛血清的DMEM，把接種后的小室置于37℃、5%CO2濃度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。從24孔板中取出小室，PBS沖洗2遍，用棉簽小心擦去小室微孔膜上層內(nèi)的細(xì)胞，將小室倒置風(fēng)干，用結(jié)晶紫染色15min，顯微鏡下取10個(gè)視野，拍照，計(jì)數(shù),取平均值。計(jì)算相對侵襲指數(shù)：V2/V1。V2是觀察組中穿過小室基質(zhì)膜的細(xì)胞個(gè)數(shù)，V1是陰性對照組中穿過小室基質(zhì)膜的細(xì)胞個(gè)數(shù)。每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果

2.1 重組人AMH 對卵巢癌細(xì)胞SKOV3遷移能力的影響分析 創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)中觀察組細(xì)胞進(jìn)入劃痕區(qū)域的細(xì)胞數(shù)目少，遷移速度慢，觀察組細(xì)胞遷移速度為(2.99±0.04)μm/h,顯著慢于陰性對照組的(9.02±0.06)μm/h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=244，P=0.01)。見圖1。

圖1 重組人AMH對卵巢癌細(xì)胞遷移的影響

2.2 重組人AMH 對卵巢癌細(xì)胞SKOV3侵襲能力的影響 Transwell小室體外細(xì)胞侵襲試驗(yàn)顯示觀察組細(xì)胞相對侵襲指數(shù)為0.38±0.03，與對照組相比，結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=40,P=0.01)。見圖2。侵襲實(shí)驗(yàn)中，用結(jié)晶紫染色后(圖3)，觀察組細(xì)胞穿過膜的數(shù)目為(15.00±1.00)個(gè)，明顯少于陰性對照組的(39.70±1.50)個(gè)。

圖2 重組人AMH對卵巢癌細(xì)胞侵襲的影響

圖3 重組人AMH對卵巢癌細(xì)胞侵襲的影響

3 討論

卵巢癌是常見的婦科致死率較高的惡性腫瘤之一[8]，常發(fā)生于圍絕經(jīng)期婦女,預(yù)后較差。由于缺乏典型的早期癥狀和有效的診斷方法，在超過70%的病例中，卵巢癌患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)是晚期[9]，此時(shí)進(jìn)行手術(shù)治療和化療，不能達(dá)到較好的效果。卵巢癌死亡率與診斷分期密切相關(guān),致死率在婦科癌癥中居首位。目前，對于卵巢癌的治療以手術(shù)治療為主，化療和放療為輔。而化療通常不良反應(yīng)較大，患者往往難以忍受，同時(shí)化療后腫瘤復(fù)發(fā)率較高，所以尋求新的治療方法和藥物是臨床研究的熱點(diǎn)。而腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移往往是患者死亡的一個(gè)主要原因，腫瘤是否出現(xiàn)轉(zhuǎn)移是臨床決定治療方案和評估判斷預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。腫瘤細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力是其轉(zhuǎn)移的一個(gè)關(guān)鍵要素。腫瘤轉(zhuǎn)移指腫瘤從母體、原發(fā)病灶，通過各種途徑，如血液途徑、淋巴途徑、種植轉(zhuǎn)移、直接蔓延轉(zhuǎn)移到其他地方。腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲過程是一個(gè)復(fù)雜的多因素參與的過程。因此，探索卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲作用機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)，提高患者的生存率，改善患者的生存質(zhì)量有著極其重要的臨床意義[10]。

AMH屬于轉(zhuǎn)化生長因子β超家庭成員之一，是由二硫鍵連接而成的相對分子質(zhì)量為140 000的糖蛋白，其基因位于人的19號染色體短臂上，在人體內(nèi)的半衰期大約為28h，完全清除大約需要8d，在性腺發(fā)育和性別分化過程中起著重要的作用。AMH也稱作苗勒管抑制物質(zhì)(MIS)，能夠引起苗勒管的退化，是生殖器官分化發(fā)育和卵泡發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子[11]。男性中AMH由睪丸支持細(xì)胞產(chǎn)生，促使胚胎中的苗勒管退化，形成男性正常生殖系統(tǒng)，同時(shí)參與精子的形成。女性中AMH主要由卵巢中的初級卵泡分泌產(chǎn)生。AMH受體主要有2類受體，抗苗勒管激素受體Ⅰ(AMHRⅠ)和抗苗勒管激素受體Ⅱ(AMHRⅡ)，AMH受體在子宮、卵巢等苗勒管起源的組織器官中呈現(xiàn)高水平表達(dá)。AMH主要通過自分泌和旁分泌，主要通過結(jié)合Ⅱ型受體發(fā)揮生物學(xué)作用。AMH濃度含量呈現(xiàn)特征性變化，在女性出生時(shí)濃度含量較低，之后含量逐漸升高，達(dá)到青春期后呈現(xiàn)一個(gè)平臺期持續(xù)到25歲，之后含量逐漸下降。目前研究的AMH臨床應(yīng)用較多。精漿中AMH濃度與精子的活力有一定的相關(guān)性，可作為男性不育的一個(gè)輔助檢測指標(biāo)，為不孕癥的治療提供一個(gè)更加有效的方法。AMH可預(yù)測卵巢的儲備能力，能夠預(yù)測了解女性的生育功能，預(yù)測女性的絕經(jīng)年齡。AMH在多囊卵巢綜合征患者中呈現(xiàn)高水平表達(dá)，在卵巢早衰患者中呈現(xiàn)低水平表達(dá)，可作為其診斷的一個(gè)輔助指標(biāo)。

近年來，更多的研究著重在AMH與婦科腫瘤之間的關(guān)系。在女性婦科腫瘤中可以檢測到AMHR的存在，研究表明AMH與卵巢顆粒細(xì)胞瘤的相關(guān)性最強(qiáng)。Dogan等[12]研究結(jié)果表明血清中AMH濃度在子宮內(nèi)膜癌患者和對照組中無明顯差異，與腫瘤的分期和組織學(xué)類型無關(guān)，而在腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移后，AMH水平呈現(xiàn)增高。AMH在上皮性卵巢癌中研究表明AMH與上皮性卵巢癌也有一定的相關(guān)性。有研究表明，AMH在子宮內(nèi)膜異位癥中能夠抑制細(xì)胞周期和抑制細(xì)胞凋亡[13]。Stephen等[14]研究表明短時(shí)間內(nèi)(1～3周)經(jīng)腸外給予高純度的重組人AMH藥對卵巢癌有一定的抑制性作用，為AMH可作為卵巢癌的腸外治療藥物提供了有力的臨床實(shí)驗(yàn)證據(jù)。Pieretti-Vanmarcke等[15]研究結(jié)果表明檢測 rhAMH 對轉(zhuǎn)基因卵巢癌小鼠模型及從其腹水中 提取的 AMHRⅡ陽性細(xì)胞系的作用，再次驗(yàn)證了重組人 AMH體內(nèi)外對卵巢癌細(xì)胞有一定的抑制作用，同時(shí)治療周期長達(dá)20周，證明了重組人AMH 的相對無害性和安全性。Zhang等[16]用重組人AMH處理培養(yǎng)人上皮性卵巢癌細(xì)胞系 OVCAR3和 OVCAR8，研究結(jié)果表明重組人AMH 能夠通過阻滯細(xì)胞周期G1/S期抑制其卵巢癌細(xì)胞的增殖，通過減少腫瘤干細(xì)胞因子的分泌誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的凋亡。肖蘭等[17]研究表明用重組人抗苗勒管激素干預(yù)卵巢癌細(xì)胞株OVCAR8和OVCAR3，能夠抑制表達(dá)AMHR的卵巢癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其細(xì)胞凋亡。

本研究通過構(gòu)建細(xì)胞創(chuàng)傷模型檢測重組人AMH對卵巢癌細(xì)胞的遷移能力的影響。把AMH作為一種新的卵巢癌治療的靶點(diǎn)治療方法研究，其優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在：AMH受體在體內(nèi)表達(dá)較少，相對副作用較小；一些患者呈現(xiàn)對化療藥物的耐藥，如果給予AMH治療，可能達(dá)到較好的效果。人體內(nèi)本身就存在一定量的AMH物質(zhì)，給予其AMH治療，相對本身來說不屬于外源物質(zhì)，不良反應(yīng)相對較少。本研究遷移能力試驗(yàn)結(jié)果顯示，觀察組細(xì)胞在48h細(xì)胞劃痕的愈合程度低于陰性對照組細(xì)胞，表明觀察組細(xì)胞的遷移能力明顯低于對照組細(xì)胞。本文研究通過構(gòu)建Transwell小室侵襲模型檢測重組人AMH對卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果顯示觀察組穿過膜的細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組。計(jì)算其相對侵襲指數(shù)，觀察組細(xì)胞和對照組細(xì)胞結(jié)果有顯著差異，表明重組人AMH能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲，為卵巢癌的臨床治療和預(yù)后提供一個(gè)理論依據(jù)和一個(gè)新思路，AMH在卵巢癌治療方面有著較好的應(yīng)用前景，但是具體的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。