一例牛支原體肺炎的診斷報(bào)告

王金含 吳翠蘭 岑敏 馬宇毅 班雪花 李軍*

（1，廣西田東縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 531500；2，廣西獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 530001）

牛支原體最早于1961 年被確認(rèn)為感染牛的病原體[1]。2008 年，我國首次從疑似肺炎牛的肺部分離出牛支原體[2]。支原體沒有細(xì)胞壁，取而代之的是具有不同表面脂蛋白的細(xì)胞膜。它們用于生物附著并引起宿主的各種免疫反應(yīng)。生物體也可以在生物膜中產(chǎn)生并存活，正是這種加上宿主免疫反應(yīng)的可變逃避，使生物體得以存活并引起疾病[3]。牛支原體能引起牛的肺炎、關(guān)節(jié)炎、乳腺炎等疾病，危害養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展[4]。

2021 年4 月，廣西某牛場(chǎng)從外省引進(jìn)一批牛，7～14d 后牛群發(fā)病，表現(xiàn)為咳嗽、流鼻涕、溫度升高到42℃等癥狀，養(yǎng)殖戶用抗生素和葡萄糖生理鹽水進(jìn)行用藥治療，未見效果，隨后有2 頭牛出現(xiàn)死亡。對(duì)病死牛進(jìn)行解剖，有肺部和胸部粘連、肺部有壞死灶等癥狀。經(jīng)臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，確診該病例為牛支原體引起的，現(xiàn)將診斷結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)室診斷

1.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

無菌采取病死牛的肺臟血瓊脂平板，放置37℃培養(yǎng)12～48h 后觀察細(xì)菌生長情況。

1.2 支原體分離培養(yǎng)

采取肺臟組織研磨過濾，按照10%的接種量將濾液接種到PPLO 支原體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)4d，然后將其接種于支原體固體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)4d，觀察菌落形態(tài)。

1.3 PCR 擴(kuò)增

將采集病死牛的肺等器官進(jìn)行研磨。用基因組RNA/DNA提取試劑盒進(jìn)行提取病料的RNA/DNA，然后用特異性引物進(jìn)行RT-PCR/PCR 檢測(cè)牛支原體、化膿隱秘桿菌、多殺巴氏桿菌、溶血曼氏桿菌、牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛冠狀病毒、牛副流感病毒3 型、牛病毒性腹瀉病毒等8 種病原，電泳觀察結(jié)果。

1.4 藥敏試驗(yàn)

選擇多西環(huán)素、氟苯尼考、林可霉素、阿莫西林、環(huán)丙沙星、替米考星、頭孢拉定、頭孢噻肟、恩諾沙星、氧氟沙星、加米霉素、馬波沙星等12 種藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定

肺臟組織在血平板接種24～48h 后未見有菌落生長。

2.2 支原體分離培養(yǎng)

接種的PPLO 支原體培養(yǎng)由玫瑰色變?yōu)殚偌t色。支原體固體培養(yǎng)基上生長針尖樣菌落，采用光學(xué)顯微鏡觀察，可見到“煎蛋樣”菌落，如附圖。

附圖 “煎蛋”樣菌落（4×）

2.3 PCR 擴(kuò)增

經(jīng)過采用RT-PCR/PCR 檢測(cè)牛支原體、化膿隱秘桿菌、多殺巴氏桿菌、溶血曼氏桿菌、牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛冠狀病毒、牛副流感病毒3 型、牛病毒性腹瀉病毒等8 種病原，結(jié)果顯示，只有牛支原體引物擴(kuò)增與之相符的條帶大小。

2.4 藥敏試驗(yàn)

從藥敏試驗(yàn)結(jié)果可知，該支原體對(duì)加米霉素、馬波沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星敏感；對(duì)多西環(huán)素、氟苯尼考、林可霉素、阿莫西林、替米考星、頭孢拉定、頭孢噻肟耐藥。

3 小結(jié)與討論

（1）本次通過發(fā)病情況、解剖癥狀、細(xì)菌分離鑒定、支原體分離培養(yǎng)、PCR 擴(kuò)增等方法確診該病例是由牛支原體感染引起的。

（2）以呼吸道癥狀發(fā)病的病因有很多，主要由病毒（如牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛副流感病毒3 型、牛冠狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒等）、細(xì)菌（如化膿隱秘桿菌、多殺巴氏桿菌、溶血曼氏桿菌等）、支原體、寄生蟲單獨(dú)或混合感染及交通運(yùn)輸壓力、飼舍衛(wèi)生等因素均可引起牛呼吸系統(tǒng)疾病[5,6]。本病例的發(fā)生主要有2 個(gè)方面的因素，一是該批牛是從外省引入，經(jīng)過長途運(yùn)輸，機(jī)體抵抗力有所下降，易引發(fā)疾??；二是廣西處于亞熱帶地區(qū)，受季風(fēng)氣候的影響，廣西4 月天氣潮濕溫?zé)?，更易引起牛呼吸道病。而本次試?yàn)對(duì)多種病原進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，只檢測(cè)出牛支原體，說明該病例是由牛支原體感染引起。

（3）牛支原體的實(shí)驗(yàn)室診斷包括血清學(xué)、病原學(xué)和分子學(xué)。血清學(xué)常用于流行病學(xué)調(diào)查和初步診斷，而酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是牛支原體流行病學(xué)調(diào)查中應(yīng)用最廣泛的血清學(xué)方法之一。但不同試劑盒的特異性和準(zhǔn)確性存在一些差異。病原菌分離培養(yǎng)方法直觀、可靠、簡潔，是診斷該病最可靠的方法，由于支原體沒有細(xì)胞壁，對(duì)培養(yǎng)條件要求比較苛刻，一般很難培養(yǎng)，而且培養(yǎng)的周期較長，耗時(shí)耗力。通常采用PCR、LAMP、高通量芯片技術(shù)可以進(jìn)行診斷，通過設(shè)計(jì)特異性引物，如uvrC 和OPPD/F 等，該方法能準(zhǔn)確、快速地鑒定牛支原體與其他支原體[7]。本次診斷通過采用支原體分離培養(yǎng)技術(shù)和PCR 鑒別診斷技術(shù)，兩者均證實(shí)從該病例中檢測(cè)出牛支原體。

（4）近年來，隨著政府的大力支持，養(yǎng)殖規(guī)模不斷加大，隨之而來的動(dòng)物發(fā)病概率也越來越大。由于動(dòng)物發(fā)病在臨床上較為相似，很難鑒別，養(yǎng)殖者往往憑借發(fā)病癥狀盲目用藥，易導(dǎo)致細(xì)菌或支原體產(chǎn)生耐藥性。如高鐸對(duì)牛支原體分離株進(jìn)行藥敏檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牛支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥敏耐藥[8]；劉超在比利時(shí)、德國和意大利3 個(gè)國家奶牛場(chǎng)的牛奶樣品中分離了73 份牛支原體樣本，并進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，這3個(gè)國家分離的牛支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥性嚴(yán)重[9]。本研究對(duì)分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，牛支原體分離株對(duì)加米霉素、馬波沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星敏感，因此，可以篩選這5 種藥物進(jìn)行治療。通過藥敏試驗(yàn)篩選藥物可提高藥物使用率，減少耐藥株的出現(xiàn)。由于引起牛支原體肺炎的因素較多，首先，加強(qiáng)牛群引進(jìn)管理，剛引進(jìn)時(shí)避免合群混養(yǎng)；其次，堅(jiān)持自繁自養(yǎng)；第三，重視日常飼養(yǎng)管理工作，保持牛舍清潔、通風(fēng)，保證飼料的營養(yǎng)均衡；第四，加強(qiáng)疾病預(yù)防工作，應(yīng)堅(jiān)持早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的原則。