響應(yīng)面法優(yōu)化山楂果肉總黃酮閃式提取研究

趙成萍，陳勝萍，劉曉光，王文斌

（1.山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，山西 太谷 030801；2.唐山市農(nóng)業(yè)科學研究院，河北 唐山 063001）

山楂（Crataegus pinnatifidaBunge）屬于薔薇科，為中國傳統(tǒng)食、藥材［1］，含有黃酮類、三萜類、有機酸、維生素C、無機鹽等化學成分［2］，具有抗血小板聚集、增強免疫力、抗氧化、鎮(zhèn)靜、抗菌、利尿等藥理作用［3，4］。黃酮類化合物可調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝并降低血清膽固醇，改善血液循環(huán)，具有降壓作用［5-8］，以黃酮類化合物為基礎(chǔ)的研究已受到廣泛關(guān)注［9］。

關(guān)于山楂黃酮提取方法的研究報道較多［10］，常見的有溶劑浸提、超臨界萃取、超聲波輔助提取等。溶劑浸提法［11］分離效果差，效率低；超臨界萃取法［12］對溫度要求嚴格，安全性不足；超聲波輔助提取法［13］操作流程復(fù)雜，用時較長，應(yīng)用范圍有限，提取率低。閃式提取法利用機械剪切刀，在高速電機作用下切割攪拌振動材料，通過真空負壓使其化學成分充分溶解，當植物有效成分在短時間內(nèi)達到動態(tài)平衡后，通過過濾提取總黃酮。閃式提取具有用時短、效率高、適用范圍廣、操作簡單易行、使用安全可靠等優(yōu)點，且在室溫下即可進行提取，能夠保護提取物質(zhì)中的熱敏性成分［14］。

響應(yīng)面法（RSM）利用試驗獲得數(shù)據(jù)構(gòu)建多元二次回歸方程，建立響應(yīng)面回歸模型，通過對各因素分析得到最優(yōu)工藝參數(shù)。相對于正交設(shè)計方法，響應(yīng)面法預(yù)測性更好、方便簡單、節(jié)約資源，對于工藝優(yōu)化非常有效［15，16］。

本研究選取液料比、提取時間、乙醇濃度三個單因素進行山楂果肉總黃酮閃式提取試驗，利用響應(yīng)面法建立模型優(yōu)化提取工藝，提高總黃酮得率，以期為開發(fā)山楂果肉中總黃酮藥用價值奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試山楂品種為‘歪把紅’，鮮果取自山西省太谷縣三臺村。該品種果實圓形，色澤鮮紅，果肉粉紅，質(zhì)地松軟，風味優(yōu)異，總糖含量6.21%，可滴定酸含量2.44%，維生素C含量5.38 mg·kg-1，黃酮含量10.42 mg·kg-1。將新鮮山楂洗凈，去核，放入干燥箱中60℃恒溫烘干至恒重，然后粉碎機粉碎，過80目篩，儲存于干燥瓶中，4℃冰箱密封保存?zhèn)溆谩?/p>

蘆丁標準品購自國藥集團化學試劑有限公司；其余試劑均為分析純，購自天津市天力化學試劑有限公司。索氏提取器由上海爭巧科學儀器有限公司生產(chǎn)；SBZ-019型中草藥粉碎機由天津泰斯特生產(chǎn)；JHBE-50T中草藥閃式提取器由河南智晶生物科技股份有限公司生產(chǎn)；7200型紫外可見分光光度計由尤尼克（上海）儀器有限公司生產(chǎn)；CSIOII型電熱鼓風干燥箱由重慶試驗設(shè)備廠生產(chǎn)；抽濾真空泵由鄭州市亞榮儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 建立蘆丁標準曲線

用60%乙醇溶液溶解蘆丁標準品，得到0.2 mg·mL-1蘆丁標準溶液。將0、1、2、3、4、5 mL標準溶液分別轉(zhuǎn)移到25 mL容量瓶中，先后加入5%亞硝酸鈉溶液和10%硝酸鋁溶液各0.3 mL，振蕩并搖勻，靜置6 min后，加入1 mol·mL-1的氫氧化鈉溶液4 mL，振蕩搖勻，用60%乙醇溶液定容。測定510 nm處的吸光度，建立蘆丁標準曲線［17］。

1.3 總黃酮提取及含量測定

采用硝酸鋁顯色法。稱量山楂果肉粉200 g于藍蓋瓶中，分別在不同液料比、乙醇濃度、提取時間條件下進行閃式提取。將提取液移至離心杯中，然后5000 r·min-1離心15 min，取上清液4 mL于25 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，振搖后靜置6 min；加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，振蕩搖勻靜置6 min；加入1 mol·L-1氫氧化鈉溶液4 mL，振蕩搖勻，最后用60%乙醇溶液定容后靜置15 min，測510 nm處的吸光度［18］。以蘆丁作參照物計算山楂果肉總黃酮含量，按下式求出總黃酮的提取率E。

式中，C為提取液中黃酮質(zhì)量濃度（g·mL-1）；V為提取液體積（mL）；n為提取液稀釋倍數(shù)；m為稱取的山楂果肉粉末的質(zhì)量（g）；E為總提取率（%）。

1.4 單因素試驗

在電壓100 V，時間60 s，乙醇體積濃度（以下簡稱乙醇濃度）70%條件下，設(shè)置5個液料比（乙醇/山楂果肉粉，mL/g）水平（20、30、40、50、60）；在電壓100 V，液料比40，乙醇濃度70%條件下，設(shè)置5個提取時間（s）水平（60、70、80、90、100）；在電壓100 V，時間60 s，液料比40條件下，設(shè)置5個乙醇濃度（%）水平（40、50、60、70、80）。3次重復(fù)，計算山楂果肉總黃酮提取率。

采用Microsoft Excel及SPSS 17.0軟件進行標準差計算及顯著性差異分析。

1.5 響應(yīng)面試驗

以單因素試驗為基礎(chǔ)，以液料比（30、40、50）、乙醇濃度（50%、60%、70%）、提取時間（60、70、80 s）3個因素為自變量，以山楂果肉總黃酮提取率為因變量設(shè)計響應(yīng)面試驗，分析多因素交互作用，優(yōu)化提取條件，最后使用Design Expert 8.0.5軟件對3個因素進行中心組合設(shè)計［19］。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標準曲線

如圖1所示，因變量y為吸光度，自變量x為蘆丁質(zhì)量濃度（mg·mL-1），蘆丁標準曲線的回歸方程為y=8.7312x-0.0089，相關(guān)系數(shù)R2=0.9997，線性關(guān)系良好。

圖1 蘆丁標準曲線

2.2 單因素對總黃酮提取率的影響

2.2.1 液料比對總黃酮提取率的影響 由圖2可看出，在電壓、時間、乙醇濃度一定的條件下，不同液料比與山楂果肉總黃酮提取率間關(guān)系呈單峰曲線，并在液料比40時達到峰值。因此，山楂果肉總黃酮閃式提取最佳液料比為40。

圖2 液料比與總黃酮提取率關(guān)系

2.2.2 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響 由圖3可知，在電壓、提取時間、液料比一定的條件下，乙醇濃度在40%～60%之間與總黃酮提取率呈線性正相關(guān)，并在60%時達到峰值，乙醇濃度高于60%提取率呈明顯下降趨勢。由此確定60%是山楂果肉總黃酮閃式提取的最佳乙醇濃度。

圖3 乙醇濃度與總黃酮提取率關(guān)系

2.2.3 提取時間對總黃酮提取率的影響 如圖4所示，在電壓、乙醇濃度、液料比一定的條件下，在60～70 s區(qū)間，山楂果肉總黃酮提取率上升，70 s時達到峰值，之后提取率急劇下降，在80～100 s區(qū)間下降平緩。由此確定70 s是山楂果肉總黃酮閃式提取的最佳時長。

圖4 提取時間與總黃酮提取率關(guān)系

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面法試驗結(jié)果 響應(yīng)面設(shè)計不同因素及水平組合條件下的山楂果肉總黃酮提取率見表1，在提取時間70 s、乙醇濃度60%、液料比40時，山楂果肉總黃酮提取率最高，為13.746%。

表1 響應(yīng)面法試驗設(shè)計及結(jié)果

2.3.2 山楂果肉總黃酮提取率回歸模型的建立及顯著性檢驗 使用Design Expert 8.0.5軟件對表1數(shù)據(jù)進行回歸分析，建立3個因素與山楂果肉總黃酮提取率Y的二次回歸方程：

方差分析結(jié)果（表2）表明，模型顯著，失擬項不顯著，說明試驗誤差??；決定系數(shù)達0.9以上，說明模型具有較高的擬合度，可用于山楂果肉提取總黃酮的條件優(yōu)化。

表2 回歸模型顯著性檢驗和方差分析結(jié)果

回歸模型顯著性檢驗結(jié)果（表2）表明，模型中一次項A（P=0.4241）、B（P=0.6980）、C（P=0.3181）均不顯著，表明液料比、提取時間、乙醇濃度單因素對山楂果肉總黃酮的提取效果影響不顯著；二次項B2（P=0.0048）、C2（P=0.0091）表現(xiàn)為極顯著，A2（P=0.0309）表現(xiàn)為顯著，說明乙醇濃度、液料比、提取時間對山楂果肉總黃酮提取率的影響是較為復(fù)雜的二次關(guān)系，影響順序為液料比＞提取時間＞乙醇濃度。

2.4 多因素交互作用響應(yīng)面分析

由圖5可知，在液料比或乙醇濃度一定的條件下，總黃酮提取率均隨著另一個因素的增大而先升后降。乙醇濃度與料液比的等高線呈橢圓形，表明兩者交互作用顯著。從響應(yīng)面圖可知，液料比與乙醇濃度的曲線較陡，說明總黃酮提取率受兩者的交互作用影響較大。

圖5 液料比與乙醇濃度對山楂果肉總黃酮提取率交互影響的等高線圖和響應(yīng)面圖

由圖6可知，固定液料比或提取時間，總黃酮提取率都隨著另一個因素的增大而先升后降，且液料比和提取時間的等高線形狀偏圓形，說明兩者交互作用較緩和。從響應(yīng)面圖可知，液料比的曲線平緩，提取時間曲線較陡，表明兩者交互作用對總黃酮提取率有一定影響。

圖6 液料比與提取時間對山楂果肉總黃酮提取率交互影響的等高線圖和響應(yīng)面圖

由圖7可知，固定乙醇濃度或提取時間，總黃酮提取率都隨著另一個因素的增大而先升后降。乙醇濃度和提取時間等高線呈橢圓形，表明兩者交互作用顯著。從響應(yīng)面圖可以看出，乙醇濃度的曲線平緩，提取時間曲線較陡，兩者交互作用對總黃酮提取率影響較大。

圖7 乙醇濃度與提取時間對山楂果肉總黃酮提取率交互影響的等高線圖和響應(yīng)面圖

2.5 山楂果肉總黃酮最佳提取參數(shù)確定及驗證試驗分析

通過分析回歸方程，對提取率選擇Maximize模式進行優(yōu)化，得到山楂果肉總黃酮最優(yōu)提取參數(shù)：提取時間74.49 s、乙醇濃度65.88%、液料比44.49，此時，山楂果肉總黃酮提取率理論值為13.2767%。

為驗證回歸方程，設(shè)置提取時間74 s、乙醇濃度66%、液料比44，進行山楂果肉總黃酮提取率實測試驗，結(jié)果總黃酮提取率為13.3045%，與理論預(yù)測值基本一致，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計的回歸方程可以較好地反映各個因素之間的交互作用及其對山楂果肉總黃酮提取率的影響。

3 小結(jié)

據(jù)文獻報道，一般山楂鮮果（如‘超金星’‘晉甜紅’‘大綿球’）果肉黃酮含量在4～6 mg·kg-1之間［19，20］，不同山楂總黃酮提取工藝的黃酮得率在0.5%～10%之間［13，21，22］。本試驗采用閃式提取法進行山楂果肉總黃酮的提取，并利用響應(yīng)面法對各提取參數(shù)進行優(yōu)化，結(jié)果表明在提取時間74 s、乙醇濃度66%、液料比44條件下，總黃酮提取率達到13.3045%。可見，閃式提取法提取時間短、乙醇用量少，可在室溫下進行，能耗及成本更低，而且總黃酮提取率更高。本研究結(jié)果最大程度提高了山楂果肉總黃酮提取率，對提升山楂果肉資源的開發(fā)與利用具有實際指導(dǎo)意義。