振腹法對寒凝證類痛經(jīng)大鼠子宮體表投影溫度及前列腺素E2、前列腺素F2α 的影響

耿 楠 胡 慧 謝丹丹 趙思雨 吳 凡 沈 潛

1.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院，北京 100078；2.北京聯(lián)合大學特殊教育學院，北京 100075

原發(fā)性痛經(jīng)是指女性在月經(jīng)前、間、后期，特別是月經(jīng)期間出現(xiàn)的以少腹脹痛或腰骶部酸痛為主要癥狀的疾病，病情嚴重者可導致昏厥、嘔吐等癥狀[1-4]?，F(xiàn)代醫(yī)學手段治療原發(fā)性痛經(jīng)通常通過服用鎮(zhèn)痛藥物緩解疼痛感，但停藥后癥狀易反復，遠期效果不佳且具有一定副作用[5-7]。原發(fā)性痛經(jīng)中以寒凝血瘀證為常見證型，其主要癥狀是以經(jīng)期或經(jīng)前小腹冷痛為主，遇溫則痛減，經(jīng)量少偶有血塊為主要臨床表現(xiàn)。振腹推拿法治療寒凝證痛經(jīng)臨床效果確切，尤以月經(jīng)前幾日進行為宜[8-9]，但其起效機制尚未闡明，因此探究振腹法溫經(jīng)止痛的內(nèi)在機制具有重要的科學意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗采用鼠齡6 周齡體重（230±20）g 的雌性SPF 級SD 大鼠，由北京維通利華生物技術有限公司提供，該公司實驗動物許可證號：SCXK（京）2016-0006，實驗動物質(zhì)量合格證號：110011201107497612，實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2019-0013。實驗動物在北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院實驗動物中心飼養(yǎng)、實驗，飼養(yǎng)室及實驗室溫度保持在（20±1）℃，濕度在50%左右，自由飲用自來水，普通動物維持飼料。本實驗程序均符合動物實驗倫理原則，并經(jīng)北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準進行。

1.2 主要儀器與試劑

P640 型紅外熱成像儀（美國FLIR 公司）；BC/BD-379HB 臥式冰柜（海爾集團）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；H2050R-1 型高速冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；振法推拿模擬儀（專利號：ZL201620025264.7）。

苯甲酸雌二醇注射液（批號：120207，寧波市三生藥業(yè)有限公司）；縮宮素注射液（批號：120302，上海禾豐制藥廠）；戊巴比妥鈉[批號：T20080530，金木水火土科技（北京）有限公司]。

1.3 實驗分組

通過陰道涂片法[10]篩選出30 只處于動情期且生長處于6 周齡的SD 雌性大鼠，將其按照隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組和振腹組，每組10 只。

1.4 模型制備

模型組和振腹組大鼠采用冰柜冷凍后在大鼠腹部皮下注射苯甲酸雌二醇，在觀察行為學前，在大鼠腹腔注射縮宮素聯(lián)合致痛進行模型制備[11-12]。①致敏：在大鼠腹部皮下連續(xù)10 d 注射苯甲酸雌二醇用以對縮宮素產(chǎn)生敏感性，第1 天及第10 天每只注射量為0.5 mg/d，第2～9 天每只注射量為0.2 mg/d。②致痛：第10 天注射苯甲酸雌二醇后1 h 內(nèi)，在大鼠腹腔注射縮宮素注射液2 U/只，兩者聯(lián)合致痛。③冷凍：第1～10 天大鼠腹部皮下注射苯甲酸雌二醇后將大鼠放入-25℃冰柜冷凍4 h，每2 小時打開冰柜5 s。對照組連續(xù)10 d 給予注射同等劑量的生理鹽水。

1.5 模型評價標準

①寒凝證：根據(jù)寒證表證評分[11]判斷大鼠畏寒蜷縮、毛發(fā)黯淡、大便稀薄及脈絡瘀血4 個主要癥狀的寒凝程度（表1）；模型組子宮體表投影溫度應低于對照組。②痛經(jīng)：模型組扭體潛伏期應低于對照組，扭體次數(shù)應增多，大鼠每分鐘扭體評分應升高（扭體反應能夠最直接表達大鼠痛經(jīng)，是應用最廣泛地評價內(nèi)臟痛的行為學指標），以上提示模型制備成功。

表1 寒證表證評分情況

1.6 干預方法

模型制備成功后，于致敏第11 天開始進行振腹干預。振腹組每日以推拿振法模擬儀定量模擬振腹法，取穴以關元穴為中心，按摩頭為半徑2 cm 的球形結構，設定頻率為500 次/min，振幅為3 mm，干預時長15 min。振腹組、模型組連續(xù)10 d 給予大鼠腹部皮下注射苯甲酸雌二醇，即第11 天和第20 天每只注射較多劑量為0.5 mg/d，第12～19 天每只大鼠皮下注射0.2 mg/d。每日1 次，共注射10 次。對照組同樣連續(xù)10 d 給予注射同等劑量的生理鹽水。

1.7 指標檢測

1.7.1 扭體反應 本實驗采用Schmauss 等[13]提出的行為學評分標準，分為4 個等級。其中0 級為行為正常大鼠：正常姿勢（手爪平放盒底或正常探査行為）；若大鼠腹部疼痛導致身體斜向一邊則定為1 級；若大鼠腹部疼痛導致后肢伸展，后爪背屈，軀體伸展伴頻繁地盆骨側(cè)向旋轉(zhuǎn)則定為2 級；若大鼠腹部疼痛導致其后肢后伸則定位3 級。扭體反應的潛伏期、扭體次數(shù)和扭體評分皆記錄為20 min 內(nèi)。其中大鼠注射縮宮素（致痛）后至出現(xiàn)扭體反應的時間（min）為大鼠扭體潛伏期。扭體評分=[0 級（次數(shù)）×0 分+1 級（次數(shù)）×1 分+2 級（次數(shù)）×2 分+3 級（次數(shù)）×3 分]。

1.7.2 子宮體表投影溫度 振腹治療階段，致痛20 min后，以1%戊巴比妥鈉0.4 ml/100 g 麻醉大鼠，子宮體表投影區(qū)剃毛備皮，將大鼠固定在透明鼠板上，鼠腹與攝像頭的距離固定為3 cm，在室溫（23±1）℃，濕度（60±5）%的條件下，檢測子宮體表投影區(qū)溫度。

1.7.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清前列腺素F2α（prostaglandin F2α，PGF2α）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的含量 各組大鼠檢測子宮體表投影區(qū)溫度后，即刻取血2 ml 置于促凝試管內(nèi)，然后應用離心半徑8.4 cm 的離心機進行低溫離心（轉(zhuǎn)速3500 r/min，15 min），取血清，-20℃保存?zhèn)溆?。PGF2α、PGE2含量采用酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）檢測，按試劑盒說明書進行操作。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料均符合正態(tài)分布，采用均數(shù)±標準差（）表示，比較采用t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠扭體反應結果比較

模型組扭體潛伏期短于對照組，扭體次數(shù)多于對照組，扭體總評分高于對照組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01），提示模型制備成功。振腹組扭體潛伏期長于模型組，扭體總評分低于模型組，扭體次數(shù)少于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見表2。

表2 三組大鼠扭體反應結果比較（）

表2 三組大鼠扭體反應結果比較（）

注 與對照組比較，aaP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.05，bbP ＜0.01

2.2 三組大鼠子宮體表投影溫度、血清PGF2α、PGE2 水平比較

模型組子宮體表投影溫度、PGE2水平均低于對照組，PGF2α水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）；振腹組子宮體表投影溫度、PGE2水平均高于模型組，PGF2α水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見表3。

表3 三組大鼠子宮體表投影溫度、血清PGF2α、PGE2 水平比較（）

表3 三組大鼠子宮體表投影溫度、血清PGF2α、PGE2 水平比較（）

注 與對照組比較，aP ＜0.05，aaP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.05，bbP ＜0.01。PGF2α：前列腺素F2α；PGE2：前列腺素E2

3 討論

在中醫(yī)學中原發(fā)性痛經(jīng)又被稱為經(jīng)行腹痛，病位在胞宮，有寒熱虛實之分，寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)的患者多因經(jīng)期前后感受寒邪，使寒邪客于胞宮，氣血瘀阻，沖任不暢，“不通則痛”[14]，以“寒”與“瘀”為其基本致病因素[15]。因此本實驗采用將雌性大鼠置于冰柜中冷凍致全身寒凝，并于大鼠腹部皮下注射苯甲酸雌二醇加強對致痛物質(zhì)縮宮素的敏感性，然后腹腔注射縮宮素致痛，最終造成寒凝證類痛經(jīng)大鼠模型。致痛后模型組較對照組扭體潛伏期縮短，扭體評分增高，提示模型制備成功。紅外熱成像技術主要是通過觀察機體體表的溫度變化來研究機體生理病理現(xiàn)象[16]，符合中醫(yī)認識疾病的規(guī)律，即“欲知其內(nèi)者，當以觀乎外”。本實驗制備寒凝證類痛經(jīng)大鼠模型冷凍溫度-25℃，時間4 h，連續(xù)10 d，致痛后，模型組子宮體表投影溫度降低，間接反映子宮局部缺血缺氧狀態(tài)。

現(xiàn)代醫(yī)學認為原發(fā)性痛經(jīng)的病理機制與PG 關系密切，比如PGE2、PGF2a[17-18]，其中PGE2可抑制子宮平滑肌的自發(fā)活動，PGF2α可調(diào)控子宮平滑肌收縮[19]，PGF2α表達水平增高，痛經(jīng)癥狀嚴重[20]，非妊娠子宮PGF2α則促進子宮平滑肌收縮加重，一旦子宮內(nèi)膜中PGF2α含量過多，會導致子宮平滑肌異常痙攣性收縮，子宮內(nèi)膜血流減少，組織缺血缺氧，誘導酸性代謝產(chǎn)物產(chǎn)生，堆積于肌層，引發(fā)痛經(jīng)[21]。在雌二醇及縮宮素致痛經(jīng)模型大鼠中，子宮組織及血液中PGF2α含量顯著增加，電針大鼠合谷穴可以顯著降低痛經(jīng)模型大鼠血液及子宮組織中PGF2α的含量進而緩解痛經(jīng)癥狀[22]。振腹法以調(diào)氣溫經(jīng)為特色，善于溫經(jīng)通絡緩急止痛，這恰好與寒凝證痛經(jīng)相互契合[23]，直達腹部三焦胞宮，有效達到“通則不痛”的目的[24]。振腹法是臟腑推拿的重要支系，具有調(diào)整陰陽、培補元氣、溫陽散寒、調(diào)理沖任、溫煦胞宮的功效[25]。關元穴位于臍下3 寸，為任脈腧穴。關，關卡也；元，元氣，意指任脈氣血中的寒濕水飲在此關卡不得上行?，F(xiàn)代研究將辣根過氧化物酶注入大鼠關元穴區(qū)，通過神經(jīng)束路追蹤技術研究關元一級感覺神經(jīng)元在脊神經(jīng)節(jié)的階段分布，結果顯示，關元穴和子宮組織的傳入投影在腰3 至骶5 之間的脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)匯聚重疊，這可能是子宮與關元穴聯(lián)系的神經(jīng)基礎[26]。本實驗應用振法模擬儀模擬振法，置于以關元穴為中心的大鼠腹部，振腹干預中按摩頭上可觸及神闕穴，神闕穴與五臟相同，可調(diào)理沖任元陽、通達氣血、行氣止痛[15]，下至中極穴，該穴為任脈、足三陰經(jīng)之會，具有補氣調(diào)經(jīng)功效，側(cè)至調(diào)經(jīng)止痛、理氣和血的子宮穴（經(jīng)外奇穴），將振腹儀調(diào)至高頻率低幅度振動狀態(tài)進行操作[27]，達到固本培元、溫經(jīng)散寒、緩急止痛的作用。

本實驗研究顯示：振腹推拿治療寒凝證類痛經(jīng)大鼠不僅可以減少痛經(jīng)模型大鼠的扭體次數(shù)（P ＜0.05）、降低扭體評分（P ＜0.01），還可以延長扭體反應的潛伏期（P ＜0.01），提示振腹推拿手法可以緩解縮宮素誘導的痛經(jīng)大鼠子宮肌的劇烈收縮，抑制子宮平滑肌痙攣而起到“解痙止痛”的作用。同時振腹干預可以增高痛經(jīng)大鼠子宮體表投影溫度（P ＜0.01），調(diào)控血清PG，即降低類痛經(jīng)大鼠血清中PGF2α的含量，升高PGE2含量，提示振腹法抑制子宮平滑肌痙攣收縮，改善局部組織缺血缺氧進而達到“溫經(jīng)止痛”的作用。