大蒜白腐菌粗毒素活性分析與組分鑒定

朱言杰 馬金駿 周冬梅 鄧晟 馮輝 魏利輝 陳夕軍 王曉宇

摘要：以大蒜白腐菌為材料，分別用正丁醇和乙酸乙酯萃取得到了大蒜白腐病菌粗毒素，采用氣相色譜對粗毒素進行了物質組分分析。結果表明，用正丁醇提取的大蒜白腐病菌粗毒素活性高于乙酸乙酯提取的大蒜白腐病菌粗毒素，但二者均可引起大蒜葉片病斑產(chǎn)生，表明其具有生物活性;其中有4種物質被鑒定，分別為2，4-二甲基庚烷、十一烷、3，5，5-三甲基-2-環(huán)己烯-1-酮、鄰苯二甲酸丁基酯2-乙基己基酯。

關鍵詞：大蒜;白腐病;毒素;正丁醇;組分

中圖分類號：S436.33 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）08-0125-03

我國是大蒜生產(chǎn)和消費大國，栽培面積位列世界首位。大蒜屬于百合科蔥屬，作為特色種植作物，其出口創(chuàng)匯地位不斷提升。隨著大蒜種植面積逐步擴大，其栽培管理模式也隨之變化，導致病蟲害常發(fā)重發(fā)，嚴重制約大蒜產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展。大蒜白腐病是危害大蒜的主要要病害之一，在一些地區(qū)甚至被稱為大蒜的“癌癥”。該病在我國大蒜主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，嚴重時病株率可以達到80%以上，導致產(chǎn)量嚴重損失直至絕收[1-4]。

大蒜白腐病病原菌屬于半知菌亞門真菌，其分類鑒定為白腐小核菌，該菌可侵染多種百合科作物，如百合、韭菜、洋蔥等[5-9]。病原菌在侵染作物的過程中，會產(chǎn)生幾類代謝產(chǎn)物，如酶、毒素、激素等。其中毒素作為一類真菌代謝產(chǎn)物，在寄主與真菌的互作中發(fā)揮重要作用。張林青等對大蒜白腐病菌毒素進行了提取，用大蒜幼苗檢測根系抑制率方法，對大蒜白腐病菌在不同培養(yǎng)條件下產(chǎn)生粗毒素的能力及粗毒素活性進行了研究，并用GC-MS分析了大蒜白腐病菌毒素的化學組分;組分分析表明其粗毒素含有酯類、酸類、甾體類等化合物，其中月桂酸和鄰苯二甲酸可對大蒜根系產(chǎn)生抑制，且鄰苯二甲酸對大蒜的致病毒性不如月桂酸[10]。

為進一步探索大蒜白腐病病原菌粗毒素的致病機理，為大蒜遺傳育種方面的抗病性鑒定提供理論指導，本研究采用不同的粗毒素分離及鑒定方法，得到了與其他研究有差異的結果。

1 材料與方法

1.1 菌株的轉接及培養(yǎng)

大蒜白腐病菌菌株BF3分離自云南省大理市，由筆者所在實驗室保存。把保存于PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂）固體斜面培養(yǎng)基上的大蒜白腐病菌轉接到PDA固體培養(yǎng)基上，在 18 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。從轉接好的大蒜白腐病菌中挑2塊菌絲，接種到20 mL液體查彼克培養(yǎng)基中，置于搖床上振蕩培養(yǎng)4～7 d，溫度為 18 ℃，直至長出大量菌絲又不產(chǎn)生黑色菌核。

1.2 粗毒素的提取

將獲得的大蒜白腐病菌培養(yǎng)液進行過濾，得到的濾液在60 ℃條件下進行旋轉蒸發(fā)，直至濾液體積到達原體積的1/10，加入等體積的正丁醇。充分振蕩搖勻后靜置2 h，收集有機相，再次加入正丁醇萃取，萃取3次后，將有機相合并，用旋轉蒸發(fā)儀進行旋轉蒸發(fā)去除正丁醇，溫度45 ℃，獲得的漿狀物加水定容至1 mL，即為粗毒素。乙酸乙酯萃取步驟同上。

1.3 粗毒素的致病性鑒定

大蒜品種為G18，取大小一致的30個蒜瓣，放到光照培養(yǎng)箱中，參數(shù)設置為光—黑周期為 14 h—10 h。30 d后將幼苗取出，在葉片同一部位用牙簽刺出傷口，加5 μL粗毒素后保濕（無菌棉）。設空白處理作為對照，每個處理重復3次，所有處理植株放于光照培養(yǎng)箱中，溫度18 ℃，光照—黑暗比為 12 h—12 h。7 d后觀察病斑。

1.4 粗毒素的組分鑒定

將提取出的粗毒素溶于正己烷中，定容至 1 mL。提取物用氣質聯(lián)用儀（江蘇省農(nóng)業(yè)科學院中心實驗室）進行結構分析。具體條件如下：色譜柱為彈性石英毛細管柱TG-5MS;氦氣（純度99.999%）流速1 mL/min;進樣口溫度為280 ℃;采用不分流進樣;升溫程序如下：初始溫度設置為 40 ℃，保持1 min，以6 ℃/min速度升溫到280 ℃，保持2 min。

質譜條件設置如下：EI離子源，離子源溫度為300 ℃;掃描范圍（m/z）為40～550 amu，電子能量為70 eV。

2 結果與分析

2.1 粗毒素的提取與致病性鑒定

根據(jù)“1.2”節(jié)中提取方法，分別得到正丁醇和乙酸乙酯萃取的粗毒素。將上述提取出的粗毒素，分別滴加5 μL在G18的大蒜葉片傷口，4～7 d 后觀察。從圖1可以看出，病菌粗毒素對大蒜葉片有致病力，葉片接種后產(chǎn)生紫色條紋病斑，在傷口處則呈白色枯死病斑，后漸擴大呈橢圓形或條紋形，邊緣有褪綠癥狀。從致病力分析，正丁醇萃取粗毒素的活性高于乙酸乙酯萃取粗毒素的活性。

2.2 粗毒素的組分鑒定

將提取出的粗毒素溶于正己烷中，定容至 1 mL。提取物用氣質聯(lián)用儀進行結構分析。獲得樣品的總離子圖（圖2）。共檢出25種成分;通過質譜分析，從質譜圖數(shù)據(jù)庫中進行檢索，最后鑒定得到4種成分。這4個成分分別鑒定為：2，4-二甲基庚烷、十一烷、3，5，5-三甲基-2-環(huán)己烯-1-酮、鄰苯二甲酸丁基酯2-乙基己基酯（表1）。

3 討論與結論

植物病原真菌毒素的研究較多，其中關于毒素的成分分析和結構鑒定是研究者關注的重要內容[11]。植物病原真菌毒素的分離純化目前已有許多報道。韓珊采用柱層析和HPLC方法，對栗疫病病原菌寄生隱叢赤殼菌產(chǎn)生的毒素進行了分離純化，得到Cp-Ⅰ、Cp-Ⅱ、Cp-Ⅲ毒素，其對板栗幼苗具有較高的致萎性[12]。鄭露等對大蒜白斑病（匍柄霉屬）病菌產(chǎn)生的毒素進行了分離純化，通過綜合應用質譜等方法鑒定發(fā)現(xiàn)其主要成分是SS-毒素[13]。陳夕軍等通過氣質聯(lián)用（GC-MS）檢測水稻紋枯病菌毒素，分析出該毒素的成分為葡萄糖等化合物[14]。

張林青等采用GC-MS法分析了大蒜白腐菌粗毒素化合物主要成分為酯類、有機酸類、醇類等物質，其中有致病性的毒素為月桂酸和鄰苯二甲酸[11]。本研究與其不同之處是，采用有機溶劑提取大蒜白腐菌粗毒素。分別用正丁醇和乙酸乙酯萃取得到了大蒜白腐病菌粗毒素，采用氣相色譜對粗毒素進行了物質組分分析。結果表明，用正丁醇提取的大蒜白腐病菌粗毒素活性高于用乙酸乙酯提取的，但二者均可引起大蒜葉片病斑產(chǎn)生，表明其提取物均具有生物活性。對粗毒素物質組分分析表明，僅有4種物質被鑒定，且與張林青等報道的物質無一相同。其中3，5，5-三甲基-2-環(huán)己烯-1-酮可通過食入、皮膚吸收、吸入等幾種方式刺激黏膜、眼睛和皮膚，從而危害人體健康，人接觸后有煩躁感覺[15-16]。另一化合物鄰苯二甲酸丁基酯 2-乙基己基酯有報道稱會引發(fā)動物的肝臟腫瘤，被認為可能是人類致癌物質之一[17]。

本研究在大蒜白腐病菌粗毒素提取和鑒定方面進行了探索，補充了大蒜白腐病菌粗毒素生物學活性及組分分析的研究內容，期望可為今后大蒜白腐病菌致病機理的研究和抗大蒜白腐病遺傳育種提供理論參考。

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