大花蕙蘭‘黃金小神童’胚性愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生研究

席銀凱　楊武德

摘要：? 為解決大花蕙蘭園藝品種‘黃金小神童’（Cymbidium Golden Elf ‘Sundust’）人工繁育周期長(zhǎng)、系數(shù)低等問(wèn)題，該研究以其側(cè)芽莖尖為外植體，在1/2MS + 1.0 mg·L NAA + 50 g·L香蕉泥+ 15 g·L蔗糖中培養(yǎng)60 d后，以獲得的愈傷組織與原球莖混合物為材料，通過(guò)L （3）正交與完全組合實(shí)驗(yàn)研究不同因素及組合對(duì)‘黃金小神童’胚性愈傷組織和原球莖發(fā)生及增殖的影響，進(jìn)而建立‘黃金小神童’高效、穩(wěn)定的叢芽增殖和植株再生體系。結(jié)果表明：（1）在MS + 2.0 mg·L 6-BA + 150 mL·L椰汁+ 20 g·L蔗糖中，培養(yǎng)70 d后增殖系數(shù)達(dá)8.13，同時(shí)可獲得桑葚狀原球莖團(tuán)。（2）原球莖團(tuán)在MS + 1.0 mg·L 6-BA + 1.0 mg·L NAA中培養(yǎng)70 d后，原球莖發(fā)育為幼芽，叢芽發(fā)生系數(shù)可達(dá)5.36;此時(shí)，將由原球莖誘導(dǎo)得到的簇狀叢芽轉(zhuǎn)接至MS + 1.0 mg·L 6-BA + 1.0 mg·L NAA中，以“芽繁芽”方式增殖，其增殖系數(shù)也達(dá)到4.28，此時(shí)可建立起穩(wěn)定的增殖體系。（3）無(wú)菌苗生根則在MS + 1.0 mg·L NAA + 150 g·L香蕉泥中進(jìn)行，培養(yǎng)60 d可得到具4～7片真葉、高度為8～10 cm的健壯生根苗，生根率達(dá)96.5%;再生苗經(jīng)露苗后移栽到松樹(shù)皮和山基土體積比為3∶2的基質(zhì)中，成活率在85%以上。通過(guò)愈傷組織與原球莖-胚性愈傷組織與原球莖-原球莖-叢芽-再生植株途徑最終建立了‘黃金小神童’高效、穩(wěn)定的叢芽快速繁殖體系，該研究結(jié)果為進(jìn)一步開(kāi)展其人工繁育和遺傳轉(zhuǎn)化提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為蘭科其他物種的無(wú)性快速繁殖提供了參考。

關(guān)鍵詞： ‘黃金小神童’， 胚性愈傷組織， 原球莖， 叢芽， 側(cè)芽莖尖

中圖分類(lèi)號(hào)：? Q943.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A文章編號(hào)：? 1000-3142（2022）04-0682-09

Embryogenic callus induction and plant regeneration

of Cymbidium Golden Elf ‘Sundust’

XI Yinkai， YANG Wude

（ Chemistry Department， Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550000， China ）

Abstract：? In order to solve the obstacle of a long artificial breeding cycle and low coefficient of Cymbidium Golden Elf ‘Sundust’， the stem tip of the lateral bud was used as the explant for the initial culture in 1/2MS with 1.0 mg·L NAA， 50 g·L banana puree and 15 g·L sucrose. After 60 d culture， the mixture of callus and protocorm was used as the materials for investigating the effects of different factors and combinations on the embryonic callus and protocorm occurrence， proliferation via L（3） orthogonal and complete combination experiments. Finally， an efficient and stable proliferation system of Cymbidium Golden Elf ‘Sundust’ was established in the present study. The results were as follows： （1） Proliferation coefficient was 8.13 and the protocorm masses similar to mulberry could be obtained on the MS medium containing 2.0 mg·L 6-BA， 150 mL·L coconut juice and 20 g·Lsucrose for 70 d. （2） The protocorm was cultured in MS medium containing 1.0 mg·L6-BA and 1.0 mg·L NAA for 70 d， the protocorm developed into shoots with a 5.36 bud proliferation coefficient; At this time， cluster buds induced from protocorm were transferred into MS medium with 1.0 mg·L 6-BA and 1.0 mg·L NAA to proliferate via the proliferation mode of bud to bud， and the proliferation coefficient reached 4.28， and the stable proliferation system could be established. （3） The rooting rate was up to 96.5% in MS medium equipped with 1.0 mg·L NAA and 150 g·L banana puree， and the healthy seedlings with 4-7 true leaves and a height of 8-10 cm could be obtained after 60 d culture; The survival rate of seedlings was more than 85% when they were transplanted into polyethylene basin with a volume ratio of pine bark to mountain soil of 3∶2. In this study， the efficient and rapid propagation system of cluster bud of Cymbidium Golden Elf ‘Sundust’ was established by the pathway of callus and protocorm to embryonic callus and protocorm to protocorm to cluster bud to regeneration plant， which provides an experimental basis for further artificial breeding and genetic transformation. Meanwhile， this protocol also provides the reference for asexual rapid propagation of other Orchidaceae species.

Key words： Cymbidium Golden Elf ‘Sundust’， embryonic callus， protocorm， cluster bud， the stem tip of the lateral bud

蘭科是世界上最龐大的植物科之一，多達(dá)20 000～30 000種，大多具有極高觀賞價(jià)值（Chugh et al.， 2009）。‘黃金小神童’（Cymbidium Golden Elf ‘Sundust’） 為小花型品種，葉片尖挺，總狀花序，著花十余朵;該品種一年四季均能開(kāi)花，在珠三角地區(qū)多夏秋季開(kāi)放，可人為控制花期，在花開(kāi)之季，不僅能看到金光燦燦的花朵，還能聞到陣陣幽香（朱根發(fā)和徐曄春，2011;朱根發(fā)，2012）。但‘黃金小神童’歸屬何種存在較大的爭(zhēng)議，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道由于其開(kāi)花物候和性狀更接近于建蘭（C. ensifolium）的生長(zhǎng)特性，故把其歸于建蘭品種（王濟(jì)紅等，2014）;但也有文獻(xiàn)報(bào)道‘黃金小神童’為10多年前由我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)虎頭蘭和四季蘭雜交（C. hybridium × C. ensifolium）而得（余洪，2005），因此一些研究者將‘黃金小神童’歸于大花蕙蘭品種（韓明等，2012;姚婧等，2015）。綜合考慮前人的看法，該研究將‘黃金小神童’歸為大花蕙蘭品種。

大花蕙蘭（C. hybridium）因其株型、花型大，花多，花期長(zhǎng)且每年春節(jié)期間開(kāi)放，故在中國(guó)蘭花市場(chǎng)上獨(dú)領(lǐng)風(fēng)騷，其又名虎頭蘭、東亞蘭和西姆比蘭，為蘭科（Orchidaceae）蘭屬（Cymbidium）多年生草本，是蘭屬部分附生性種類(lèi)的雜交種，因與蕙蘭（C. faberi）較相似且花朵碩大，故稱大花蕙蘭（劉園和王四清，2005）。大花蕙蘭傳統(tǒng)繁殖方式為分株繁殖和種子繁殖。分株繁殖盡管能夠保持母本性狀，但效率低，增殖倍數(shù)只有1～3倍，且周期較長(zhǎng)，難以滿足工廠化生產(chǎn)的需要（劉園和王四清，2005）。而大花蕙蘭種子細(xì)小，缺乏胚乳且胚發(fā)育不完全，萌發(fā)率極低，即使萌發(fā)成功，生長(zhǎng)速度也非常緩慢，從種子萌發(fā)成苗到能進(jìn)行性狀鑒定的開(kāi)花植株一般需要4～5 a，甚至更久，且無(wú)法準(zhǔn)確判斷其品種特性保持與否（陳箐瑛和藍(lán)賀勝，2004）?，F(xiàn)代大花蕙蘭繁殖方式多為組織培養(yǎng)，可對(duì)優(yōu)良材料進(jìn)行快速繁殖，比常規(guī)方法快數(shù)萬(wàn)到數(shù)十萬(wàn)倍，并能克服遠(yuǎn)緣雜交不親和以及雜種胚發(fā)育不良的問(wèn)題，不受地區(qū)、季節(jié)和氣候限制（曹孜義和劉國(guó)民，2002）。

自Morel（1960）用大花蕙蘭的莖尖在含有細(xì)胞分裂素的KC培養(yǎng)基上培養(yǎng)，首次獲得了蘭花無(wú)病毒植株后，蘭花的組織培養(yǎng)逐漸興起。目前，我國(guó)蘭科植物的組培研究主要集中在兜蘭屬（Paphiopedilum）（龍波和龍春林，2006）、杜鵑蘭屬（Cremastra）（張明生等，2005）、獨(dú)蒜蘭屬（Pleione）（李招文和陳文光，1988）、石斛屬（Dendrobium）（吳志剛等，2005）和白及屬（Bletilla）（張愛(ài)麗等，2018）等。不同學(xué)者對(duì)蘭花組織培養(yǎng)的途徑以及影響因素進(jìn)行了大量研究，利用不同外植體再結(jié)合適宜的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，人為創(chuàng)造適合蘭花生長(zhǎng)發(fā)育的小環(huán)境，可以實(shí)現(xiàn)不同品種蘭花的植株再生，從而達(dá)到保護(hù)瀕危蘭花、保持雜交蘭種性以及使一部分品種商品化的目的?！S金小神童’為雜交種，花色艷麗且氣幽香，極具觀賞價(jià)值，為了推廣新品種，達(dá)到工廠化生產(chǎn)的目的，很有必要對(duì)其進(jìn)行組織培養(yǎng)研究。因此，該研究以‘黃金小神童’側(cè)芽莖尖為外植體，試圖誘導(dǎo)愈傷組織，再誘導(dǎo)具有胚性而直接產(chǎn)生原球莖，進(jìn)而通過(guò)原球莖萌發(fā)成苗，最終建立‘黃金小神童’高效、穩(wěn)定的叢芽快速繁殖體系，為進(jìn)一步開(kāi)展其人工繁育和遺傳轉(zhuǎn)化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也可為蘭科其他物種的無(wú)性快速繁殖提供參考。

1材料與方法

1.1 材料和消毒

5盆‘黃金小神童’植株由云南春之蘭花卉有限公司贈(zèng)送，植株經(jīng)云南文山學(xué)院丁長(zhǎng)春博士鑒定為Cymbidium Golden Elf ‘Sundust’。選取形態(tài)健康無(wú)病害植株的側(cè)芽莖尖，輕輕刷去表皮污漬后，先用10%的洗衣粉溶液（質(zhì)量比）浸泡10 min，再用流水沖洗30 min，然后置于超凈工作臺(tái)中，用75%的乙醇（體積比）表面消毒5 min，再用0.1%的HgCl2（質(zhì)量比）消毒10 min，最后用無(wú)菌水漂洗6次，每次不少于3 min。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-芐氨基嘌呤（6-BA）、1-萘乙酸（NAA）、蔗糖和瓊脂均為分析純，購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;活性炭（AC）購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;天然附加物椰子和香蕉購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基為1/2MS和MS，附加瓊脂4.7 g·L，蔗糖除起始培養(yǎng)和正交試驗(yàn)培養(yǎng)基外，其他均為30 g·L;pH值5.4～5.8，培養(yǎng)基在122 ℃滅菌25 min備用。（1）起始培養(yǎng)基：根據(jù)課題組對(duì)蘭科的研究經(jīng)驗(yàn)，采用1/2MS + 1.0 mg·L NAA + 50 g·L香蕉泥+15 g·L蔗糖作為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（未發(fā)表資料）。（2）胚性愈傷組織和原球莖的發(fā)生與增殖同步培養(yǎng)基：MS為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量和體積濃度的6-BA （0.1、1.0、2.0 mg·L）、椰汁（50、100、150 mL·L）和蔗糖（20、30、40 g·L），采用L（3）正交試驗(yàn)（表1）。培養(yǎng)70 d后，記錄各組生長(zhǎng)情況并統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。（3）叢芽發(fā)生培養(yǎng)基：在MS中添加不同質(zhì)量濃度的6-BA（0.1、1.0、2.0 mg·L）和NAA（0.1、0.5、1.0 mg·L）進(jìn)行完全組合實(shí)驗(yàn)，探究不同激素組合對(duì)叢芽發(fā)生的影響。70 d后，記錄各組生長(zhǎng)情況并統(tǒng)計(jì)叢芽發(fā)生系數(shù)與增殖系數(shù)。（4）叢芽增殖與復(fù)壯培養(yǎng)基：根據(jù)上一步叢芽發(fā)生的情況，采用與之相同的培養(yǎng)基，以“芽繁芽”方式進(jìn)行叢芽增殖與復(fù)壯培養(yǎng)。培養(yǎng)3代后計(jì)算芽的平均增殖系數(shù)。（5）生根培養(yǎng)基：在MS中添加不同質(zhì)量的NAA（0.1、0.5、1.0 mg·L）和香蕉泥（50、100、150 g·L）進(jìn)行完全組合實(shí)驗(yàn)，附加0.5 g·LAC。培養(yǎng)60 d后，記錄各組生長(zhǎng)情況并統(tǒng)計(jì)生根率。

1.2.2 培養(yǎng)條件與接種方法培養(yǎng)條件：培養(yǎng)室溫度控制在（22 ± 1）℃，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，光照時(shí)間10 h·d。接種方法：起始培養(yǎng)時(shí)將消毒處理好的側(cè)芽莖尖接于培養(yǎng)基中，每瓶1個(gè)材料;胚性愈傷組織和原球莖的發(fā)生與增殖培養(yǎng)：將愈傷組織和少量原球莖混合物切割為0.5 cm × 0.5 cm大小轉(zhuǎn)接入各正交組中，每組20瓶，每瓶15個(gè)材料;叢芽發(fā)生培養(yǎng)：將原球莖團(tuán)塊分割成1 cm × 1 cm大小接入完全組合實(shí)驗(yàn)組中， 每組20瓶， 每瓶15個(gè)材料; 叢芽增殖與復(fù)壯培養(yǎng)： 2～4棵幼苗為一叢，剪去葉片的2/3再接入新鮮培養(yǎng)基中，每瓶12叢，共30瓶;生根培養(yǎng)：選取生長(zhǎng)健壯的單苗，剪去2/3葉片接入培養(yǎng)基，每組20瓶，每瓶12個(gè)材料。以上各實(shí)驗(yàn)組均重復(fù)3次，如出現(xiàn)污染則重新取材補(bǔ)足各組接種瓶數(shù)。

1.2.3 煉苗移栽待生根苗長(zhǎng)至8～10 cm，根長(zhǎng)2～4 cm時(shí)，將生根瓶置于室外適應(yīng)環(huán)境3 d，小心取出生根苗，洗凈根部殘余的培養(yǎng)基，用質(zhì)量比為0.1%的多菌靈溶液浸泡5 min，取出晾至根部微微發(fā)白，移栽至經(jīng)高錳酸鉀消毒的碎松樹(shù)皮與山基土（體積比為3∶2）中保溫（20～25 ℃）保濕（75%～95%）。60 d后統(tǒng)計(jì)成活率以及生長(zhǎng)情況。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)指標(biāo)所得數(shù)據(jù)采用Excel軟件和SPSS（19.0）軟件處理分析。增殖系數(shù)=有效轉(zhuǎn)接瓶數(shù)/原始接種瓶數(shù);叢芽增殖系數(shù)=有效轉(zhuǎn)接瓶數(shù)/原始接種瓶數(shù);生根率（%）=（產(chǎn)生不定根的單苗數(shù)/接種材料總數(shù)）×100;成活率（%）=（成活苗數(shù)/移栽總苗數(shù)） × 100。

2結(jié)果與分析

2.1 起始培養(yǎng)

將‘黃金小神童’的側(cè)芽莖尖接種于起始培養(yǎng)基上，7 d后與培養(yǎng)基接觸部位開(kāi)始膨大（圖1：A）;培養(yǎng)30 d后，可以看到莖尖被愈傷組織與原球莖所包圍（圖1：B）;培養(yǎng)60 d后， 在體視顯微鏡下可觀察到愈傷組織與原球莖的混合培養(yǎng)物（圖1：C）。

2.2 胚性愈傷組織和原球莖的發(fā)生與增殖同步培養(yǎng)

將培養(yǎng)60 d后的愈傷組織和少量原球莖混合物切割為0.5 cm × 0.5 cm大小轉(zhuǎn)接入胚性愈傷組織和原球莖發(fā)生與增殖同步培養(yǎng)基中，培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表2、表3與表4。由表2正交試驗(yàn)結(jié)果表明，各因數(shù)間極差按降序的方式排列為R6-BA （1.554）>R （0.326）>R （0.260）> R （0.194），這3種因素的R值均大于空白列，表明3種因素對(duì)胚性愈傷組織和原球莖發(fā)生與增殖的效應(yīng)均是可靠的。由方差分析結(jié)果可知（表3），6-BA對(duì)胚性愈傷組織和原球莖發(fā)生與增殖有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），椰汁與蔗糖則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。對(duì)6-BA的3個(gè)水平進(jìn)行Duncan檢驗(yàn)（表4）可知，6-BA的水平3 （2.0 mg·L）對(duì)胚性愈傷組織和原球莖發(fā)生與增殖的效果較其他兩個(gè)水平（0.1 mg·L與1.0 mg·L）顯著。通過(guò)平均值分析，‘黃金小神童’胚性愈傷組織和原球莖的發(fā)生與增殖同步培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為ABC （2.0 mg·L 6-BA + 150 mL·L椰汁+ 20 g·L蔗糖），在此培養(yǎng)基中，培養(yǎng)70 d后增殖系數(shù)達(dá)到8.13。

在此培養(yǎng)基中，培養(yǎng)15 d后，胚性愈傷組織與原球莖混合物的顏色由嫩綠逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樯罹G（圖2：A，B）;培養(yǎng)45 d后，肉眼可見(jiàn)其體積逐漸增大，從體視鏡下觀察到其質(zhì)地緊密，形成由原球莖組成的桑葚狀團(tuán)塊（圖2：C）;培養(yǎng)70 d后，培養(yǎng)基表面基本被原球莖覆蓋（圖2：D），此時(shí)在進(jìn)行下一階段的轉(zhuǎn)接中發(fā)現(xiàn)，原球莖下面還存在少量的胚性愈傷組織，為了保證叢芽發(fā)生的一致性，在下一階段轉(zhuǎn)接過(guò)程中，只轉(zhuǎn)接表面的原球莖團(tuán)塊，盡量舍棄下面的胚性愈傷組織，故此階段計(jì)算的增殖系數(shù)為原球莖增殖系數(shù)。

2.3 叢芽發(fā)生培養(yǎng)

在胚性愈傷組織和原球莖發(fā)生與增殖的培養(yǎng)中，僅少數(shù)原球莖可以直接發(fā)育為幼苗，效果并不理想。因此，將原球莖團(tuán)塊進(jìn)行叢芽發(fā)生培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5完全組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在NAA濃度一定的情況下，叢芽發(fā)生系數(shù)和增殖系數(shù)與6-BA呈正相關(guān);當(dāng)6-BA為1.0 mg·L時(shí)，達(dá)到最大值;當(dāng)6-BA濃度超過(guò)1.5 mg·L時(shí)呈負(fù)相關(guān)。在此階段的各實(shí)驗(yàn)組中，雖然原球莖團(tuán)塊均能發(fā)育成幼芽，但叢芽發(fā)生系數(shù)與增殖系數(shù)上存在顯著差異。其中，8號(hào)的叢芽長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)較好，叢芽發(fā)生系數(shù)與增殖系數(shù)最高，分別為12.34和5.36;在其他組中，幼芽的生長(zhǎng)較慢，且叢芽發(fā)生系數(shù)與增殖系數(shù)均低于8號(hào)培養(yǎng)基。因此，最佳的叢芽發(fā)生與增殖培養(yǎng)基為8號(hào)，即MS + 1.0 mg·L 6-BA + 1.0 mg·L NAA。在此培養(yǎng)基中，將1 cm × 1 cm大小原球莖團(tuán)塊轉(zhuǎn)入8號(hào)培養(yǎng)基培養(yǎng)15 d后，原球莖團(tuán)塊表面有白色芽點(diǎn)出現(xiàn)（圖3：A）;培養(yǎng)25 d后，從體視鏡下觀察到原球莖頂端第一片真葉形成（圖3：B）;培養(yǎng)35 d后， 伴隨原球莖團(tuán)塊增大的同時(shí)在體視鏡下觀察到錐形叢芽形成（圖3：C）;培養(yǎng)50 d后原球莖團(tuán)塊增殖速度逐漸減慢，大量叢芽發(fā)生（圖3：D）。

從‘黃金小神童’的實(shí)際情況來(lái)看，培養(yǎng)至此階段，發(fā)生的叢芽纖細(xì)且瘦弱，若直接進(jìn)行生根培養(yǎng)，移栽成活率較低。故將生長(zhǎng)60 d的幼苗再接入8號(hào)培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)壯培養(yǎng)（圖4：A-C），連續(xù)培養(yǎng)3代后，不僅可以解決苗纖細(xì)、瘦弱、成活率低的問(wèn)題，而且每代培養(yǎng)均可保持良好的增殖系數(shù)。

2.4 生根和移栽

NAA和香蕉泥對(duì)‘黃金小神童’生根影響如表6所示，對(duì)于‘黃金小神童’生根誘導(dǎo)來(lái)說(shuō)，在0.5和1.5 mg·L NAA時(shí)，同一濃度各組間生根率無(wú)顯著性差異，而隨香蕉泥濃度的增大，生根率有所升高;當(dāng)NAA為1.0 mg·L、香蕉泥為150 g·L時(shí)，與其他兩組有顯著性差異，苗的整體生根率較其他處理組好，因此，本研究認(rèn)為8號(hào)為‘黃金小神童’的最佳生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)60 d后生根率達(dá)96.5%。單苗轉(zhuǎn)入此培養(yǎng)基15 d后，新芽原基開(kāi)始出現(xiàn)（圖5：A， B）;培養(yǎng)30 d后，生根瓶可見(jiàn)白色根尖（圖5：C， D）;培養(yǎng)45 d后，可以明顯看到其莖增粗，根伸長(zhǎng)（圖5：E， F）;培養(yǎng)65 d后根系發(fā)達(dá)（圖5：G），將試管苗煉苗后移栽至消毒的碎松樹(shù)皮和山基土（3∶2）中（圖5：H），60 d后，成活率在85%以上。

3討論與結(jié)論

3.1‘黃金小神童’人工快繁中的增殖途徑

蘭科植物由于自身的生物學(xué)特性，自然繁殖系數(shù)極低，利用組織培養(yǎng)技術(shù)是獲得大量種苗的有效途徑（Arditti， 2009）。原球莖的誘導(dǎo)與增殖則是蘭科植物人工快繁的關(guān)鍵，也是這一特殊植物類(lèi)群從有性生殖向無(wú)性生殖特征轉(zhuǎn)變的必要步驟（Chen & Chang， 2001）。蘭科植物通過(guò)原球莖繁殖有3種途徑：（1）外植體-原球莖-叢芽-生根;（2）外植體-原球莖-次生原球莖-叢芽-生根;（3）外植體-愈傷組織-原球莖-叢芽-生根（Mahendran & Bai， 2012; Zeng et al.， 2013）。在這3種方式中，大多按（1）和（2）形成特有的原球莖、類(lèi)原球莖或肉質(zhì)根狀莖，極少產(chǎn)生愈傷組織或胚性愈傷組織（陳繼敏等，2008;丁蘭等，2014）。Sajise & Sagawa（1991）報(bào)道了蝴蝶蘭胚性愈傷組織的形成，但沒(méi)有詳細(xì)描述愈傷組織誘導(dǎo)的方法。此外，Kobayashi等（1993）利用愈傷組織作為原生質(zhì)體的來(lái)源，成功地從蘭科植物原生質(zhì)體中獲得植株再生，但關(guān)于愈傷組織形成的詳細(xì)信息尚不清楚。而‘黃金小神童’側(cè)芽莖尖一旦誘導(dǎo)出愈傷組織，隨即出現(xiàn)原球莖，愈傷組織增殖并不十分明顯。隨著原球莖的增殖，其結(jié)構(gòu)上的兩極性逐漸顯現(xiàn)，頂端形成的葉原基處分化形成芽，基部擬根狀結(jié)構(gòu)發(fā)育為根，最后形成幼苗;由于原球莖數(shù)量較多，培養(yǎng)物在形態(tài)上呈現(xiàn)出叢芽的狀態(tài)，這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基的不同所致，從這一現(xiàn)象來(lái)看， ‘黃金小神童’原球莖繁殖介于上述（2）和（3）之間。在兜蘭 （Paphiopedilum maudiae） 中也有過(guò)類(lèi)似現(xiàn)象的報(bào)道（周慧君， 2016）?！S金小神童’原球莖發(fā)育為幼苗后，其基部愈傷組織和原球莖混合物的生長(zhǎng)明顯受到抑制，推測(cè)為自身產(chǎn)生的生長(zhǎng)素與外源激素產(chǎn)生拮抗作用，導(dǎo)致愈傷組織增殖受阻，而轉(zhuǎn)變?yōu)橐浴把糠毖俊奔葱纬蓞采康姆绞絹?lái)進(jìn)行增殖。本研究結(jié)果表明，在‘黃金小神童’人工快繁早期，應(yīng)以愈傷組織和原球莖混合物為主要增殖對(duì)象，該混合物亦是人工快繁和遺傳轉(zhuǎn)化的最佳材料;原球莖大量發(fā)育為幼苗時(shí)，則以“芽繁芽”方式為主，因此可以達(dá)到最有效的增殖目的。

3.2 外源性因素對(duì)‘黃金小神童’體外快繁的影響

外源激素種類(lèi)及濃度在‘黃金小神童’體外快繁中起著重要作用。在胚性愈傷組織和原球莖發(fā)生與增殖過(guò)程中，6-BA起主要作用，對(duì)胚性愈傷組織和原球莖發(fā)生與增殖具有促進(jìn)作用;在叢芽發(fā)生與增殖復(fù)壯過(guò)程中，6-BA單獨(dú)使用效果明顯優(yōu)于空白對(duì)照，而遠(yuǎn)不如與NAA組合使用的效果。推測(cè)‘黃金小神童’在上述培養(yǎng)過(guò)程中強(qiáng)烈依賴于6-BA，而NAA對(duì)6-BA則有明顯的協(xié)同作用，NAA和6-BA這種需求的差異可能反映了植物生長(zhǎng)時(shí)內(nèi)源性物質(zhì)含量的差異。王育選等（2016）研究了不同激素與NAA的組合，最后認(rèn)為6-BA與NAA組合，可實(shí)現(xiàn)大花蕙蘭叢芽的高效增殖。Rodrigues等（2015）證明了生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比值對(duì)桑葚胚的體外繁殖有一定影響，在不添加或添加NAA的情況下，培養(yǎng)基中只要存在6-BA，都可促使桑葚胚發(fā)育成芽。而在‘黃金小神童’的預(yù)生根培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，本課題組曾添加較低濃度的6-BA與NAA組合使用，結(jié)果顯示試管苗發(fā)育的根長(zhǎng)度較短甚至出現(xiàn)生根困難現(xiàn)象，導(dǎo)致移栽苗很難成活，推測(cè)可能是由于在胚性愈傷組織和原球莖發(fā)生、增殖與叢芽發(fā)生與增殖過(guò)程中，長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)于存在6-BA的培養(yǎng)基中，導(dǎo)致大量細(xì)胞分裂素積累，與外源6-BA產(chǎn)生拮抗作用。因此，在‘黃金小神童’的生根培養(yǎng)中，由于其具較高水平內(nèi)源性細(xì)胞分裂素，所以單獨(dú)使用外源生長(zhǎng)素即可獲得較好的生根效果。這與低濃度的NAA有利于大花蕙蘭生根的觀點(diǎn)一致（胡琳，2013）。

此外，糖類(lèi)和AC在‘黃金小神童’體外快繁中也具有不可忽視的作用。據(jù)現(xiàn)有報(bào)道，有些植物在啟動(dòng)培養(yǎng)中，通過(guò)調(diào)節(jié)蔗糖代謝酶可以提高產(chǎn)量（Kaur et al.， 2005）。該實(shí)驗(yàn)蔗糖的加入可能打破胚性愈傷組織與原球莖發(fā)生過(guò)程中各種糖類(lèi)代謝的平衡，從而促進(jìn)了胚性愈傷組織與原球莖的發(fā)生與增殖。在生根培養(yǎng)中，還加入了AC，AC有較強(qiáng)的吸附作用，可吸附培養(yǎng)基中的酚、醌等有害物質(zhì);根莖具有避光生長(zhǎng)的特性，使用AC可創(chuàng)造根系生長(zhǎng)所需的環(huán)境;此外，AC的存在可能提高了培養(yǎng)物體內(nèi)可溶性蛋白和總糖的含量，從而促進(jìn)根的發(fā)育（孫占育等，2010）。

3.3 天然附加產(chǎn)物在‘黃金小神童’體外快繁中的作用

近幾十年來(lái)，在植物組織培養(yǎng)中經(jīng)常加入天然附加產(chǎn)物，它們大多含有糖、氨基酸、酶、植物激素、維生素等物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞和組織的增殖有明顯的促進(jìn)作用。在蘭科植物的人工快繁中，不同天然附加產(chǎn)物對(duì)誘導(dǎo)、增殖和分化、生根和壯苗等不同培養(yǎng)階段有十分積極的作用（Arditti， 2009）。Arditti（1966）研究了不同天然附加產(chǎn)物對(duì)蘭科植物生長(zhǎng)情況的影響，表明椰子汁、香蕉泥、芋頭泥等對(duì)培養(yǎng)物具有明顯的促進(jìn)作用。在‘黃金小神童’胚性愈傷組織與原球莖發(fā)生、增殖實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，椰子汁對(duì)胚性愈傷組織與原球莖發(fā)生、增殖具有積極影響。有研究表明，椰子汁中含有激動(dòng)素、GA3以及其他一些物質(zhì)（Ge et al.， 2005， 2007， 2008）。激動(dòng)素作為細(xì)胞分裂素的一種，能促進(jìn)細(xì)胞分化、分裂和生長(zhǎng);GA3主要用于促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，提早成熟，打破休眠，促進(jìn)萌發(fā)。目前椰子汁中的這些物質(zhì)對(duì)于胚性愈傷組織和原球莖的發(fā)生與增殖的機(jī)制尚不明確。本研究推測(cè)椰子汁中的這些物質(zhì)可能相互作用，從而促進(jìn)胚性愈傷組織和原球莖的發(fā)生與增殖，或者其中的某些成分與6-BA和蔗糖存在某種協(xié)同作用，促進(jìn)‘黃金小神童’這一過(guò)程的發(fā)生。而香蕉泥富含有機(jī)物，營(yíng)養(yǎng)豐富，可使幼苗在適宜的弱酸性條件下生長(zhǎng)，加速根的形成，從而進(jìn)一步加快植株對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，促進(jìn)幼苗的生長(zhǎng)，進(jìn)而達(dá)到生根的目的（曾小龍，1998）。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，香蕉泥在‘黃金小神童’的生根培養(yǎng)中亦具明顯的促進(jìn)作用。

參考文獻(xiàn)：

ARDITTI J， 1966. The effect of tomato juice and its fractions on the germination of orchid seeds and on seeding growth [J]. Amer Ordhid Soc Bull， 35（20）： 175-182.

ARDITTI J， 2009. Micropropagation of orchids [M]. 2nd ed. Oxford： Blackwell Publishing： 52-55.

CAO ZY， LIU GM， 2002. Textbook practical techniques on plant tissue culture [M]. Lanzhou： Gansu Science and Technology Press： 530.? [曹孜義， 劉國(guó)民， 2002. 實(shí)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)教程 [M]. 蘭州： 甘肅科學(xué)技術(shù)出版社： 530.]

CHEN JM， GAO C， YANG ZM， et al.， 2008. Explanation of the concepts of protocorm and somatic embryo in tissue culture of Orchidaceae plants [J]. Bull Agric Sci Technol， 36（10）： 169-170.? [陳繼敏， 高鋌， 楊鎮(zhèn)明， 等， 2008. 蘭科植物組織培養(yǎng)中原球莖與體胚概念的辨釋 [J]. 農(nóng)業(yè)科技通訊， 36（10）： 169-170.]

CHEN JT， CHANG WC， 2001. Effect of auxins and cytokinins on direct somatic embryogeresis on leaf explants of Oncidium “Grower Ramsey” [J]. J Plant Growth Regul， 34（2）： 229-232.

CHEN QY， LAN HS， 2004. Tissue culture and rapid propagation of orchids [M]. Beijing： China Agricultural Press： 82-84.? [陳箐瑛， 藍(lán)賀勝， 2004. 蘭花組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù) [M]. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社： 82-84.]

CHUGH S， GUHA S， RAO IU， 2009. Micropropagation of orchids： a review on the potential of different explants [J]. Sci Hortic， 122（4）： 507-520.

DING L， ZHANG L， GUO L， et al.， 2014.Asymbiotic seed germination and rapid seedling regeneration of endangered Gymnadenia conopsea （L.） R. Br.? [J]. Plant Physiol J， 50（1）： 77-82.? [丁蘭， 張麗， 郭柳， 等， 2014. 瀕危植物佛手參種子的非共生萌發(fā)及種苗的快速繁殖 [J]. 植物生理學(xué)報(bào)， 50（1）： 77-82.]

GE L， YONG JWH， TAN SN， et al.， 2008. Analyses of gibberellins in coconut （Cocos nucifera L.） water by partial filling-micellar electrokinetic chromatography-mass spectrometry with reversal of electroosmotic flow [J]. Electrophor， 29（10）： 2126-2134.

GE L， PEH CYC， YONG JWH， et al.， 2007. Analyses of gibberellins by capillary electrophoresis-mass spectrometry combined with solid-phase extraction [J]. J Chromatogr A， 1159（1/2）： 242-249.

GE L， YONG JWH， GOH NK， et al.， 2005. Identification of kinetin and kinetin riboside in coconut （Cocos nucifera L.） water using a combined approach of liquid chromatography-tandem mass spectrometry， high performance liquid chromatography and capillary electrophoresis [J]. J Chromatogr B， 829（1/2）： 26-34.

HAN M， LI YP， PAN XF， 2012. In vitro propagation of Cymbidium via clustered shoot [J]. J Trop Org， 3（3）： 261-266.? [韓明， 李晏萍， 潘學(xué)峰， 2012. 利用叢生芽增殖途徑對(duì)大花蕙蘭進(jìn)行離體快繁 [J]. 熱帶生物學(xué)報(bào)， 3（3）： 261-266.]

HU L， 2013. Effect of different factors on seedlings and rooting of Cymbidium hybridum [J]. N Hortic， 17（10）： 114-117.? [胡琳， 2013. 不同因素對(duì)大花蕙蘭壯苗生根的影響 [J]. 北方園藝， 17（10）： 114-117.]

KAUR S， GUPTA AK， KAUR N， 2005. Seed priming increases crop yield possibly by modulating enzymes of sucrose metabolism in chickpea [J]. J Agron Crop Sci， 191（2）： 81-87.

KOBAYASHI S， KAMEYA T， ICHIHASHI S， 1993. Plant regeneration from protoplasts derived from callus of Phalaenopsis [J]. Plant Tiss Cult Lett， 10（3）： 267-270.

LIU Y， WANG SQ， 2005. Advances of Cymbidium hybridum [J]. Acta Hortic Sin， 32（4）： 748-752.? [劉園， 王四清， 2005. 大花蕙蘭（Cymbidium hybridum）的研究動(dòng)向 [J]. 園藝學(xué)報(bào)， 32（4）： 748-752.]

LI ZW， CHEN WG， 1988. A preliminary study on the resources and tissue culture of Pleione [J]. Fujian Fruits， 4（8）： 35-38.? [李招文， 陳文光， 1988. 獨(dú)蒜蘭屬的資源和它的組織培養(yǎng)初探 [J]. 福建果樹(shù)， 4（8）： 35-38.]

LONG B， LONG CL， 2006. Amazing Paphiopedilum and its research stats [J]. Chin J Nat， 28（6）： 341-344.? [龍波， 龍春林， 2006. 兜蘭屬植物及其研究現(xiàn)狀 [J]. 自然雜志， 28（6）： 341-344.]

MAHENDRAN G， BAI VN， 2012. Direct somatic embryogenesis and plant regeneration from seed derived protocorms of Cymbidium bicolor Lindl [J]. Sci Hortic， 135（24）： 40-44.

MOREL G， 1960. Producing virus-free Cymbidium [J]. Am Orchid Soc Bull， 29（7）： 495-497.

RODRIGUES LA， PAIVA NV， BOARETTO AG， et al.， 2015. In vitro propagation of Cyrtopodium saintlegerianum rchb. f. （Orchidaceae）， a native orchid of the Brazilian savannah [J]. Crop Breed Appl Biotechnol， 15（1）： 10-17.

SAJISE JU， SAGAWA Y， 1991. Regeneration of plantlets from callus and protoplasts of Phalaenopsis sp. [J]. Malays Orchid Bull， 5（4）： 23-28.

SUN ZY， SUN ZQ， CAO B， 2010. Effect of activated charcoal in rooting process of plant tissue culture [J]. Hunan Agric Sci， 39（7）： 3-5.? [孫占育， 孫志強(qiáng)， 曹斌， 2010. 活性炭在促進(jìn)組培苗植物生根中的作用 [J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)， 39（7）： 3-5.]

WANG JH， LIU Y， QI X， et al.， 2014. Optimization of integrated technology for tissue culture of Cymbidium Golden elf Sundust [J]. SW Chin J Agric Sci， 27（5）： 2135-2140.? [王濟(jì)紅， 劉燕， 祁翔， 等， 2014. 建蘭新品種‘黃金小神童’組培育苗集成技術(shù)的優(yōu)化 [J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 27（5）： 2135-2140.]

WANG YX， REN JH， WANG PL， et al.， 2016. Effect of phytohormone on the proliferation and growth of clustered shoots in Cymbidium hybridium [J]. J Shanxi Agric Univ （Nat Sci Ed）， 36（9）： 628-632.? [王育選， 任建宏， 王鵬麗， 等， 2016. 植物激素對(duì)大花蕙蘭叢生芽增殖與生長(zhǎng)的影響 [J]. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 36（9）： 628-632.]

WU ZG， LIU XW， ZHANG SW， 2005. Progress in tissue culture of Dendrobium [J]. Res Inf Trad Chin Med， 7（11）： 23-25.? [吳志剛， 劉賢旺， 張壽文， 2005. 石斛屬植物組織培養(yǎng)研究進(jìn)展 [J]. 中藥研究與信息， 7（11）： 23-25.]

YAO J， QIN BX， LIU F， et al.， 2015. Ornamental evaluation of Cymbidium dayanum × Cymbidium‘Golden Elf’ [J]. Chin J Trop Crops， 36（7）： 1201-1206.? [姚婧， 覃寶祥， 劉帆， 等， 2015. 冬鳳蘭與‘黃金小神童’大花蕙蘭雜交后代的觀賞性評(píng)價(jià) [J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 36（7）： 1201-1206.]

YU H， 2005. Cymbidium Golden Elf ‘Sundust’ [J]. Zhongguo Huahui Penjing， 12（2）： 12-13. [余洪， 2005. 黃金小神童 [J]. 中國(guó)花卉盆景， 12（2）： 12-13.]

ZENG SJ， WANG J， WU KL， et al.， 2013. In vitro propagation of Paphiopedilum hangianum Perner & Gruss [J]. Sci Hortic， 151（28）： 147-156.

ZENG XL， 1998. Effects of different mediums on the differentiation of protocorm-like body of Cymbidium [J]. Guangdong Agric Sci， 48（5）： 21-22.? [曾小龍， 1998. 不同培養(yǎng)基對(duì)虎頭蘭類(lèi)原球莖器官分化的影響 [J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 48（5）： 21-22.]

ZHANG AL， WANG YZ， HUANG HY， et al.， 2018. The study of effective proliferative protocol in artificial propagation of Bletilla striata test-tube [J]. J Chin Med Mat， 41（2）： 275-280.? [張愛(ài)麗， 王元忠， 黃衡宇， 等， 2018. 白及人工快繁中有效增殖途徑的研究 [J]. 中藥材， 41（2）： 275-280.]

ZHANG MS， QI JL， LIU Z， et al.， 2005. Tissue culture and rapid propagation of Rhododendron officinalis， medicinal orchid [J]. Seed， 24（8）： 82.? [張明生， 戚金亮， 劉志， 等， 2005. 藥用蘭科植物杜鵑蘭的組織培養(yǎng)與快速繁殖 [J]. 種子， 24（8）： 82.]

ZHOU HJ， 2016. Study on the tissue culture of Paphiopedilum Maudiae type [D]. Guangzhou： South China Agricultural University.? [周慧君， 2016. 魔帝類(lèi)兜蘭的組織培養(yǎng)研究（D）. 廣州： 華南農(nóng)業(yè)大學(xué).]

ZHU GF， 2012.Huahui miaomu zaipei shiyong jineng [M]. Guangzhou： Sun Yat-Sen University Press： 46-47.? [朱根發(fā)， 2012. 花卉苗木栽培實(shí)用技能 [M]. 廣州： 中山大學(xué)出版社： 46-47.]

ZHU GF， XU YC， 2011. The encyclopedia of orchid [M]. Changchun： Jilin Science and Technology Press： 60.? [朱根發(fā)， 徐曄春， 2011. 名品蘭花鑒賞金典 [M]. 長(zhǎng)春： 吉林科學(xué)技術(shù)出版社： 60.]

（責(zé)任編輯周翠鳴）