尿沉渣白細胞計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制

劉瑛穎, 張 玲, 楊喬斯

(1.中國計量科學(xué)研究院,北京 100029； 2.迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司,吉林 長春 130000)

1 引 言

尿沉渣(urine sediment,US)檢查是對尿液中的有形成分進行檢查,主要包括細胞、管型、結(jié)晶、細菌、寄生蟲等各種病理成份,是輔助對泌尿系統(tǒng)疾病作出診斷的重要常規(guī)試驗項目[1]。其中的白細胞(white blood cell,WBC)項目對泌尿系統(tǒng)的檢測具有重要意義,提示著泌尿系統(tǒng)存在著細菌感染或腎臟疾病等病理特征[2,3]。全自動尿沉渣分析儀是采用顯微圖像自動識別技術(shù)或流式細胞技術(shù)對尿液中的有形成份進行自動定位及捕捉,并且對尿液中的有形成分進行自動識別和分類計數(shù)的一種檢驗設(shè)備。由于其快捷性和準(zhǔn)確性,全自動尿沉渣分析儀已成為臨床尿液檢測分析的常規(guī)儀器。為了保證該類儀器在日常檢測工作中的性能水平和檢測結(jié)果的真實可靠,國家市場監(jiān)督管理總局頒布了JJF 1823—2020《全自動尿沉渣分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》,并于2020年4月開始發(fā)布實施。該文件主要對紅細胞、白細胞兩個測量項目的空白值、示值誤差、重復(fù)性、攜帶污染率等計量特性進行了規(guī)范[4]。為了保證該校準(zhǔn)規(guī)范的正常實施和良好操作,相關(guān)校準(zhǔn)項目配套的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是必不可少的。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是具有高度均勻性、良好穩(wěn)定性和量值準(zhǔn)確性,用來校準(zhǔn)測量儀器,對測量方法進行評價或為物質(zhì)定值的物質(zhì),在分析測試各行業(yè)中得到廣泛應(yīng)用[5,6]。因此,本研究以固定后的人血液白細胞為原料完成了尿沉渣白細胞計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備,并考察了其細胞形態(tài)真實性、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性、穩(wěn)定性和臨床樣本的互通性,研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可配合相關(guān)校準(zhǔn)規(guī)范用于全自動尿沉渣分析儀中白細胞項目的周期校準(zhǔn)、質(zhì)量控制,以及相關(guān)檢測方法的確認(rèn)和驗證。

2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)細胞原料

對體格檢查中滿足獻血者健康檢查有關(guān)要求的無償獻血者初篩(乙肝表抗、轉(zhuǎn)氨酶、快速HIV)合格的EDTA-K2靜脈抗凝血，取抗凝血液標(biāo)本,以2 000 r/min離心3 min,分離獲得白膜層,取白膜層加入溶血素進行殘余紅細胞溶解；然后加入磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L,pH 7.2)稀釋,以2 000 r/min離心3 min,洗滌3次得到白細胞懸液,加入磷酸緩沖鹽(0.1 mol/L,pH 7.2)溶液和甲醛(終濃度1%,體積分?jǐn)?shù))混合,混勻器上混合30 min,置4 ℃冰箱過夜。第二天,取出后再用混勻器混合30 min,離心棄去上液得到醛化固定白細胞。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的配制和分裝

將醛化固定后的白細胞按一定比例加入磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L,pH 7.2)中配制成目標(biāo)濃度,充分混勻后分裝,透明玻璃圓底長管中每管加入30 mL白細胞懸浮液,旋緊管蓋,放置冰箱備用。操作過程在生物安全柜中進行,避免細菌污染。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物細胞形態(tài)確認(rèn)

為了保證本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物能夠通用于所有全自動尿沉渣分析儀的檢測校準(zhǔn),尤其是基于顯微圖像自動識別技術(shù)的儀器,所用的醛化固定后的白細胞應(yīng)具有與新鮮細胞非常高的形態(tài)相似性。本研究將4 ℃保存了12個月的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物白細胞與新鮮血液樣本中的白細胞,通過掃描電子顯微鏡拍攝,并進行了超高分辨率顯微圖像的比較。每種樣本隨機選取了20～40個細胞進行圖像拍攝和比較。與新鮮血液白細胞相比,長期保存的醛化固定白細胞發(fā)生明顯的破裂、皺縮等形態(tài)變化。這說明從細胞形態(tài)特征方面,本研究制備的尿沉渣白細胞計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物是可以代表新鮮白細胞的。

圖1 不同樣本中白細胞的掃描電子顯微鏡圖像

3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值

3.1 定值方法的選擇

本研究中采用了2種方法進行了定值：高通量顯微成像法和流式細胞術(shù)測定。顯微鏡測量方法是上世紀(jì)90年代前血細胞計數(shù)的傳統(tǒng)參考方法,也是目前美國臨床檢驗標(biāo)準(zhǔn)委員會和中國臨床檢驗標(biāo)準(zhǔn)委員會建議的尿沉渣白細胞計數(shù)的參考方法[7,8]。該方法的優(yōu)點是直接絕對,弊端是檢測通量小導(dǎo)致測量結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差大,主觀性過強。因此,本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制中采用了高通量顯微成像法作為了定值方法之一。該方法通過基于時間延遲積分技術(shù)的電荷耦合器件(time delay integration charge coupled devices, TDICCD)可對鞘液流中高速流過的單個細胞進行快速顯微拍攝,包括明場和多個熒光通道的暗場圖像[9,10]。通過該技術(shù)我們得到了待定值制備物中的白細胞明場光學(xué)顯微圖像；同時通過核酸特異性熒光染料DRAQ5進行白細胞細胞核染色,還可得到細胞核熒光顯微圖像(見圖2)。因此,該技術(shù)不僅實現(xiàn)了對研究對象的直接絕對的確認(rèn),同時可高通量(5 000 cells/s)分析測量待檢測細胞,顯著改善顯微鏡檢測量的不確定度水平。

圖2 人新鮮血液樣本白細胞的高通量顯微成像多通道圖像

本研究的另一定值方法是流式細胞術(shù)測量法。流式細胞術(shù)與人工顯微鏡測量法有著根本的不同,前者是基于細胞表面免疫標(biāo)志即從免疫學(xué)特征對白細胞進行分類計數(shù),且可以計數(shù)大量細胞[11]。同顯微鏡法相比,流式細胞術(shù)分類計數(shù)白細胞的優(yōu)勢在于計數(shù)的細胞數(shù)量更多(>10 000個細胞),因此靈敏度、特異性更高,重復(fù)性更好。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值數(shù)據(jù)與處理

本研究共制備了300瓶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物,依據(jù)JJF 1006—1994《一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》隨機抽取了15瓶進行了定值[12]。從每瓶中隨機分別抽取3個樣本進行測定,共45個樣本數(shù)據(jù),定值數(shù)據(jù)及統(tǒng)計處理見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值測量數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用夏皮羅-威爾克(Shapiro-Wilk)法對兩組測量數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗,用格拉布斯(Grubbs)法檢驗有無異常值,結(jié)果表明測量數(shù)據(jù)為正態(tài)分布、無異常值[13]。用F-檢驗檢查確認(rèn)高通量顯微成像法與流式細胞術(shù)的測量精度是一致的。通過計算得到本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的算術(shù)平均值為516.0 cells/μL。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性檢驗

為了保證檢驗結(jié)果能夠充分代表整體特征,本研究按照J(rèn)JF 1006—1994《一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》隨機選取15瓶[12],每瓶通過流式細胞術(shù)進行白細胞濃度測定3次,利用方差分析法對瓶內(nèi)和瓶間的均勻性進行分析,表2列出了均勻性檢驗結(jié)果。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性檢驗

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性是衡量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的另外一個重要參數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的長期穩(wěn)定性與儲存條件相關(guān),短期穩(wěn)定性與運輸條件相關(guān)。依據(jù)JJG 1343—2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學(xué)原理》對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物進行長期和短期穩(wěn)定性考察[13]。長期穩(wěn)定性考察方式為在12個月內(nèi)周期性每次隨機抽取3支樣品,采用流式細胞術(shù)測試白細胞濃度3次。描繪出特性量值Y與時間X的關(guān)系,擬合成一條直線,計算直線斜率b1,并評定穩(wěn)定性引入的不確定度s(b1)。t0.95，n-2為自由度是n-2和p=0.95(95%置信水平)時的t因子，如果|b1|

表3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的長期穩(wěn)定性檢驗

短期穩(wěn)定性測試選取了4個溫度點4、25、37和60 ℃,不同的時間點進行測試(3、7、11、14、21、31天),每次隨機抽取3支樣品,每只樣品測試3次,采用流式細胞術(shù)測試白細胞濃度3次。尿沉渣白細胞計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)短期穩(wěn)定性考察結(jié)果見表4。分析短期穩(wěn)定性考察數(shù)據(jù)可知,本研究制備的尿沉渣白細胞計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣本的短期穩(wěn)定溫度比較寬泛(4～37 ℃),對運輸溫度條件要求不是非常嚴(yán)格。

表4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的短期穩(wěn)定性檢驗

3.5 互通性驗證

根據(jù)WS-T356—2011《基質(zhì)效應(yīng)與互通性評估指南》要求評估標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物的互通性[14]。用2種測定方法,一種為顯微鏡檢的參考方法,另一種為臨床常規(guī)全自動尿沉渣檢測儀評估方法。其中第二種方法選取了兩種原理的代表機型,一種為為顯微圖像識別原理的迪瑞FUS-2000(評估方法1),另一種流式細胞原理的希森美康UF-5000(評估方法2)。同時對選定的20份新鮮臨床尿液樣本(各濃度分布均勻)和標(biāo)準(zhǔn)品進行分析,利用2種方法測定臨床尿液樣本的結(jié)果建立數(shù)學(xué)關(guān)系(線性回歸),以參考方法測定值為X,以評估方法測定值為Y,采用excel軟件進行線性擬合,并采用線性回歸模型進行分析。結(jié)果表明,尿沉渣白細胞計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)侯選物的細胞濃度值均在95%可信區(qū)間內(nèi)(見圖3),說明標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物中的白細胞與臨床樣本中的白細胞具有良好的互通性。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的互通性分析驗證

4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值的不確定度評定

研制的尿沉渣白細胞計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物特性量值的不確定度主要來源于3個方面：定值方法、均勻性和穩(wěn)定性。后兩者引入的不確定度可參考JJF 1342—2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學(xué)原理》和相關(guān)研究資料[15～20]進行計算。本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物采用了兩種方法進行定值,因此分別對這2種測量方法的不確定度進行了分析。

4.1 高通量顯微成像測量方法的不確定度評定

該方法可對鞘液流中高速流過的單個細胞進行快速顯微拍攝,實現(xiàn)了對研究對象的直接絕對的確認(rèn),同時高通量分析測量得到待檢測細胞的絕對數(shù)量或濃度。通過分析發(fā)現(xiàn),該方法的測量不確定度來源主要包括以下2個方面:

(1)測量重復(fù)性引入的不確定u1

由表1可知，u1=2.3%。

(2)目標(biāo)細胞圈門策略引入的不確定度u2

高通量顯微成像測量方法利用了流式細胞術(shù)的樣本采集原理實現(xiàn)高通量測量,因此目標(biāo)細胞的識別也需要通過相應(yīng)的光學(xué)信號圖像進行圈門,圈門初步?jīng)Q定了細胞計數(shù)的個數(shù)。而常規(guī)流式方法中圈門大小主要取決于實驗操作者的判斷。高通量顯微成像測量方法可通過多通道顯微圖像的輔助顯著降低判斷的盲目性和主觀性。3個操作者分別進行圈門計數(shù),采用獨立判斷的形式,輔助以顯微鏡拍照肉眼逐一判斷,計算圈門可能引入的不確定度。經(jīng)統(tǒng)計,u2≈0.8%。

綜上,高通量顯微成像技術(shù)測量方法的合成相對不確定度為：

4.2 流式細胞術(shù)測量方法的不確定度評定

本研究的另一定值方法是通過有標(biāo)稱數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)計數(shù)微球作為量值參考,采用流式細胞術(shù)同時分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物和標(biāo)準(zhǔn)計數(shù)微球,通過計算得到標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物中白細胞的濃度。其濃度計算公式為：

式中：CRS為待測目標(biāo)細胞濃度,單位為個每微升(cells/μL)；Ncell為獲取目標(biāo)細胞群數(shù)量,單位為個(cells)；Nball為獲取計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球群數(shù)量,單位為個；Qball為樣本中添加的計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球數(shù)量,單位為個；V為待測樣本加樣體積(不含熒光染料或特異性的熒光染料標(biāo)記單克隆抗體體積,計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球懸浮液體積等添加物體積),單位為μL；D為樣本稀釋倍數(shù)。

該方法的測量不確定度來源主要包括以下3個方面：

(1)測量重復(fù)性引入的不確定u1

由表1可知，u1=1.6%。

(2)計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球引入的不確定度u2

通過本研究采用的計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球(BD TrucountTMAbsolute Counting Tubes)使用說明書可得到該批次的量值不確定度u2=2.5%。

(3)目標(biāo)細胞圈門策略引入的不確定度u3

常規(guī)流式方法中圈門大小主要取決于實驗操作者的判斷,判斷的盲目性和主觀性會引入測量的不確定度。采用3個操作者分別進行圈門計數(shù),獨立判斷的形式,計算圈門可能引入的不確定度。經(jīng)統(tǒng)計,u3≈2.0%。

綜上,流式細胞術(shù)測量方法的合成相對不確定度為：

=0.036

4.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物的不確定度評定

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度主要來自定值的不確定度uchar,瓶間均勻性ubb,長期穩(wěn)定性us。定值結(jié)果與不確定度來源見表5,表5中高通量法是高通量顯微成像法的簡稱，流式法是流式細胞術(shù)測量法的簡稱。

表5 尿沉渣白細胞計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度評定

5 結(jié) 論

尿沉渣有形成分的自動化分析是臨床檢驗中常規(guī)開展的項目,其測量的準(zhǔn)確性和可比性對于提高臨床診療水平和保證大眾健康具有重要的意義。本研究制備的尿沉渣白細胞計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),原料來源于人血液白細胞,非模擬顆粒。通過超高分辨顯微技術(shù)與臨床樣本互通性驗證充分證明了其與真實樣本中白細胞的形態(tài)與生理特性的一致。本研究采用了高通量顯微成像法和流式細胞術(shù)對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物聯(lián)合定值,既保證了該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量值可溯源至顯微鏡檢方法,同時又改善了測量的不確定度水平。

本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)驗證均勻性和穩(wěn)定性良好,4 ℃避光可保存12個月,與臨床樣本具有良好的互通性。通過尿沉渣白細胞計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制,可為我國臨床在用的全自動尿沉渣分析儀白細胞測量項目的測量準(zhǔn)確性和儀器性能測試提供技術(shù)、信息和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)服務(wù),這對于我國臨床尿沉渣細胞有形成分的分析測量的準(zhǔn)確性、可比性和溯源性,提高臨床檢測分析的質(zhì)量水平和標(biāo)準(zhǔn)化具有重要意義。