復(fù)方丹參滴丸通過調(diào)控IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬保護(hù)血管平滑肌細(xì)胞

李幸幸,劉 俊,徐忠誠，鄒 晉，董 揚(yáng)

(1. 浙江省金華市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，浙江 金華 321000；2. 江西省人民醫(yī)院江西省心血管病研究所，江西 南昌 330006)

目前，心血管疾病是引起我國居民死亡的主要疾病，已成為社會(huì)的重要負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重威脅人民群眾健康[1]，動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是引起心腦血管疾病中的重要誘因，血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)發(fā)生表型轉(zhuǎn)換及增殖異常，遷移和凋亡是影響AS發(fā)展的突出表現(xiàn)[2-3]，而VSMCs的病理機(jī)制目前尚未闡明。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)相關(guān)的凋亡途徑可能導(dǎo)致了VSMC 增殖和凋亡異常從而在 AS 發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4-5]。此外，在AS中，血管平滑肌細(xì)胞存在血管細(xì)胞自噬樣特性，適度的血管平滑肌細(xì)胞自噬可以減輕氧化應(yīng)激和抑制細(xì)胞凋亡，從而誘導(dǎo)形成穩(wěn)定斑塊[6-7]。而ERS與自噬過程密切相關(guān)，可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬，但過度激活的自噬反應(yīng)，能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]。因此，細(xì)胞ERS及自噬可能是治療AS的潛在新靶標(biāo)。中醫(yī)藥是治療動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的特色藥物，中藥復(fù)方是治療AS不可或缺的重要藥物之一，復(fù)方丹參滴丸是由丹參、三七、冰片3味中藥組成的復(fù)方。該方主要適應(yīng)癥為冠心病和心絞痛，其藥理作用與抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖相關(guān)[9-10]。但其作用是否與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬過程有關(guān)目前不得而知，故本研究欲過建立ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs增殖遷移模型，探究復(fù)方丹參滴丸對(duì)VSMCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬的影響，為復(fù)方丹參滴丸治療動(dòng)脈粥樣硬化提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1一般資料 選擇2016年2月～2018年5月收治的50例動(dòng)脈粥樣硬化患者，年齡50～75歲，頸動(dòng)脈狹窄<50%，患者或其家屬均自愿簽署知情同意書。排除合并嚴(yán)重糖尿病和嚴(yán)重心肝腎等重要器官病變者，合并凝血功能障礙者，大面積腦梗或合并語言障礙、意識(shí)障礙者，妊娠期女性及精神障礙者，合并嚴(yán)重的消化系統(tǒng)病變不能耐受藥物治療者，治療依從性差不能堅(jiān)持配合治療者。將入組患者隨機(jī)分為2組：觀察組25例，男15例，女10例；年齡50～73(67.5±5.4)歲。對(duì)照組25例，男13例，女12例；年齡51～76(67.3±6.1)歲。2組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.1.2治療方法 對(duì)照組采用西醫(yī)治療方案：辛伐他汀(北京四環(huán)制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20093221，規(guī)格：10 mg)10 mg，每晚睡前口服；阿司匹林腸溶片(山西蘭花藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H14023980，規(guī)格：0.1 g)0.1 g，每日1次口服，均連續(xù)用藥3個(gè)月。觀察組在對(duì)照組治療基礎(chǔ)上給予復(fù)方丹參滴丸(天津天士力制藥集團(tuán)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z10950111，規(guī)格：27 mg)27 mg,每日3次口服，一次10丸，連續(xù)口服3個(gè)月。

1.1.3觀察指標(biāo) ① 超聲檢測指標(biāo)：使用彩色多普勒超聲儀檢查左右頸動(dòng)脈，記錄患者動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度(IMT)和斑塊數(shù)目及大小，計(jì)算斑塊面積，斑塊面積計(jì)算方法：測量每個(gè)斑塊的3條直徑，選擇直徑最大的2條作為長、寬，相乘得出斑塊面積。② 血液流變學(xué)指標(biāo)：使用血液黏度計(jì)檢測2組患者治療前后全血高切黏度、全血低切黏度、血漿比黏度。③凝血功能指標(biāo)：使用全自動(dòng)凝血分析儀測定2組患者治療前后血漿纖維蛋白原(FIB)、凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)及凝血酶時(shí)間(TT)。

1.2 材料大鼠胸大動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞株(A7r5)，復(fù)方丹參滴丸(天津天士力制藥集團(tuán)有限公司)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑salubrinal(美國Sigma-Aldrich公司，No.324895)和ERS(tunicamycin)誘導(dǎo)劑衣霉素(錸博生化科技有限公司，No. LBH4274)，TRizol試劑(美國Sigma公司，No. T9424)；PowerUp SYBR Green Master Mix(No. A25742)(Thermo Fisher Scientific公司)，新生胎牛血清，DMEM/F12、胰蛋白酶(美國Gibco公司)，MTT試劑盒(No ST316)、ROS試劑盒(S0033)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，8OHdG試劑盒(上海博湖生物科技有限公司，BH-M99795)，NO試劑盒(A012-1-2)、SOD試劑盒(A001-3-1)、MDA試劑盒(A003-1-1)(南京建成生物工程研究所)，eNOS酶聯(lián)免疫試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司，YS02062B)，兔抗大鼠Bip/GRP78(ab21685)，ATG5(ab109490)，LC3(ab232940)，P62(ab207305)，bcl-2(ab32124)，bax(ab32503)、caspase-3(ab32351)、IRE1(ab37073))、TARF2(ab126758)、ASK1(ab45178)、p-ASK1(ab278547)、JNK(ab199380)和p-JNK(ab76572)一抗(美國Abcam公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠/兔二抗(上海碧云天生物技術(shù)有限公司A0192/A0208)，引物(上海生工生物工程有限公司)，Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(天津三箭生物技術(shù)有限公司，AO2001-02A-G)，電泳儀(美國BIO-RAD公司)，PCR儀(美國ABI公司)，超微量分光光度計(jì)(美國賽默飛公司)。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 將A7r5細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清及雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基中，于37 ℃和5%CO2的環(huán)境養(yǎng)，定期更換新鮮培養(yǎng)基，待至對(duì)數(shù)生長期進(jìn)行細(xì)胞傳代，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2分組及干預(yù)方法 將對(duì)數(shù)生長期的血管平滑肌分為對(duì)照組、ox-LDL模型組、復(fù)方丹參滴丸組，復(fù)方丹參滴丸+salubrinal組和復(fù)方丹參滴丸+tunicamycin組。ox-LDL模型組給予50 mg·L-1的ox-LDL刺激建立VSMCs增殖遷移模型，復(fù)方丹參滴丸組：在模型組基礎(chǔ)上給予1.0 g·L-1的復(fù)方丹參滴丸浸膏處理，復(fù)方丹參滴丸+salubrinal組：在復(fù)方丹參滴丸組基礎(chǔ)上給予50 nmol·L-1的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑salubrinal處理，復(fù)方丹參滴丸+tunicamycin組：在復(fù)方丹參滴丸組的基礎(chǔ)上給予20 nmol·L-1的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)tunicamycin處理。各組均給藥干預(yù)3 d。

1.3.3MTT增殖實(shí)驗(yàn) 各組培養(yǎng)3 d后取各組對(duì)數(shù)期1×103細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，于培養(yǎng)72 h后，每孔加入20 μL的5 mg·L-1MTT溶液后繼續(xù)培養(yǎng)6 h，離心棄去MTT溶液，加入DMSO 150 μL，混勻10 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀測490 nn處吸光度值，以吸光度值反映活細(xì)胞水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4NO、SOD、MDA、8OHdG測定 利用硝酸還原酶法按照NO試劑盒說明書測定各組細(xì)胞NO含量。

1.3.5eNOS含量測定 按照eNOS酶聯(lián)免疫試劑盒說明書進(jìn)行操作，測定各組細(xì)胞中eNOS的含量。

1.3.6ER染色 處理的細(xì)胞用ER-tracker Blue-White DPX染料(Molecular Probes)在37 ℃黑暗中染色30分鐘。

1.3.7Western blot檢測蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞加入RIPA裂解細(xì)胞。離心后取上清置于EP管中放入-80 ℃冰箱保存。依據(jù)BCA試劑盒使用說明檢測蛋白濃度。以GAPDH作為內(nèi)參，將目標(biāo)蛋白通過SDS-PAGE分離。隨后轉(zhuǎn)至PVDF膜并常溫封閉1 h后使用TBST清洗，使用Bip/GRP78、ATG5、LC3、P62、bcl-2、bax、caspase-3、IRE1、TARF2、ASK1、p-ASK1、JNK和p-JNK單克隆抗體一抗，在4 ℃冰箱孵育過夜。最后使用辣根過氧化酶二抗(1 ∶5 000)孵育并加入ECL顯色液顯色成像。

1.3.8流式檢測細(xì)胞凋亡 對(duì)藥物處理后的細(xì)胞，加入Annexin V-FITC凋亡檢測試劑，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果。

1.3.9免疫共沉淀(CO-IP) 收集VSMCs細(xì)胞(1×108L-1)，并用IP緩沖液(P0013，Beyotime)溶解，然后添加超聲波處理。離心后，上清液與兔抗-IgG(1 ∶8 000)、抗-ASK1(1 ∶100)和BeyoMagTMA+G磁珠反應(yīng)蛋白(P2173，Beyotime)在4 ℃下過夜?？乖贵w蛋白A+G磁珠復(fù)合物洗滌后，用SDS樣品緩沖液洗脫結(jié)合蛋白。最后，我們用Western blot檢測沉淀蛋白。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者臨床治療效果比較2組治療后IMT、斑塊數(shù)目、斑塊面積均明顯低于治療前(P<0.05)，且觀察組治療后以上檢測指標(biāo)均明顯低于對(duì)照組(P<0.05)(Tab 1)。2組治療后全血高切黏度、全血低切黏度、血漿比黏度均明顯低于治療前(P<0.05)，且觀察組治療后以上血液流變學(xué)指標(biāo)均明顯低于對(duì)照組(P<0.05)(Tab 2)。

2.2 各組VSMCs細(xì)胞增殖情況使用不同濃度的復(fù)方丹參滴丸處理ox-LDL模型細(xì)胞，細(xì)胞活力檢測后其LD50為5.126 g·L-1。故選用1.0 g·L-1的復(fù)方丹參滴丸與其它藥物聯(lián)合處理細(xì)胞，與對(duì)照組相比，ox-LDL模型組吸光度值明顯增加(P<0.05)，而與ox-LDL模型組相比，復(fù)方丹參滴丸組和復(fù)方丹參滴丸+salubrinal組則明顯下降，且復(fù)方丹參滴丸+salubrinal下降更為明顯(P<0.05)，復(fù)方丹參滴丸+tunicamycin組則明顯逆轉(zhuǎn)了復(fù)方丹參滴丸的下降(P<0.05)(Fig 1)。

Fig 1 Effects of different concentrations of Fufang Danshendripping pills on activity of vascular smooth muscle cells (A) and proliferation of vascular smooth muscle cells after different interventions

2.3 各組VSMCs NO含量比較Fig 2顯示，與對(duì)照組相比，ox-LDL模型組eNOS和NO含量明顯下降(P<0.05)，而與ox-LDL模型組相比，復(fù)方丹參滴丸組和復(fù)方丹參滴丸+salubrinal組則明顯增加，且復(fù)方丹參滴丸+salubrinal增加更為明顯(P<0.05)，復(fù)方丹參滴丸+tunicamycin組則明顯逆轉(zhuǎn)了復(fù)方丹參滴丸組的下降(P<0.05)。

Fig 2 Comparison of eNOS and NO content of

2.4 各組VSMCs氧化應(yīng)激水平如Fig 3所示，ox-LDL模型組較與對(duì)照組，其中SOD含量顯著降低，而與ox-LDL模型組相比，復(fù)方丹參滴丸組和復(fù)方丹參滴丸+salubrinal組則明顯上調(diào)，且復(fù)方丹參滴丸+salubrinal顯著更為上調(diào)，復(fù)方丹參滴丸+tunicamycin組則明顯逆轉(zhuǎn)了復(fù)方丹參滴丸組的上調(diào)。與對(duì)照組相比，ox-LDL模型組MDA、8OHdG和ROS含量明顯增加，而與ox-LDL模型組相比，復(fù)方丹參滴丸組和復(fù)方丹參滴丸+salubrinal組則明顯下降，且復(fù)方丹參滴丸+salubrinal下降更為明顯，復(fù)方丹參滴丸+tunicamycin組則明顯逆轉(zhuǎn)了復(fù)方丹參滴丸組的下降。

Fig 3 Oxidative stress indexes of

2.5 各組大鼠VSMCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬標(biāo)志蛋白表達(dá)情況使用ER染色、LC3免疫熒光和ER應(yīng)激和自噬相關(guān)蛋白的免疫印跡來驗(yàn)證復(fù)方丹參滴丸對(duì)VSMCs內(nèi)ER應(yīng)激和自噬的作用。在ox-LDL模型細(xì)胞中，活細(xì)胞的典型均勻ER染色模式發(fā)生了劇烈變化并呈現(xiàn)陰影，其中常駐熒光脂質(zhì)易于位于質(zhì)膜上，復(fù)方丹參滴丸組和復(fù)方丹參滴丸+salubrinal組則顯著改善，復(fù)方丹參滴丸+tunicamycin組則明顯逆轉(zhuǎn)了復(fù)方丹參滴丸組的改善作用(Fig 4A)。同時(shí)，與對(duì)照組相比，在ox-LDL模型細(xì)胞中，斑點(diǎn)LC3B綠色信號(hào)明顯增加，相應(yīng)自噬蛋白上調(diào)(Fig 4B)。復(fù)方丹參滴丸組和復(fù)方丹參滴丸+salubrinal組則顯著降低，復(fù)方丹參滴丸+tunicamycin組則明顯逆轉(zhuǎn)了復(fù)方丹參滴丸組的下降。Fig 4C，D顯示，與對(duì)照組相比，ox-LDL模型組Bip/GRP78、ATG5、LC3、P62蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，而與ox-LDL模型組相比，復(fù)方丹參滴丸組和復(fù)方丹參滴丸+salubrinal組則明顯上調(diào)，且復(fù)方丹參滴丸+salubrinal上調(diào)更為明顯，復(fù)方丹參滴丸+tunicamycin組則明顯逆轉(zhuǎn)了復(fù)方丹參滴丸組的下降。

2.6 各組大鼠VSMCs凋亡情況比較對(duì)ox-LDL處理后及不同干預(yù)的VSMCs凋亡情況進(jìn)行檢測。ox-LDL模型組細(xì)胞較對(duì)照組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象，復(fù)方丹參滴丸組和復(fù)方丹參滴丸+salubrinal組則會(huì)逆轉(zhuǎn)ox-LDL對(duì)VSMCs造成的凋亡，復(fù)方丹參滴丸+tunicamycin組這種逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象減弱(Fig 5A，B)。凋亡蛋白檢測結(jié)果顯示(Fig 5C，D)，與對(duì)照組相比，ox-LDL模型組bcl-2明顯下調(diào)，bax和caspase-3蛋白明顯上調(diào)，而與ox-LDL模型組相比，復(fù)方丹參滴丸組和復(fù)方丹參滴丸+salubrinal組則bcl-2明顯上調(diào)，bax和caspase-3明顯下調(diào)，且復(fù)方丹參滴丸+salubrinal上調(diào)或下調(diào)更為明顯，復(fù)方丹參滴丸+tunicamycin組則明顯逆轉(zhuǎn)了復(fù)方丹參滴丸組的上調(diào)和下調(diào)。

Fig 4 Expression of endoplasmic reticulum stress and autophagy marker proteins in VSMCs of

Fig 5 Comparison of VSMCs cell apoptosis

2.7 各組大鼠VSMCs內(nèi)IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路激活情況為了進(jìn)一步研究復(fù)方丹參滴丸與IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路的機(jī)制，我們進(jìn)行了共刺激實(shí)驗(yàn)。IRE1招募TNAF2后可以激活A(yù)SK1，進(jìn)而激活JNK信號(hào)通路使細(xì)胞產(chǎn)生凋亡和自噬[10]。如Fig 6所示，與對(duì)照組相比，ox-LDL模型組細(xì)胞內(nèi)IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路被過度激活，在此基礎(chǔ)上，復(fù)方丹參滴丸會(huì)降低該信號(hào)通路的激活，與salubrinal聯(lián)用作用細(xì)胞后，降低作用更明顯。tunicamycin會(huì)減弱復(fù)方丹參滴丸的作用。

Fig 6 Activation of

3 討論

隨著生活習(xí)慣和生活水平的改變，我國心血管疾病發(fā)病率逐年攀升[11]，動(dòng)脈粥樣硬化是心血管疾病中最為常見的類型之一，在AS病理進(jìn)程中，VSMC異常增殖、凋亡和表型改變發(fā)揮重要作用[12]。因此，抑制VSMC過度增殖和凋亡VSMC可以一定程度上實(shí)現(xiàn)延緩AS的作用，AS屬于“胸痹”“中風(fēng)”“真心痛”等疾病共同發(fā)病基礎(chǔ)，屬于本虛標(biāo)實(shí)證候。中藥在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制VSMC增殖和遷移和調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激失衡多機(jī)理實(shí)現(xiàn)防治AS的作用[13]。

復(fù)方丹參滴丸由丹參、三七、冰片3味中藥組成。丹參為君，三七為臣，冰片引經(jīng)上行，為佐使劑，諸藥合用，共奏協(xié)同互補(bǔ)之效[14]。藥理學(xué)研究表明，復(fù)方丹參滴丸中皂苷類成分具有抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖等保護(hù)作用[15]，但其作用機(jī)制并未完全闡明。故本研究擬從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬這兩方面闡述復(fù)方丹參滴丸對(duì)VSMCs的保護(hù)機(jī)制。本研究使用ox-LDL誘導(dǎo)大鼠VSMCs增殖模型[15]，隨后采用復(fù)方丹參滴進(jìn)行干預(yù)，并為了進(jìn)一步觀察其對(duì)ERS直接調(diào)控作用，在復(fù)方丹參滴干預(yù)基礎(chǔ)上分別聯(lián)用ERS抑制劑和誘導(dǎo)劑，觀察不同干預(yù)大鼠VSMC遷移、凋亡、氧化應(yīng)激、ERS及自噬等影響。結(jié)果顯示，ox-LDL誘導(dǎo)后，大鼠VSMCs增殖和凋亡明顯異常，NO和eNOS水平明顯下降，說明血管平滑肌的功能受損。氧化應(yīng)激水平明顯增加，同時(shí)ERS標(biāo)志物Bip/GRP78，以及ATG5、LC3、P62過度表達(dá)，表明ox-LDL誘導(dǎo)后ERS和自噬過度激活，整體上呈現(xiàn)病理性特征，模型建立成功，而給予復(fù)方丹參滴丸后NO和eNOS明顯升高，氧化應(yīng)激水平明顯減少，表明其改善了VSMCs血管功能，減輕了氧化應(yīng)激，同時(shí)大鼠VSMCs增殖和凋亡得到明顯抑制，同時(shí)Bip/GRP78，以及ATG5、LC3、P62蛋白表達(dá)均明顯減輕，表明復(fù)方丹參滴丸可以明顯減輕過度激活的ERS和自噬，減輕細(xì)胞凋亡和增殖異常，改善了VSMCs血管功能和氧化應(yīng)激。而在給予ERS抑制劑后，上述指標(biāo)均呈現(xiàn)更為明顯的改善，表明復(fù)方丹參滴丸和ERS抑制劑發(fā)揮協(xié)同作用。但在給予ERS誘導(dǎo)劑后，均明顯逆轉(zhuǎn)了復(fù)方丹參滴丸的改善作用，呈現(xiàn)此消彼長的趨勢。

在ERS后，細(xì)胞將激活許多適應(yīng)性功能以響應(yīng)蛋白質(zhì)折疊的變化，未折疊蛋白的積累會(huì)刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中IRE1的自磷酸化和寡聚化。IRE1是一種跨膜蛋白，在ERS條件下維持細(xì)胞存活起著關(guān)鍵作用[16]。在ERS期間，IRE1招募TNAF2，TNAF2反過來激活A(yù)SK1，最后激活JNK信號(hào)通路[17]，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡或自噬。特別是，在接種JNK(c-Jun N端激酶)抑制劑或IRE1缺陷細(xì)胞的細(xì)胞中，ER應(yīng)激觸發(fā)的自噬受到抑制，表明IRE1/JNK級(jí)聯(lián)對(duì)于刺激ER應(yīng)激后的自噬是必需的[10]。當(dāng)ERS的持續(xù)時(shí)間或程度達(dá)到包括自噬在內(nèi)的細(xì)胞適應(yīng)性機(jī)制的極限時(shí)，細(xì)胞死亡程序就會(huì)被激活。細(xì)胞凋亡是最常見的細(xì)胞死亡方式，總是伴隨著高度的半胱天冬酶激活。半胱天冬酶的激活可導(dǎo)致自噬蛋白的裂解，從而導(dǎo)致自噬程序失活，其目的可能是中止其細(xì)胞保護(hù)作用并加速細(xì)胞死亡[18]，故自噬狀態(tài)的初級(jí)細(xì)胞保護(hù)作用未能改善細(xì)胞狀態(tài)后，則會(huì)觸發(fā)細(xì)胞程序性凋亡。進(jìn)一步表明，復(fù)方丹參滴丸可通過調(diào)控ERS維持細(xì)胞適當(dāng)自噬激活程度，減輕了氧化應(yīng)激，從而抑制細(xì)胞過度增殖和凋亡，改善血管功能。為了進(jìn)一步分析復(fù)方丹參滴丸與IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路的作用機(jī)制，我們進(jìn)行了系列實(shí)驗(yàn)分析。我們的研究表明，ox-LDL誘導(dǎo)后，大鼠VSMCs內(nèi)的ERS過度激活，并導(dǎo)致IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路的過度激活。給予復(fù)方丹參滴丸后，降低IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路的過度激活，維持細(xì)胞適當(dāng)自噬激活程度，而在復(fù)方丹參滴丸與ERS抑制劑聯(lián)用后，IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路的過度激活呈現(xiàn)更為明顯的改善，表明復(fù)方丹參滴丸和ERS抑制劑發(fā)揮協(xié)同作用。但在復(fù)方丹參滴丸與ERS誘導(dǎo)劑后，均明顯逆轉(zhuǎn)了復(fù)方丹參滴丸的對(duì)維持IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路正常激活水平。

綜上所述，復(fù)方丹參滴丸通過抑制IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路的過度激活，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，維持適當(dāng)自噬，減輕氧化應(yīng)激，抑制細(xì)胞異常增殖和凋亡，從而保護(hù)血管平滑肌細(xì)胞。但本研究并未加入自噬調(diào)控的誘導(dǎo)劑和抑制劑，并未觀察其對(duì)調(diào)控自噬對(duì)ERS的影響，未進(jìn)行相互作用的研究，這是下一步研究工作的重點(diǎn)，同時(shí)還需在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，提供更堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。