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    消腫噴劑主藥對(duì)體外炎癥模型小鼠白細(xì)胞介素及NLRP3相關(guān)蛋白表達(dá)影響的研究

    2022-05-12 13:09:04李佳思凡靳圓圓王水泉牛淑亮
    陜西中醫(yī) 2022年5期
    關(guān)鍵詞:意義血清差異

    楊 濤,李佳思凡,靳圓圓,王水泉,牛淑亮

    (新疆醫(yī)科大學(xué),新疆 烏魯木齊830011)

    急性骨骼肌損傷是由于患者“經(jīng)脈不通,血?dú)獠恍小?,?dǎo)致的 “氣滯血瘀”。消腫噴劑是以蘇木、梔子等為基礎(chǔ)方,采用現(xiàn)代工藝制成的中藥噴劑[1],具有較好的活血化瘀止痛和抑制急性骨骼肌損傷組織炎性因子表達(dá)等作用[2]。為進(jìn)一步明確消腫噴劑促進(jìn)急性骨骼肌損傷炎癥修復(fù)的作用機(jī)制,研究炎癥在急性骨骼肌損傷修復(fù)過(guò)程中的作用機(jī)制,我們用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)C2C12小鼠成肌細(xì)胞,造成體外細(xì)胞炎性模型,研究NO抑制劑(L-NAME)、NO供體(SNP)和消腫噴劑主藥對(duì)該體外炎癥模型炎癥因子IL-1β、IL-18及NLRP3相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,報(bào)告如下。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 C2C12小鼠成肌細(xì)胞來(lái)源于豐暉生物,細(xì)胞培養(yǎng)條件為DMEM(高糖)培養(yǎng)基+10%胎牛血清(FBS)+1%雙抗(PS),37 ℃,5% CO2,飽和濕度。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇、傳代后,凍存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 消腫噴劑主藥含藥血清制備 參照文獻(xiàn)方法[3],將蘇木、梔子、姜黃、乳香、沒(méi)藥按照5∶5∶3∶2∶2比例混合,制備消腫噴劑主藥含藥血清,備用。

    1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司,型號(hào)iMark),PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司,型號(hào)MyCycler Thermal Cycler),蛋白轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司,型號(hào)Mini-PROTEAN Tetra system),電泳儀(北京六一公司,型號(hào)DYCZ-24DN)。

    1.4 主要試劑 CCK-8細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自全式金生物公司;LPS購(gòu)自SIGMA公司;L-NAME購(gòu)自美侖生物公司;SNP購(gòu)自Sigma公司;Mouse IL-18 ELISA Kit試劑盒購(gòu)自聯(lián)科生物公司;Mouse IL-1β ELISA Kit試劑盒購(gòu)自聯(lián)科生物公司;Anti-ASC antibody購(gòu)自博奧森公司;Anti-NALP3/CIAS1 antibody購(gòu)自博奧森公司;Anti-Caspase-1 P10 antibody購(gòu)自博奧森公司。

    1.5 炎癥模型評(píng)估 參照文獻(xiàn)方法[4-5],LPS干預(yù)C2C12細(xì)胞,進(jìn)行體外炎癥模型造模。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好匯合率達(dá)90%的C2C12細(xì)胞,用完全培養(yǎng)基制備成5×104個(gè)/ml單細(xì)胞懸液,接種至96孔板中(100 μl/孔,即5×103個(gè)/孔)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h貼壁后,分為空白組和LPS干預(yù)組兩組,每組5個(gè)重復(fù);干預(yù)完成后,棄去孔中培養(yǎng)基,每孔加入100 μl配置好的10% CCK-8溶液,置于培養(yǎng)箱中37 ℃孵育,1 h后酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)OD值,并收集細(xì)胞上清,進(jìn)行IL-1β、IL-18檢測(cè)。

    1.6 炎癥模型實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方法 分為空白對(duì)照組、LPS干預(yù)組、NO抑制組、NO激動(dòng)組和消腫噴劑主藥含藥血清組(含藥血清組)五組。

    空白對(duì)照組正常培養(yǎng)6 h;LPS干預(yù)組:LPS(100 ng/ml)干預(yù)6 h;NO抑制組:LPS(100 ng/ml)+L-NAME(2.7 μg/ml)干預(yù)6 h;NO激動(dòng)組:LPS(100 ng/ml)+SNP(8.94 μg/ml)干預(yù)6 h;含藥血清組:LPS(100 ng/ml)+含藥血清干預(yù)6 h。

    1.7 ELISA試劑盒檢測(cè)IL-1β、IL-18蛋白表達(dá) 按炎癥模型實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)后模式,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,進(jìn)行IL-1β、IL-18檢測(cè)。

    1.8 qRT-PCR檢測(cè)ASC、NLRP3、Caspase-1基因表達(dá)情況 按照實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)模式,棄去每組細(xì)胞瓶中的培養(yǎng)基,加入1 ml Trizol消化細(xì)胞,使Trizol平鋪在細(xì)胞層面上,反復(fù)搖晃細(xì)胞培養(yǎng)瓶,直至細(xì)胞消化下來(lái),裝入1.5 ml EP管中。后續(xù)實(shí)驗(yàn)按照qRT-PCR試劑盒說(shuō)明操作。

    1.9 Western blot檢測(cè)ASC、NLRP3、Caspase-1蛋白的表達(dá)情況 按照實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)模式,棄去每組細(xì)胞瓶中的培養(yǎng)基,加入3 ml無(wú)菌的PBS緩沖液反復(fù)沖洗2遍,棄去PBS緩沖液,用胰酶消化細(xì)胞。離心后棄去上清留細(xì)胞沉淀,用5 ml無(wú)菌PBS洗1遍后收集細(xì)胞。后續(xù)按照Western blot試劑盒說(shuō)明操作。

    1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 炎癥模型評(píng)估 LPS干預(yù)后,C2C12細(xì)胞增殖及細(xì)胞上清IL-1β、IL-18表達(dá)情況,見(jiàn)表1。LPS干預(yù)組與空白對(duì)照組OD值比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);細(xì)胞上清IL-1β比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);IL-18表達(dá)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

    表1 LPS對(duì)各組C2C12細(xì)胞增殖及IL-1β、IL-18的影響

    2.2 LPS、L-NAME、SNP和消腫噴劑主藥含藥血清對(duì)C2C12細(xì)胞上清中IL-1β、IL-18含量的影響 見(jiàn)表2。按照實(shí)驗(yàn)分組,分別應(yīng)用LPS、LPS+L-NAME、LPS+SNP和消腫噴劑主藥含藥血清干預(yù)后,ELISA檢測(cè)各組C2C12細(xì)胞上清中IL-1β、IL-18含量結(jié)果。

    表2 各組C2C12細(xì)胞上清中IL-1β、IL-18含量比較(pg/ml)

    IL-1β含量比較,空白對(duì)照組與各干預(yù)組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);LPS干預(yù)組與各組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);NO激動(dòng)組與含藥血清組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    IL-18含量比較,空白對(duì)照組與各干預(yù)組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);LPS干預(yù)組與NO激動(dòng)組、含藥血清組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與NO抑制組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);NO激動(dòng)組與含藥血清組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    2.3 LPS、L-NAME、SNP和消腫噴劑主藥含藥血清對(duì)C2C12細(xì)胞中ASC、Caspase-1、NLRP3 基因表達(dá)和蛋白表達(dá)水平的影響 按照實(shí)驗(yàn)分組,分別應(yīng)用LPS、LPS+L-NAME、LPS+SNP和消腫噴劑主藥含藥血清干預(yù)后,qRT-PCR檢測(cè)小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞ASC、Caspase-1和NLRP3 mRNA表達(dá)水平,見(jiàn)表3。Western blot檢測(cè)結(jié)果各組小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞ASC、Caspase-1和NLRP3 蛋白水平,見(jiàn)表4。

    表3 各組C2CL2細(xì)胞中ASC、Caspase-1、NLRP3 mRNA表達(dá)水平比較

    表4 各組C2CL2細(xì)胞中ASC、Caspase-1、NLRP3蛋白水平比較

    ASC mRNA表達(dá)水平,空白對(duì)照組與LPS干預(yù)組、NO抑制組、NO激動(dòng)組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與含藥血清組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);LPS干預(yù)組與NO抑制組、NO激動(dòng)組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與含藥血清組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);NO激動(dòng)組與含藥血清組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    Caspase-1及NLRP3 mRNA表達(dá)水平,空白對(duì)照組與各干預(yù)組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);LPS干預(yù)組與各組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    ASC 蛋白水平,空白對(duì)照組與LPS干預(yù)組、NO抑制組、NO激動(dòng)組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與含藥血清組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);LPS干預(yù)組與NO抑制組、NO激動(dòng)組、含藥血清組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);NO激動(dòng)組與含藥血清組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    空白對(duì)照組與各干預(yù)組Caspase-1、NLRP3蛋白水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);LPS干預(yù)組與各組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    3 討 論

    外因可致經(jīng)筋受損,氣機(jī)不暢,筋肉失于濡養(yǎng),“凝血蘊(yùn)里不散”,發(fā)為紅腫熱痛。中醫(yī)的“筋”實(shí)指解剖學(xué)肌肉[6],因此急性骨骼肌損傷是由于“經(jīng)脈不通,血?dú)獠恍小?,?dǎo)致的 “氣滯血瘀”。

    消腫噴劑主藥蘇木、梔子、姜黃、乳香、沒(méi)藥等具有較強(qiáng)的活血、祛瘀、行氣功效[1]。NO是由L-精氨酸合成的信號(hào)分子[7-9],NLRP3炎癥小體是由ASC、Caspase-1、NLRP3組成的多蛋白復(fù)合體,炎癥刺激能夠誘導(dǎo)NLRP3炎性小體發(fā)生寡聚化,同時(shí)募集相關(guān)反應(yīng)蛋白[10-12]。

    現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),消腫噴劑主藥蘇木乙醇提取物caesppanin A和tectorigenin,能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞釋放NO,發(fā)揮抗炎作用[13];梔子主要有效成分藏紅花素能夠抑制類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型中一氧化氮合酶(iNOS)的產(chǎn)生和血清TNF-α、IL-1β和 IL-6表達(dá)[14],梔子苷通過(guò)NLRP3/ASC/Caspase-1途徑,抑制系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠模型,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、IL-1β、IL-18等炎癥因子產(chǎn)生[15];姜黃素能夠通過(guò)調(diào)控SIRT1激活途徑[16]和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑[17]影響炎癥反應(yīng);乳香、沒(méi)藥能夠通過(guò)抑制 NF-κB和MAPK 信號(hào)通路[18-20]的活性等抑制炎性介質(zhì)的釋放。

    為了進(jìn)一步研究消腫噴劑促進(jìn)急性骨骼肌損傷炎癥修復(fù)的作用機(jī)制及NO在急性骨骼肌損傷修復(fù)過(guò)程中的作用機(jī)制,我們進(jìn)行了消腫噴劑主藥對(duì)體外炎癥模型IL-1β、IL-18及NLRP3相關(guān)蛋白表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究。

    實(shí)驗(yàn)中我們應(yīng)用LPS干預(yù)C2C12細(xì)胞,成功復(fù)制了體外炎癥模型。分別應(yīng)用NO抑制劑L-NAME、NO激動(dòng)劑SNP以及消腫噴劑主藥含藥血清對(duì)造模細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。發(fā)現(xiàn)LPS干預(yù)C2C12細(xì)胞,造成體外炎癥模型,IL-1β、IL-18表達(dá)明顯。應(yīng)用NO抑制劑L-NAME,抑制NO表達(dá),IL-1β、IL-18表達(dá)明顯提高,而應(yīng)用NO活化劑SNP,進(jìn)一步活化NO表達(dá),IL-1β、IL-18表達(dá)明顯降低,應(yīng)用消腫噴劑主藥含藥血清干預(yù)C2C12細(xì)胞外炎癥模型,能夠顯著降低IL-1β、IL-18表達(dá);qRT-PCR檢測(cè)小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞ASC、Caspase-1和NLRP3 mRNA表達(dá)水平以及Western blot檢測(cè)結(jié)果小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞ASC、Caspase-1和NLRP3 蛋白水平發(fā)現(xiàn),LPS誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞體外炎癥模型,應(yīng)用NO抑制劑L-NAME和NO活化劑SNP,ASC、Caspase-1和NLRP3 mRNA表達(dá)水平和蛋白水平均明顯提高L-NAME或降低SNP,消腫噴劑主藥含藥血清有類(lèi)似SNP作用,能夠顯著降低ASC、Caspase-1和NLRP3 mRNA和蛋白表達(dá)。

    基于以上實(shí)驗(yàn)我們推斷,LPS激活NO-NLRP3-IL炎癥軸,誘導(dǎo)建立C2C12細(xì)胞體外炎癥模型。NO通過(guò)NO/ASC/Caspase-1/NLRP3/IL-1β/IL-18軸,調(diào)控骨骼肌體外炎癥模型炎癥因子表達(dá),消腫噴劑可能通過(guò)干預(yù)NO表達(dá),減輕炎癥反應(yīng),促進(jìn)骨骼肌損傷修復(fù)。

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