升降散治療急性胰腺炎并發(fā)多器官功能障礙機(jī)制研究

代曉玉，吳秋葶，姚佳琦，李 娟，萬美華，唐文富

(四川大學(xué)華西醫(yī)院，四川 成都 610041)

急性胰腺炎(Acute pancreatitis，AP)是臨床上常見的危急重癥[1-2]。當(dāng)患者出現(xiàn)多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)時，其病死率將提高到20%～30%[3]。因此，防治AP并發(fā)MODS是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。失控且不斷放大的炎癥反應(yīng)是AP的重要發(fā)病機(jī)制[4-5]。有文獻(xiàn)指出，升降散能夠抑制炎癥反應(yīng)以保護(hù)AP患者[6]，但升降散進(jìn)入體內(nèi)后發(fā)揮作用的具體機(jī)制和作用靶點(diǎn)并不清楚。色氨酸-犬尿氨酸代謝通路是AP發(fā)病的重要炎癥信號通路之一，通過給予犬尿氨酸-3-單加氧酶抑制劑GSK180可有效調(diào)節(jié)該通路并保護(hù)AP大鼠模型[7]。因此，本研究通過觀察升降散對AP的治療效果和對色氨酸-犬尿氨酸代謝通路的調(diào)節(jié)作用，旨在探討其治療效果及潛在的作用機(jī)制和靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物 24只C57雄性小鼠，體重為(20±5)g，購于四川大學(xué)實(shí)驗動物中心[合格證號：0011537；許可證號：SCXK(川)2018-026]。該實(shí)驗方案通過四川大學(xué)華西醫(yī)院倫理和動物倫理委員會的認(rèn)可(方案編號：2020231A)。實(shí)驗開始前，小鼠在四川大學(xué)華西科技園動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 實(shí)驗藥品及相關(guān)試劑 雨蛙素、脂多糖、犬尿氨酸(Kynurenine,KYN)、犬尿喹啉酸(Kynurenic acid,KYNA)、3-羥基犬尿氨酸(3-Hydroxy-DL-kynurenine，3-HK)均購于SIGMA公司(中國上海)。色氨酸(L-Tryptophan，TRP)、5-羥色胺(Serotonin hydrochloride,5-HT)于上海安譜實(shí)驗科技股份有限公司購買。犬尿氨酸-3-單加氧酶(Kynurenine 3-monooxygenase,KMO)抑制劑GSK180 (CAS:817194-38-0)購于Selleck公司(中國上海)。甲醇(批號：185366)由Fisher Scientific公司提供，甲酸(批號：10010031627)由Fluka Analytical公司提供。10%水合氯醛溶液由四川大學(xué)華西臨床醫(yī)學(xué)院科技園動物房統(tǒng)一提供。10%甲醛在華西科技園病理科老師的指導(dǎo)下，自行配制，具體配制方法如下：200 ml甲醛原液加入雙蒸水1800 ml加入PBS緩沖液粉末(ZLI-9062,中杉金橋)1袋。升降散(僵蠶6 g，蟬蛻3 g，姜黃9 g，生大黃12 g)免煎顆粒購于四川省中醫(yī)院成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。按照原方生藥比例將免煎顆粒混合，再加入適量超純水，超聲溶解30 min，配制出0.5 g/ml濃度的中藥溶液，并在37 ℃溫水浴保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗方法 24只小鼠經(jīng)1周適應(yīng)性喂養(yǎng)后禁食12 h，隨機(jī)分為四組：假手術(shù)組、模型組、升降散治療組與GSK180治療的對照組。假手術(shù)組為非AP-MODS模型組，模型組、治療組與對照組均為AP-MODS模型。根據(jù)已有文獻(xiàn)[8]，本實(shí)驗通過腹腔注射雨蛙素(50 μg/kg，共6次，每次間隔1 h)和脂多糖(10 mg/kg，第7次)獲得小鼠AP-MODS模型。造模2 h后，假手術(shù)組和模型組均用0.9%氯化鈉溶液按5 g/kg劑量灌胃，治療組用0.5 g/ml升降散按5 g/kg劑量灌胃，對照組用KMO抑制劑GSK180按30 mg/kg劑量腹腔注射。整個實(shí)驗過程中，保持禁食不禁飲。造模12 h后，處死小鼠，取血清備用；取胰腺、肺臟、心臟、肝臟、腎臟、結(jié)腸新鮮組織，充分浸泡在10%甲醛中備用。

1.4 指標(biāo)檢測 ①采用全自動生化分析儀(Roche Cedex Bio C501)檢測血清中的淀粉酶、脂肪酶水平。②將血清送往四川廣電檢測中心，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)檢測其中色氨酸-犬尿氨酸通路的主要代謝產(chǎn)物(TRP、5-HT、KYN、3-HK、KYNA)濃度。③將甲醛浸泡固定好的組織送到四川大學(xué)華西醫(yī)院科技園生物技術(shù)中心病理平臺進(jìn)行石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色等處理。處理好的組織標(biāo)本交由兩位病理科老師采用盲法在光學(xué)顯微鏡下分別對胰腺、肺臟、心臟、肝臟、腎臟、結(jié)腸進(jìn)行組織病理性損傷觀察和病理評分(項目編號：XM180096P)。具體的評分標(biāo)準(zhǔn)詳見參考文獻(xiàn)[9-12]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graph Pad Prism 8.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。如數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且滿足方差齊性，則兩組間比較選用t檢驗；如數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布，則兩組間比較選用Mann-Whitney test；P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠血清淀粉酶及脂肪酶水平比較 與假手術(shù)組相比，模型組小鼠血清淀粉酶及脂肪酶水平均明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，升降散治療組小鼠血清淀粉酶及脂肪酶水平均明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，GSK180治療的對照組小鼠血清淀粉酶及脂肪酶水平均明顯降低(P<0.05)。但治療組與對照組小鼠血清淀粉酶及脂肪酶水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠血清淀粉酶及脂肪酶水平比較(U/ml)

2.2 各組小鼠血清色氨酸-犬尿氨酸通路的主要代謝產(chǎn)物水平比較 與假手術(shù)組相比，模型組中TRP、5-HT、KYNA水平均明顯降低， KYN和 3-HK水平均明顯升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，升降散治療組KYNA升高，3-HK降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，GSK180治療的對照組KYN、3-HK水平降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 治療組與對照組相比，僅KYN水平的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠血清色氨酸-犬尿氨酸通路的代謝產(chǎn)物水平比較(ng/ml)

2.3 各組小鼠多個組織病理損傷及評分比較 由各組織病理圖可知，與假手術(shù)組相比，模型組中的胰腺組織出現(xiàn)明顯的腺泡腫脹和間隙增寬，胰腺實(shí)質(zhì)有感染且可見灶狀出血點(diǎn)；在治療組中僅可見小葉間隙增寬，區(qū)域性水腫及胰腺管邊緣輕度感染；對照組中可見胰腺小葉間隙重度增寬，糜爛性水腫，腺泡感染和少許出血。與假手術(shù)組中正常肺臟相比，模型組中肺泡間質(zhì)細(xì)胞腫脹、疏松有缺損，肺泡腔內(nèi)有大量液體，可見灶性炎癥、出血和壞死，并有小血管微血栓乃至中-大灶肺不張形成；而治療組與對照組中炎癥減輕，伴少量壞死及透明微血栓，僅輕微肺不張。與假手術(shù)組中正常心肌相比，模型組中心肌纖維束明顯增寬，炎癥細(xì)胞增多，心肌片狀或彌漫性出血；而治療組及對照組中僅可見少許炎癥細(xì)胞、出血點(diǎn)及心肌纖維囊腫。與假手術(shù)組中正常肝臟相比，模型組中可見肝內(nèi)炎細(xì)胞呈彌漫性浸潤甚至形成膿腫，伴彌漫性空泡變性、出血和片狀壞死；而治療組及對照組中僅可見炎癥細(xì)胞灶性浸潤，輕中度肝竇內(nèi)瘀血。與假手術(shù)組中正常腎臟相比，模型組中炎癥細(xì)胞呈彌漫性浸潤，腎小管出現(xiàn)灶性出血，腎曲管上皮發(fā)生空泡變性；治療組中可見腎內(nèi)局灶性炎癥，腎小管點(diǎn)灶性出血，近曲小管上皮濁腫變形；而對照組中僅可見腎內(nèi)點(diǎn)灶狀炎癥，腎小管點(diǎn)灶性出血，近曲小管上皮輕度濁腫變形。與假手術(shù)組中正常結(jié)腸相比，模型組中可見廣泛炎細(xì)胞浸潤，灶性出血，黏膜下線樣間隙，黏膜表層輕度糜爛脫落；而治療組與對照組中結(jié)腸腺體感染面積減少，僅固有層毛細(xì)血管充血(圖1)。

圖1 各組小鼠多個組織病理圖(HE染色，×200)

相應(yīng)的，與假手術(shù)組相比，模型組中胰腺、肺臟、心臟、肝臟、腎臟和結(jié)腸的組織病理評分明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，升降散治療組多個組織病理評分降低，其中胰腺、肺臟、腎臟和結(jié)腸的評分差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，GSK180治療的對照組除結(jié)腸以外多個組織的病理評分明顯降低(P<0.05)。治療組與對照組相比，胰腺與腎臟的病理評分差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠多個組織病理評分比較(分)

3 討 論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，AP屬“脾心痛、結(jié)胸、胰癉”范疇，其發(fā)病部位在脾，與肝、膽、胃密切相關(guān)，并涉及心、肺、腎、腸等多個臟器[13-14]。AP的病理性質(zhì)以里、實(shí)、熱證為主，其主要病機(jī)是各種致病因素引發(fā)的氣機(jī)不暢，脾胃運(yùn)化失司，進(jìn)而導(dǎo)致實(shí)熱內(nèi)蘊(yùn)，熱瘀互結(jié)[15]。“腑氣不通，不通則痛”，故而本病的治療應(yīng)遵循通里攻下的原則。升降散，首見于明代張鶴騰的《傷暑全書》，由僵蠶、蟬蛻、姜黃、大黃構(gòu)成，具有升清降濁、解郁宣透、降火泄熱之功效[16]。已有文獻(xiàn)報道[17]，升降散可顯著降低AP患者的炎性指標(biāo)，并改善其臨床癥狀及預(yù)后。本次實(shí)驗中，經(jīng)升降散治療AP后，小鼠的血清淀粉酶、脂肪酶及包括胰腺在內(nèi)的多個器官組織病理評分均明顯低于AP模型組。這一結(jié)果提示，升降散不僅可以有效治療AP，并能保護(hù)多個遠(yuǎn)端器官，緩解MODS。已有研究表明，升降散可能是通過調(diào)控促炎-抗炎反應(yīng)來防治AP-MODS，但具體的機(jī)制和靶點(diǎn)并不清楚[6]。急性胰腺炎發(fā)作時，持續(xù)失控的全身炎癥反應(yīng)會消耗大量的氧氣和能量來滿足身體的需求，導(dǎo)致營養(yǎng)代謝紊亂[18]。當(dāng)氨基酸代謝紊亂時，有害代謝物會積聚并誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，增加全身炎癥反應(yīng)，加重器官組織損傷[19-20]。色氨酸-犬尿氨酸代謝通路是AP發(fā)病的重要炎癥信號通路之一，色氨酸(TRP)是人體無法合成的九種必需氨基酸之一，主要的代謝途徑是通過KYN途徑[21]。文獻(xiàn)表明，TRP-KYN代謝通路與急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[22]。在正常情況下，TRP主要代謝產(chǎn)物為KYN(95%)和5-HT，其中，KYN的增加通常伴隨炎性反應(yīng)的增強(qiáng)[23-24]。KYN進(jìn)一步生成 KYNA、3-HK和喹啉酸[25]。其中，喹啉酸可以促進(jìn)炎癥，而KYNA可通過抵抗喹啉酸間接減輕炎癥[26]。3-HK可加劇炎癥反應(yīng)并導(dǎo)致細(xì)胞損傷，是 AP-MODS發(fā)病機(jī)制的核心[27]。KMO是KYN代謝為3-HK的關(guān)鍵限速酶[28]。由此可知，調(diào)控TRP-KYN炎性通路可能是治療AP-MODS的重要途徑；抑制KMO活性，減少促炎產(chǎn)物3-HK生成，可能是治療AP-MODS的重要靶點(diǎn)。在本研究中，經(jīng)AP-MODS造模后的小鼠，血清中TRP-KYN通路中的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物均較假手術(shù)組發(fā)生顯著改變，且促炎產(chǎn)物KYN、3-HK明顯增加，抗炎產(chǎn)物KYNA明顯下調(diào)，提示該通路為AP-MODS發(fā)病的重要信號通路之一。有實(shí)驗證明，采用KMO特效抑制劑GSK180治療后的AP-MODS大鼠模型，其多器官病理損傷明顯減輕[7]。本實(shí)驗中，采用GSK180治療后，對照組小鼠的血清指標(biāo)和多器官病理評分明顯下降，且促炎產(chǎn)物KYN、3-HK濃度明顯下降。該結(jié)果從小鼠AP-MODS模型中再次驗證調(diào)節(jié)TRP-KYN炎性通路，抑制KMO活性是治療AP-MODS的重要途徑。此外，本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，經(jīng)升降散治療的AP-MODS小鼠，血清中TRP-KYN通路代謝物水平改變，且促炎產(chǎn)物3-HK明顯下調(diào)，抗炎產(chǎn)物KYNA明顯上調(diào)，其作用效果與GSK180特效抑制劑高度類似。因此，我們推測，升降散對AP-MODS的保護(hù)機(jī)制可能與調(diào)節(jié)TRP-KYN炎性通路，抑制KMO活性密切相關(guān)。但本實(shí)驗尚不能說明升降散與GSK180誰更能有效抑制KMO活性，需要更進(jìn)一步的研究。

通過比較各組的病理損傷情況，我們發(fā)現(xiàn)雨蛙素與脂多糖聯(lián)合使用造模后，胰腺及胰腺外器官均出現(xiàn)明顯的病理損害，即AP-MODS模型建立成功，這與近期文獻(xiàn)報告中的結(jié)果一致[29]。雖然GSK180與升降散均可顯著減輕多個器官的病理損傷，表現(xiàn)出相似的AP-MODS保護(hù)效果，但二者在胰腺和腎臟中的病理評分差異是具有統(tǒng)計學(xué)意義的。其中，升降散治療組的胰腺病理評分顯著低于對照組，這就提示升降散可能較GSK180能更好的保護(hù)AP病程中的胰腺組織。而對照組的腎臟病理評分顯著低于升降散治療組，提示GSK180可能較升降散能更好地保護(hù)AP病程中的腎臟組織。這一結(jié)果可能為臨床上藥物的合理使用提供依據(jù)，但需要更多的研究來證實(shí)。