特異性高效價腺病毒中和抗體血漿抗體滴度消長性研究

張春敏 黨潤 楊文敏 陳卓瑤 戎霞 馮立強 劉文寬 楊鎰宇 陳飛燕*

兒童重癥腺病毒肺炎是兒童重癥監(jiān)護室常見的疾病，部分患兒進展加重可導致急性呼吸窘迫綜合征（ARDS），甚至死亡，這一類疾病可嚴重威脅兒童生命及健康［1］。然而，目前針對重癥腺病毒肺炎尚無有效特異性治療措施，僅對癥支持治療為主。特異性高效價腺病毒中和抗體血漿（Specific High level Adenovirus Neutralizing Antibodies Plasma，SHL-ANAP）是指從健康獻血志愿者的血漿中篩查出腺病毒中和抗體滴度大于1∶1 000 的特異性血漿［2，3］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，早期應用篩選出來的高效價腺病毒中和抗體血漿治療兒童重癥腺病毒肺炎取得良好的效果，可減少發(fā)熱時間及降低死亡率［4］。然而，腺病毒中和抗體相關生物制劑目前尚處在研發(fā)階段，因此，建立特異性高效價腺病毒中和抗體血漿庫，將其儲備用于治療重癥腺病毒感染具有重大的臨床意義。

經過篩查的SHL-ANAP，需要按照現(xiàn)行的血液制品保存方式進行保存儲備備用，經過-20℃保存后，其抗體滴度是否發(fā)生變化尚不明確。因此，我們檢測了篩查出的SHL-ANAP 保存1 年前后的抗體滴度，以明確經篩選出的SHL-ANAP 保存效果，了解其抗體滴度變化，進一步指導優(yōu)化SHL-ANAP的臨床使用。

1 臨床材料

1.1 一般資料由廣州血液中心輸血研究所從健康獻血志愿者的血漿中篩查出的SHL-ANAP（3型或7 型，中和抗體滴度＞1∶1 000），以及它們在常規(guī)-20℃冷庫保存1 年后的樣本。該研究經醫(yī)院倫理委員會批準（穗婦兒 科倫 通字（2020）第56100號），患者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法由廣州血液中心留存健康獻血志愿者的血樣運用分泌型堿性磷酸酶（SEAP）報告腺病毒微量中和檢測法檢測其樣本抗體滴度。鎖定SHL-ANAP 后發(fā)放至廣州市婦女兒童醫(yī)療中心輸血科保存和臨床應用。1 年后，將剩余12 份樣本再次應用該方法進行抗體滴度檢測。

1.3 SHL-ANAP 檢測方法SEAP 報告腺病毒微量中和檢測法［3］是用無酚紅的DMEN 培養(yǎng)基對12份血漿進行梯度稀釋，共設置了5 個稀釋梯度，分別為1∶18，1∶72，1∶288，1∶1152 和1∶4608，加入等體積的SEAP 報告病毒（4.0×107vp/ml），用SEAP 試劑盒（Phospha-Light System，AB，T1016）進行檢測，使用熒光照度計，檢測吸光值，根據(jù)吸光值變化計算待測血漿的滴度，以抑制了50%的吸光值的血清稀釋度作為待測血漿的滴度，并以血清的滴度≥1∶72 視為陽性血清，＜1∶72 視為陰性血清。

1.4 統(tǒng)計方法使用SPSS 25.0 軟件分別對ADV3型、ADV7 型冰凍保存前后的血漿腺病毒中和抗體滴度進行配對Wilcoxon 秩和檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

共留存12 份特異性高效價腺病毒中和抗體血漿進行抗體滴度檢測，其中8 份ADV3 型高效價腺病毒中和抗體血漿，4 份ADV7 型高效價腺病毒中和抗體血漿。結果顯示，凍存前后12 份腺病毒中和抗體血漿抗體滴度具有不同程度地下降，但均大于1∶1000（見表1）。Wilcoxon 配對秩和檢驗結果顯示，ADV3 型、ADV7 型高效價血漿冰凍保存前后血漿抗體滴度均無顯著差異（P＞0.05，見表2）。

表1 SHL-ANAP 凍存前后抗體滴度的變化

表2 ADV3、ADV7 凍存前后抗體滴度變化比較（配對Wilcoxon 秩和檢驗）

3 討 論

近年來許多研究顯示，早期應用康復者血漿治療重癥病毒感染患者取得良好的療效，例如埃博拉病毒、流感病毒、SARS 冠狀病毒等感染者，早期通過輸注相應康復者血漿后病情明顯好轉、病毒載量顯著降低［5，6］。然而也有一部分研究表明重癥病毒感染者使用相應康復者血漿無法顯著降低病死率［7］，這可能與相應康復者血漿中不含有中和抗體或者中和抗體滴度較低有關。我們前期研究采用經篩選的SHL-ANAP 治療重癥腺病毒肺炎患兒亦取得良好的療效［4］，因我們所應用的SHLANAP 篩查出的抗體滴度均大于1∶1000，且可選擇性的輸入與患兒腺病毒分型相同的高效價血漿，從而取得較好的治療效果。此外，我們應用的高效價血漿是由廣州血液中心從普通血漿篩選而來，來源可靠且價格便宜，不會增加患兒家庭經濟負擔。因而，高效篩查SHL-ANAP 并可妥當保存其抗體滴度，對于應用于救治重癥腺病毒感染病人有重要意義，并為后續(xù)SHL-ANAP 血漿庫的建立提供一定的依據(jù)。

目前用于檢測血清中腺病毒中和抗體的主要方法分為兩類：一種采用細胞病變法，孵育腺病毒與抗體后，檢測細胞的活性或者觀察感染細胞的病變效應；另一種則采用報告基因法，血清中的中和抗體可以有效地抑制病毒感染從而減少報告基因的數(shù)量及表達程度，而后可通過檢測被抑制程度來確定中和抗體水平，本研究所使用的SEAP 報告腺病毒微量中和檢測法屬報告基因法。傳統(tǒng)的細胞病變法由于檢測周期較長（4-8 d），觀察相對主觀，且靈敏度較低，對于快速準確檢測并不適用［8］；而SEAP 報告腺病毒微量中和檢測法除了可大大減少檢測時間（30 h）外，還具備更為簡便快捷的操作方法，并且重復性好。 SEAP 報告腺病毒微量中和檢測法可實現(xiàn)快速和大樣本的檢測，非常適合用于SHL-ANAP 的篩查。

常規(guī)操作中，新鮮冰凍血漿可置于溫度≤-18℃冷庫冰凍保存1 年，而普通血漿則可保存4 年［9］。目前有研究顯示，新型冠狀病毒感染患者恢復期特異性血漿的抗體滴度在冰凍狀態(tài)下至少可以維持4 個月不衰減［10］。然而，目前并沒有相關研究顯示SHL-ANAP 冰凍保存后抗體滴度的變化情況。本研究經篩查后的SHL-ANAP 立即置于-20℃冷庫冰凍保存，1 年后ADV3 型、ADV7 型抗體滴度雖然有下降趨勢，但與凍存1 年前相比，差異并無顯著性意義。而且，凍存1 年后的SHL-ANAP 抗體滴度仍均＞1∶1000，說明目前SHL-ANAP 保存方法能達到保存效果，一年的-20℃冰凍存儲不會影響高效價血漿的效價滴度，意味著大批量篩查出高效價血漿后可以-20℃冰凍保存，為腺病毒流行到來時做好戰(zhàn)略儲備。另外，這一結果也為高效價血漿保存期的界定提供一定的數(shù)據(jù)支持。

本研究觀察發(fā)現(xiàn)SHL-ANAP 在-20℃冰凍儲存1 年后仍有較高的抗體滴度，可以繼續(xù)用于重癥腺病毒患兒的救治中。另外，SEAP 報告腺病毒微量中和檢測法能夠用于大規(guī)模篩查和評估高效價血漿的中和抗體滴度。但是由于本研究樣本量較小且檢測方法稀釋梯度不足導致部分數(shù)據(jù)未得到最高值，后期尚需擴大樣本量及增加稀釋梯度進一步研究。