紫蘇甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因PfPMK的克隆與表達分析

李 輝，溫春秀，劉靈娣，溫賽群，唐映紅，姜 濤

(1.湖南文理學院 生命與環(huán)境科學學院，湖南 常德 415000；2.河北省農(nóng)林科學院 經(jīng)濟作物研究所，河北 石家莊 050051)

紫蘇(Perillafrutescens(L.)Britt.)是唇形科紫蘇屬一年生草本植物，莖高0.3～2.0 m，葉全綠、全紫或一面綠一面紫，主要分布于中國、不丹、印度、中南半島、印度尼西亞(爪哇)、日本、朝鮮[1]。紫蘇適應性強，在我國各地廣泛栽培，對土壤要求不嚴，在排水較好的砂質(zhì)壤土、壤土、黏土上均能良好生長，適宜土壤pH值6.0～6.5，生長適宜溫度25 ℃。紫蘇作為藥食同源類藥用植物，其入藥部分以莖、葉、種子為主，葉具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、解毒等功效；紫蘇葉子又可食用，可包生魚片吃，具有解毒和暖胃之功效，和肉類煮熟可增加肉類的香氣。莖有平氣安胎之功效；種子能鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘等，紫蘇種子榨出的油，名蘇子油，可供食用，又具有防腐作用[2]。

甲羥戊酸途徑(Mevalonate pathway，MVA)是以乙酰輔酶A為原料合成異戊烯基焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸的一條代謝途徑，存在于所有植物中，是類固醇、類萜等生物分子的合成前體。甲羥戊酸-5-磷酸激酶(5-phosphomevalonate kinase，PMK)屬于GHMP激酶超級家族成員，是MVA途徑上游的第5個關鍵酶，也是MVA途徑中依賴ATP的第2個限速酶，其功能是將ATP上的γ位磷酸基團轉移到甲羥戊酸-5-磷酸上生成甲羥戊酸-5-二磷酸[3]。國內(nèi)外有關植物PMK的研究報道較少，國外的Sando等[4]從巴西橡膠樹中克隆出PMK基因；序列比對顯示，該基因與擬南芥、水稻同源基因相似性為61%～73%。Niu等[5]從檀香木中克隆出PMK基因，基因表達分析顯示，該基因在根和成熟葉中高表達。國內(nèi)的Xiao等[6]對擬南芥GHMP家族基因進行了全基因組鑒定、分類和表達分析，共挖掘出12個GHMP家族基因，其中包括甲羥戊酸激酶(MK)和甲羥戊酸-5-磷酸激酶(PMK)。Ma 等[7]對丹參基因組進行分析，共挖掘出40個丹參萜類生物合成相關基因，包括5個SmDXS、1個SmPMK等。此外，已從陽春砂[8]、茉莉花[9]、獨行菜[10]、香樟[11]等植物中分離克隆出PMK基因。PMK基因在紫蘇萜類物質(zhì)的生物合成過程中起著重要的調(diào)控作用，但目前紫蘇PMK基因還未見報道，本研究首次從紫蘇中克隆了甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因，對其開展了生物信息學分析和特異性表達模式分析，旨在為進一步研究紫蘇萜類物質(zhì)的生物合成提供參考基因。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

紫蘇種子播種在營養(yǎng)缽中，一個月后將紫蘇根、莖、葉樣品洗凈液氮速凍，用于紫蘇RNA的提取。RNA提取試劑盒、cDNA反轉錄試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、熒光定量SYBR試劑盒等購自天根生化科技(北京)有限公司；pMD19-T載體、高保真DNA聚合酶PrimeSTAR DNA Polymerase購自寶生物工程(大連)有限公司；大腸桿菌DH5α購自北京蕾創(chuàng)生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 紫蘇RNA的提取及cDNA的合成 使用天根的RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒(目錄號：DP432)提取紫蘇根、莖、葉的總RNA；利用QuantScript RT Kit(天根，北京)Quant cDNA第一鏈合成試劑盒(目錄號：KR103)進行紫蘇的第一鏈cDNA合成。

1.2.2 紫蘇引物合成 在紫蘇轉錄組數(shù)據(jù)基礎上，挖掘出紫蘇萜類物質(zhì)生物合成關鍵基因-甲羥戊酸-5-磷酸激酶的基因序列(c110706.graph_c0)，利用Primerer 5.0軟件設計該基因的引物：PfPMK-F 5′-ATGGCAGTGGTTGCTTCTG-3′，PfPMK-R 5′-TCACTCAATATGAATGGAAGAAAC-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司北京合成部進行引物的合成。

1.2.3 紫蘇PfPMK基因克隆 以紫蘇cDNA為模板，利用TaKaRa公司高保真DNA聚合酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase擴增PfPMK基因的開放閱讀框(ORF)全長。50 μL擴增體系如下：10.0 μL 5×PrimeSTAR Buffer，4.0 μL dNTP Mixture，1.0 μLPfPMK-ORF-F，1.0 μLPfPMK-ORF-R，1.0 μL Template cDNA，0.50 μL PrimeSTAR DNA Polymerase，32.5 μL ddH2O。PCR擴增程序如下：94 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 2 min，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存。對PCR反應產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠檢測，在含有適量核酸染料的1%(m/V)瓊脂糖凝膠上，以180 V/cm的電壓在1×TAE電極緩沖液中電泳，待電泳指示劑溴酚藍至凝膠的2/3處，取出凝膠置于紫外成像儀中檢測。使用天根生化科技(北京)有限公司瓊脂糖凝膠回收試劑盒(DP209)進行PCR產(chǎn)物的回收。PCR回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接轉化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，并挑取陽性單克隆菌液送到生工進行序列測序。

1.2.4 紫蘇PfPMK基因生物信息學分析 使用在線軟件ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam)預測紫蘇PfPMK基因的分子量、等電點；利用NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast同源性分析(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)；利用Mega 4軟件對PfPMK編碼的氨基酸序列進行親緣關系分析；使用在線軟件WoLF-PSORT(https：//wolfpsort.hgc.jp)、NetNGlyc 1.0 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc)、NetPhos 3.1 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos)、SignalP 4.1 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1)、SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)、SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org)對PfPMK蛋白進行亞細胞定位、糖基化位點、磷酸化位點和蛋白激酶結合位點、信號肽和氨基酸二、三結構等預測。

1.2.5 紫蘇PfPMK基因表達分析 使用實時熒光定量PCR的方法對紫蘇不同組織部位和5個不同生長時期(2020年8月21日、2020年8月31日、2020年9月10日、2020年9月20日、2020年9月30日)的紫蘇樣品進行PfPMK基因表達分析，以紫蘇肌動蛋白基因Actin(c86816.graph_c0)為內(nèi)參基因，利用在線軟件Primer 3 Input(version 0.4.0)進行熒光定量PCR引物設計，引物分別為PfActin-F 5′-TTAACACCCCCGCAATGTAT-3′，PfActin-R 5′-TAGCCTCGCTCCGTCAGTAT-3′；PfPMK-RT-F 5′-GATCATCAACGCCATCACTG-3′，PfPMK-RT-R 5′-TGCTCCGTCTCTCCACTTTT-3′。熒光定量PCR所采用的設備為ABI PRISM 7500(操作軟件為7500 和7500 Fast Real-Time PCR Systems，v2.0.1，USA)，熒光染料為SYBR Green。參照RealMaster Mix(SYBR Green，天根，北京)試劑盒說明書草操作，20 μL反應體系如下：10 μL SYBR Green PCR Master Mix，0.5 μLPfPMK-QRT-F，0.5 μLPfPMK-QRT-R，2.0 μL cDNA(1 ng)，7 μL ddH2O。擴增條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃ 保存。每個反應3次重復，使用2-ΔΔCt法分析紫蘇PfPMK基因表達量。

2 結果與分析

2.1 紫蘇PfPMK基因cDNA克隆與序列分析

根據(jù)紫蘇轉錄組數(shù)據(jù)注釋基因信息，本研究發(fā)現(xiàn)一個紫蘇PMK注釋基因(c110706.graph_c0)，以此序列信息設計引物，對紫蘇PMK進行基因克隆。利用PCR法擴增獲得一條1 500 bp左右的片段，與參考序列c110706.graph_c0大小一致(圖1-A)。將PCR產(chǎn)物膠回收連到測序載體pMD19-T上，轉化大腸桿菌DH5α進行單克隆測序。對測序信息進行分析，本研究獲得紫蘇PMK基因開放閱讀框(ORF)全長為1 524 bp，編碼507個氨基酸(圖1-B)，命名為PfPMK。PfPMK氨基酸組成中，蘇氨酸(Thr)含量為28.4%，甘氨酸(Gly)含量為27.2%，丙氨酸(Ala)含量為25.4%，半胱氨酸(Cys)含量為19.0%，使用ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)預測PfPMK基因的分子質(zhì)量為54.73 ku，等電點為5.20，分子式為C2431H3874N646O746S20，其半衰期為4.4 h，不穩(wěn)定指數(shù)為39.99，歸類為穩(wěn)定蛋白，脂肪族指數(shù)為27.56，總平均親水性為0.697。結合ExPasy-ProtSCale在線軟件預測PfPMK蛋白親/疏水性，結果顯示，PfPMK蛋白疏水性最強的位點是第474個氨基酸，疏水最高值為2.344，親水性最強的位點是第326個氨基酸，親水性最低值為-2.833(圖2-A)，但整個氨基酸預測值分析結果顯示，該蛋白整體趨向于親水性，為親水蛋白。

圖1 PfPMK基因克隆及氨基酸序列Fig.1 Cloning of PfPMK gene and amino acid sequence

2.2 紫蘇PfPMK基因生物信息學分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫對紫蘇PfPMK基因進行Blast分析(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，同源分析表明，PfPMK氨基酸與SmPMK(丹參，Salviamiltiorrhiza，AEZ55675.1)、SsPMK(一串紅，Salviasplendens，XP_042024853.1)、SbPMK(半枝蓮，Scutellariabarbata，QEY10159.1)和PvPMK(夏枯草，Prunellavulgaris，QEV81810.1)的同源性比較高，同源性分別為90.77%，88.41%，85.27%，85.77%(圖2-B)，說明紫蘇PfPMK蛋白在進化過程中保守性較強。通過NCBI蛋白質(zhì)保守結構域數(shù)據(jù)庫對PfPMK蛋白進行保守結構域預測，結果顯示，PfPMK蛋白存在一個典型的磷酸甲羥戊酸激酶結構域(圖2-C)。利用Mega 4軟件對PfPMK基因編碼的氨基酸序列進行親緣關系分析，結果表明，PfPMK與丹參和一串紅的PMK親緣關系很近(圖2-D)。

圖2 PfPMK基因生物信息學分析Fig.2 Bioinformatics analysis of PfPMK gene

利用在線軟件WoLF-PSORT進行PfPMK蛋白亞細胞定位預測，結果顯示，該蛋白定位于質(zhì)膜的系數(shù)為4.5，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的系數(shù)為4.5，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的系數(shù)為3.5，葉綠體的系數(shù)為3。TMHMM Sever v2.0預測PfPMK蛋白跨膜結構域顯示，該蛋白整個序列都在膜外，沒有跨膜結構域，不屬于跨膜蛋白(圖3-A)。NetNGlyc 1.0 Server在線軟件預測PfPMK蛋白糖基化位點，發(fā)現(xiàn)該蛋白不含有糖基化位點(圖3-B)。利用NetPhos 3.1 Server預測PfPMK蛋白的磷酸化位點和蛋白激酶結合位點(圖3-C)，預測值大于0.5的共發(fā)現(xiàn)81個磷酸化位點，包括55個絲氨酸位點、15個蘇氨酸位點和11個酪氨酸位點。SignalP 4.1 Server在線軟件預測PfPMK蛋白的信號肽，根據(jù)C值、S值和Y值都低于閾值0.5，結果顯示，該蛋白不含有信號肽位點，屬于非分泌蛋白(圖3-D)。

2.3 紫蘇PfPMK基因編碼氨基酸結構預測

利用在線軟件SOPMA對PfPMK基因編碼氨基酸的二級結構進行預測，結果顯示，該蛋白二級結構中α螺旋(Alpha helix)有211個，占比為41.62%；無規(guī)則卷曲(Random coil)有202個，占比為39.84%；延伸鏈(Extended strand)有72個，占比為14.20%；β折疊(Beta turn)有22個，占比為4.34%，表明PfPMK蛋白主要以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主的蛋白二級結構(圖4)。利用在線軟件SWISS-MODEL對PfPMK基因編碼氨基酸的三級結構進行模型建立，以2r42.1.A蛋白為模板，用于建立該模型的氨基酸殘基為第2-501位，覆蓋范圍為72%，序列一致性為21.21%，序列相似度為30%(圖5)。

圖3 PfPMK蛋白分析Fig.3 Protein analysis of PfPMK

圖4 PfPMK氨基酸結構預測Fig.4 Amino acid structure prediction of PfPMK

2.4 紫蘇PfPMK基因表達譜分析

實時熒光定量PCR對紫蘇不同組織部位的PfPMK基因表達進行分析，結果表明，PfPMK基因在紫蘇的根、莖、葉中有不同程度的表達，但差異不顯著，其中PfPMK基因在紫蘇根中的表達量高于在莖和葉中的表達量(圖5-A)。為了研究紫蘇PfPMK基因不同生長時期的表達情況，本研究在紫蘇收獲前2個月進行采樣，共分5個時間點，取樣間隔時間為10 d，每次3個生物學重復。實時熒光定量PCR結果顯示，PfPMK基因在紫蘇不同生長時期的表達量有差異，以8月21日的樣本為對照，8月31日、9月20日和9月30日樣本PfPMK基因表達量與對照有顯著差異，特別是9月20日的樣本PfPMK基因表達量顯著高于對照(圖5-B)。

不同小寫字母表示與對照相比差異顯著(P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant difference compared with the control(P<0.05).

3 結論與討論

紫蘇原名“蘇”，是我國衛(wèi)生部首批頒發(fā)的既是藥品又是食品的60種藥食同源植物之一[12]。紫蘇全草入藥，是常用中藥之一。根據(jù)《名醫(yī)別錄》、《食療本草》、《本草圖經(jīng)》和《本草綱目》記載 “紫蘇，除寒熱，治冷氣，治肺氣喘急”[2]；2020版《中國藥典》記載的紫蘇主要來源于唇形科植物紫蘇，具有降氣消痰，平喘，潤腸之功效[13]。目前，國內(nèi)外對紫蘇的研究主要在紫蘇不同采收期代謝物含量、揮發(fā)油成分、紫蘇提取物對抗病機理的研究等方面，如Luo等[14]對不同栽培時期紫蘇葉中酚酸類物質(zhì)含量的變化進行了研究；Ju 等[15]開展了不同紫蘇種質(zhì)資源精油活性成分的研究；Paradee等[16]對泰國紫蘇進行研究表明，其酒精提取物中含有大量的木犀草素、芹菜素、金圣草黃素以及葡萄糖苷衍生物，能夠抑制腫瘤壞死因子中微粒子的生成、降低細胞ICAM-1和IL-6因子的表達活性。

紫蘇主要藥效成分是紫蘇醛(Perillaldehyde，PAE)，又稱為二氫枯茗醛，是從紫蘇葉中提取出來的無色至淺黃色，具有櫻桃、辛香和桂醛似的特殊香氣的單萜化合物的油狀液體[17-18]。紫蘇醛屬于單萜類化合物，是植物次生代謝產(chǎn)物中最大的一個家族，在自然界中廣泛分布。甲羥戊酸途徑是植物萜類物質(zhì)生物合成的一條代謝途徑，其中PMK屬于GHMP激酶超級家族成員，其功能是將ATP上的γ位磷酸基團轉移到甲羥戊酸-5-磷酸上生成甲羥戊酸-5-二磷酸。甲羥戊酸途徑中相關基因的研究主要集中在甲羥戊酸途徑中下游基因的研究，如檀香木中倍半萜烯合酶可以提高倍半萜類物質(zhì)的生物合成甲羥戊酸途徑[19-22]，細胞色素P450加氧酶可以將倍半萜烯類碳水化合物轉化為倍半萜烯醇類化合物[23-24]。

最近幾年隨著高通量測序技術的發(fā)展，萜類合成途徑中的關鍵酶相繼被挖掘。Song等[25]利用轉錄組測序技術，從銀杏中挖掘出萜類化合物生物合成關鍵酶PMK，從分子水平上研究了GbPMK基因在銀杏葉中萜類物質(zhì)生物合成中的功能。Woo等[26]進一步研究表明，過量表達PMK基因可以增加萜類物質(zhì)的含量。

本研究根據(jù)紫蘇轉錄組數(shù)據(jù)，挖掘出紫蘇萜類物質(zhì)生物合成途徑中的一個關鍵酶PMK，利用基因克隆技術首次從紫蘇中克隆了PfPMK基因，該基因開放閱讀框全長為1 524 bp，編碼507個氨基酸。生物信息學分析顯示，PfPMK的分子質(zhì)量為54.73 ku，等電點為5.20，分子式為C2431H3874N646O746S20，為親水蛋白。親緣關系分析顯示，PfPMK與丹參和一串紅的PMK親緣關系很近。在線軟件WoLF-PSORT預測PfPMK蛋白定位于質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的系數(shù)較高，而Simkin等[27]研究長春花的PMK蛋白定位在過氧化物酶體上，Niu等[5]研究認為檀香木的PMK蛋白定位在胞質(zhì)上。本研究將進一步構建PfPMK的亞細胞定位載體，明確PfPMK在細胞中的定位情況。PfPMK基因在紫蘇根中的表達量高于在葉和莖中的表達量，這與人參[28]和檀香木[5]PMK基因表達情況相一致。紫蘇不同生長發(fā)育時期的熒光定量PCR分析顯示，PfPMK基因在9月中下旬高表達，是否預示著紫蘇萜類物質(zhì)的含量會升高，還有待于進一步驗證。本研究結果將為紫蘇萜類物質(zhì)代謝通路相關基因的研究提供理論支撐。