希金斯炭疽菌效應(yīng)子基因ChEP085的功能研究

祝一鳴，劉艷瀟，何九卿，段靈濤，周而勛

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物病理學(xué)系，廣東省微生物信號(hào)與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642)

炭疽菌(Colletotrichumspp.)是一類重要的植物病原真菌，該真菌在2012年被評(píng)選為世界十大植物病原真菌之一[1]。希金斯炭疽菌(C.higginsianum)是炭疽菌中一種典型的半活體營養(yǎng)型真菌，能夠侵染諸多十字花科植物，如蕓薹屬(Brassica)、蘿卜屬(Raphanus)植物以及模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)等，引起十字花科炭疽病[2-3]。菜心(B.parachinensis)是華南地區(qū)特產(chǎn)蔬菜之一，該地區(qū)高溫高濕的氣候條件，非常有利于菜心炭疽病的發(fā)生，該病一旦發(fā)生，輕則影響蔬菜的外觀品質(zhì)，重則造成30%～40%的減產(chǎn)[4]。目前，十字花科炭疽病的防控手段主要以化學(xué)農(nóng)藥防治為主，選育和推廣抗病品種為輔，但總體來說仍缺乏十分有效的防治措施。由于希金斯炭疽菌易于在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)，也便于進(jìn)行基因操作，同時(shí)該菌的完整基因組數(shù)據(jù)及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)也已測(cè)序完成并公布[3，5]?；谝陨线@些條件，希金斯炭疽菌-擬南芥互作體系非常適合作為植物病害系統(tǒng)模型來研究這類真菌的致病機(jī)制，因而對(duì)于探索植物炭疽病新的防控策略具有重要的意義。

病原菌在侵染植物過程中，會(huì)分泌與植物相互作用的蛋白，這類蛋白稱為效應(yīng)蛋白或效應(yīng)子(Effector)，在植物細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著重要作用，從而影響病原菌與植物的相互作用結(jié)果[6]。植物可以利用2層免疫系統(tǒng)來保護(hù)自身以免受外界病原菌的侵染。首先，植物細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors，PRRs)檢測(cè)到保守的病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，并觸發(fā)植物第1道免疫防線—病原相關(guān)分子模式觸發(fā)的免疫(PAMP triggered immunity，PTI)；其次，當(dāng)病原菌效應(yīng)子被寄主植物相應(yīng)的抗性蛋白直接或間接識(shí)別之后，寄主植物的第2道防線—效應(yīng)子觸發(fā)的免疫(Effector-triggered immunity，ETI)則被激活[7]。一般來說，PTI提供植物更基礎(chǔ)和更為廣泛的抗性，而ETI則給植物提供了更強(qiáng)烈和更加特異性的免疫反應(yīng)，如過敏性反應(yīng)[8]。近年來，隨著真菌和植物的基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的增多，關(guān)于植物-真菌互作方面的研究取得了重大進(jìn)展。在與植物的互作過程中，真菌能夠分泌數(shù)百種被稱為效應(yīng)子的蛋白質(zhì)來操縱寄主生理過程或抑制寄主免疫，以利于病原真菌的侵染[9]。由于許多效應(yīng)子是改變寄主新陳代謝和發(fā)育方向的工具，它們的合成數(shù)量和合成時(shí)機(jī)都被病原菌嚴(yán)格控制，以達(dá)到最佳的、平衡的結(jié)果，特別是在需要保持寄主生存能力的活體營養(yǎng)階段。現(xiàn)有的研究表明，多種病原真菌能嚴(yán)格控制效應(yīng)子合成時(shí)機(jī)及其分泌位置和方式，如稻瘟病菌、玉米黑粉菌[10-12]。與此同時(shí)，眾多轉(zhuǎn)錄組試驗(yàn)也證明了效應(yīng)子在真菌侵染階段特異性表達(dá)，如專性活體營養(yǎng)病原菌青楊葉銹菌(Melampsoralarici-populina)、半活體營養(yǎng)真菌希金斯炭疽菌、專性活體營養(yǎng)真菌大麥布氏白粉菌(Blumeriagraminis)、根際共生菌印度梨形孢(Serendipitaindica)等[5，13-15]。因此，在真菌侵染階段特異性表達(dá)并誘導(dǎo)植物過敏性壞死成為篩選效應(yīng)子的有效手段之一。

本研究基于本研究室前期預(yù)測(cè)的希金斯炭疽菌候選效應(yīng)子進(jìn)行篩選[16]，得到一個(gè)能穩(wěn)定引起煙草葉片死亡、且在侵染階段有特異性表達(dá)的候選效應(yīng)子ChEP085，并對(duì)該效應(yīng)子進(jìn)行深入的分析，明確其功能，以期更好地了解希金斯炭疽菌的致病機(jī)理，為十字花科植物炭疽病的防控提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及植物材料

希金斯炭疽菌國際標(biāo)準(zhǔn)菌株IMI349063由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院黃俊斌教授惠贈(zèng)，在PDA培養(yǎng)基、28 ℃黑暗下培養(yǎng)，備用。大腸桿菌(Eschrichiacoli)DH5α購買于擎科公司；根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)卵菌與真菌分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，現(xiàn)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室留種保存；根癌農(nóng)桿菌AGL1由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)群體微生物研究中心鄧懿禎教授惠贈(zèng)，現(xiàn)由本實(shí)驗(yàn)室留種保存。本氏煙草(Nicotianabenthamiana)種子由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)卵菌與真菌分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，現(xiàn)由本實(shí)驗(yàn)室留種保存；植物培養(yǎng)室中培育，光照16 h/25 ℃、黑暗8 h/22 ℃，選取生長至35 d的煙草用于試驗(yàn)。擬南芥Col-0，光照16 h/22 ℃，黑暗8 h/20 ℃培養(yǎng)28 d，用于試驗(yàn)。

馬鈴薯X病毒(PotatovirusX，PVX)表達(dá)載體PVX用于煙草瞬時(shí)表達(dá)，抗生素選擇性標(biāo)記為卡那霉素(Kanamycin)，INF1(來自致病疫霉(Phytophthorainfestans)的凋亡誘導(dǎo)蛋白)已構(gòu)建在PVX表達(dá)載體上，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)卵菌與真菌分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。增強(qiáng)型綠色熒光表達(dá)載體pBinceGFP，抗生素選擇性標(biāo)記為卡那霉素，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)卵菌與真菌分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。敲除載體為pFGL821，載體大小8 401 bp，抗性標(biāo)記為卡那霉素和潮霉素(HygromycinB)，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)群體微生物研究中心鄧懿禎教授惠贈(zèng)?；匮a(bǔ)載體為pFGL822-NeoR，載體大小8 288 bp，抗性標(biāo)記為卡那霉素和新霉素(Neomycin)，由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 候選效應(yīng)子基因表達(dá)模式分析 收集希金斯炭疽菌野生型(Wild type，WT)的分生孢子。并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將孢子懸浮液濃度調(diào)至1.0×106個(gè)/mL，隨后均勻噴灑接種至擬南芥葉片上，置于光照培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)(光照16 h/26 ℃，黑暗8 h/25 ℃)，分別于接種后的6，12，24，36，48，60 h收取擬南芥葉片樣品，每個(gè)時(shí)間段3株重復(fù)，液氮速凍后，按照TaKaRa Mini BEST plant RNA Extration Kit RNA提取試劑盒步驟進(jìn)行提取，剩余樣品保存于-80 ℃冰箱備用。以提取的總RNA為模板，按照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Code No.RR047A)反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟合成第1鏈cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)采用擎科2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR Green I)Lot#TSE202，按照說明使用20 μL反應(yīng)體系，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀(Bio-Rad CFX96)運(yùn)行，程序?yàn)椋?4 ℃ 30 s；40 個(gè)循環(huán)(95 ℃ 5 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s)；95 ℃ 10 s。以希金斯炭疽菌的Actin基因作為內(nèi)參基因，相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。試驗(yàn)中的所有引物見表1。

表1 使用的PCR引物Tab.1 Primers used in this study

1.2.2 煙草瞬時(shí)表達(dá)和煙草葉片酒精脫色觀察 注射基質(zhì)的配制：10 mmol/L MgCl2，10 mmmol/L MES，150 μmol/L AS。菌液制備：挑取含有目的基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101單菌落至5 mL含有50 mg/L卡那霉素和100 mg/L利福平的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)48 h；室溫5 000 r/min離心3 min，棄上清；加入3 mL 10 mmol/L MgCl2重懸，室溫5 000 r/min離心3 min，棄上清；加入配好的注射基質(zhì)，使用分光光度計(jì)調(diào)OD600為0.5，28 ℃黑暗孵育2 h。

選取長勢(shì)良好的煙草植株，從頂端向下數(shù)第3～6片真葉注射農(nóng)桿菌，每個(gè)處理注射不同植株的3片葉片以上；做好標(biāo)記后于植物培養(yǎng)室中繼續(xù)培養(yǎng)。每片煙草葉片上注射4個(gè)位點(diǎn)，左上角注射PVX-HA空載體作為陰性對(duì)照，右上角注射PVX-INF1作為陽性對(duì)照，左下角注射PVX-ChEP085，右下角注射PVX-ChEP085-noSP，設(shè)置5個(gè)重復(fù)，6 d后觀察誘導(dǎo)壞死試驗(yàn)結(jié)果。為了便于觀察煙草葉片的壞死效果和程度，可對(duì)煙草葉片進(jìn)行脫色處理。剪下煙草葉片拍照后放入培養(yǎng)皿，加入無水乙醇至沒過葉片，室溫置于脫色搖床上，100 r/min脫色24～36 h，待葉綠素完全褪去后拍照觀察。

1.2.3 ChEP085信號(hào)肽功能研究 ChEP085生物信息學(xué)分析，即從NCBI網(wǎng)站搜索ChEP085(locus_tag="CH063_11815，product="hypothetical protein"，protein_id="CCF41571.1)，確定基因大小及mRNA序列，使用SignalP 4.1(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，Conserved Domain Datebase預(yù)測(cè)有無已知功能的結(jié)構(gòu)域。

ChEP085信號(hào)肽誘導(dǎo)或抑制煙草葉片壞死研究。為明確信號(hào)肽對(duì)誘導(dǎo)煙草葉片壞死或?qū)NF1誘導(dǎo)的壞死的影響，分別將效應(yīng)子全長及缺失信號(hào)肽序列單獨(dú)注射煙草、與INF1共注射煙草觀察試驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果，設(shè)計(jì)缺失信號(hào)肽序列引物。以PVX-ChEP085質(zhì)粒為模板，將缺失信號(hào)肽序列構(gòu)建至PVX表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101后先單獨(dú)注射煙草，驗(yàn)證ChEP085缺失信號(hào)肽后是否影響誘導(dǎo)煙草葉片壞死的功能。注射方法參照1.2.2。

ChEP085信號(hào)肽對(duì)亞細(xì)胞定位的影響：為明確希金斯炭疽菌效應(yīng)子ChEP085的亞細(xì)胞定位及信號(hào)肽對(duì)亞細(xì)胞定位的影響，將效應(yīng)子ChEP085全長序列與缺失信號(hào)肽序列構(gòu)建到含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的綠色熒光表達(dá)載體pBinceGFP上。轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌進(jìn)行煙草注射，方法參照1.2.2。亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)進(jìn)行全葉片注射，注射后48 h切下煙草葉片，制作水玻片，利用熒光顯微鏡在波長480 nm下觀察葉片下表皮細(xì)胞中綠色熒光分布情況并進(jìn)行拍照。

1.2.4 效應(yīng)子基因ChEP085敲除菌株的獲取與驗(yàn)證 以希金斯炭疽菌基因組DNA為模板進(jìn)行所需基因片段克隆，將質(zhì)粒pFGL821進(jìn)行雙酶切，選用Hind Ⅲ和SalⅠ酶切位點(diǎn)，作為上游片段重組位點(diǎn)進(jìn)行重組連接，測(cè)序驗(yàn)證連接正確后，將其命名為p821-85us。繼續(xù)對(duì)質(zhì)粒p821-85us進(jìn)行雙酶切，選用BamH Ⅰ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)，作為下游片段重組位點(diǎn)進(jìn)行重組連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并進(jìn)行菌落驗(yàn)證，菌落驗(yàn)證正確后送公司測(cè)序，測(cè)序驗(yàn)證連接正確后提取質(zhì)粒，將其命名為敲除質(zhì)粒p821-85ko。利用T-DNA介導(dǎo)的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得敲除轉(zhuǎn)化子經(jīng)過抗性篩選、PCR驗(yàn)證，獲得候選敲除轉(zhuǎn)化子[17]。利用Southern Blot技術(shù)對(duì)候選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行拷貝數(shù)驗(yàn)證，具體參照Gu等[18]關(guān)于敲除突變體的獲取與驗(yàn)證的方法進(jìn)行。

1.2.5 效應(yīng)子基因ΔChEP085互補(bǔ)菌株的獲取與驗(yàn)證 將質(zhì)粒pFGL822-NeoR進(jìn)行單酶切，選用EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)，使用試劑盒VazymeCloneExpress Ⅱ One Step Cloning Kit重組連接，具體操作參照1.2.4，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后進(jìn)行PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證引物使用HBAtg8-F/R，測(cè)序驗(yàn)證正確后，將其命名為p822-85hb?；パa(bǔ)菌株的獲取與驗(yàn)證方法同1.2.4。

1.2.6 野生型菌株、ΔChEP085突變菌株及CΔChEP085互補(bǔ)菌株基本生長情況的測(cè)定 用打孔器分別在野生型菌株、ΔChEP085突變菌株和CΔChEP085互補(bǔ)菌株上打取直徑為6 mm 的新鮮菌餅，接種于 PDA 培養(yǎng)基中心位置，每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)重復(fù)。在 28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d 后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，并記錄菌落的生長形態(tài)。

1.2.7 野生型菌株、ΔChEP085突變菌株及CΔChEP085互補(bǔ)菌株產(chǎn)孢量測(cè)定 用打孔器取6 mm的野生型菌株、ΔChEP085突變菌株及CΔChEP085互補(bǔ)菌株的新鮮菌餅若干，分別接種到含 150 mL PDB 培養(yǎng)基的錐形瓶中，28 ℃搖床振蕩培養(yǎng) 5 d，過濾，5 000 r/min離心 10 min，過濾收集分生孢子，使用血球計(jì)數(shù)板對(duì)每個(gè)菌株產(chǎn)生分生孢子的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.8 野生型菌株、ΔChEP085突變菌株及CΔChEP085互補(bǔ)菌株致病力的測(cè)定 參照1.2.7獲得希金斯炭疽菌野生型菌株和各敲除突變體的孢子懸浮液，調(diào)孢子濃度為1.0×106個(gè)/mL，采用噴霧接種的方法接種活體擬南芥，每個(gè)菌株噴霧接種3株擬南芥，擬南芥葉面與葉背都噴霧接種完全后放進(jìn)塑料盆中，并在塑料盆上鋪上一層保鮮膜，于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)光照條件為16 h光照、8 h黑暗，培養(yǎng)4 d后觀察活體擬南芥發(fā)病情況并拍照記錄。

接種后第5天，按照表2 所列的病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)擬南芥進(jìn)行病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)。

表2 擬南芥接種希金斯炭疽菌后的病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 Disease grading criteria for Arabidopsis thaliana inoculated with Colletotrichum higginsianum

病情指數(shù)=∑(病級(jí)葉片株數(shù)×病級(jí)數(shù)值)/(葉片總和×發(fā)病最高級(jí)的代表數(shù)值)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 ChEP085生物信息學(xué)分析

希金斯炭疽菌ChEP085基因(GenBank登錄號(hào)：OBR03416)的序列長度為675 bp，無內(nèi)含子，編碼224個(gè)氨基酸，翻譯產(chǎn)物為假定蛋白；通過SingnalP 4.1 分析表明，其N端含有一段21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列(圖1)，利用Conserved Domain Datebase進(jìn)行預(yù)測(cè)，未發(fā)現(xiàn)已知功能的結(jié)構(gòu)域。

圖1 希金斯炭疽菌效應(yīng)子ChEP085在SingnalP 4.1的信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.1 Signal peptide prediction of effector ChEP085 of Colletotrichum higginsianum in SingnalP 4.1

2.2 ChEP085基因在希金斯炭疽菌侵染擬南芥過程中誘導(dǎo)表達(dá)

為探索效應(yīng)子ChEP085在希金斯炭疽菌侵染寄主過程中的表達(dá)情況，分析了ChEP085基因在分生孢子懸浮液噴霧接種擬南芥6，12，24，36，48，60 h后的表達(dá)情況，0 h樣品為菌絲。從圖2可看出，ChEP085基因在菌絲中有一定表達(dá)；在侵染后，ChEP085基因一開始表達(dá)量較低，在24 h有最大表達(dá)量，之后該基因表達(dá)量下降，達(dá)到接種初期水平。

圖2 希金斯炭疽菌效應(yīng)蛋白基因ChEP085的表達(dá)模式Fig.2 Expression patterns of effector gene ChEP085 of Colletotrichum higginsianum

2.3 效應(yīng)子ChEP085的亞細(xì)胞定位

由圖3可知，表達(dá)空載pBinceGFP的綠色熒光在細(xì)胞核(紅色箭頭指示)和細(xì)胞膜上均有分布，表明載體上的綠色熒光蛋白在煙草細(xì)胞中成功表達(dá)；重組表達(dá)載體pBinceGFP-ChEP085的綠色熒光大部分分布在細(xì)胞膜上，有少量堆積在細(xì)胞質(zhì)中；而重組表達(dá)載體pBinceGFP-ChEP085-noSP的綠色熒光在細(xì)胞核(紅色箭頭指示)、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中都有定位。以上結(jié)果說明，信號(hào)肽在效應(yīng)子ChEP085的定位過程中起到重要作用。

2.4 ChEP085信號(hào)肽的功能研究

為明確效應(yīng)子ChEP085信號(hào)肽的功能，將其缺失信號(hào)肽的序列構(gòu)建至PVX表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)注射煙草，注射6 d后觀察葉片壞死情況。以空載PVX為陰性對(duì)照、INF1為陽性對(duì)照，表達(dá)效應(yīng)子ChEP085和去除信號(hào)肽的效應(yīng)子ChEP085-noSP，6 d后觀察壞死情況，結(jié)果顯示，去除信號(hào)肽后，仍能引起煙草葉片壞死反應(yīng)(圖4)，說明信號(hào)肽的缺失不影響ChEP085引起煙草葉片壞死的功能。

A.空載pBinceGFP熒光分布；B.pBinceGFP-ChEP085熒光分布；C.pBinceGFP-ChEP085-noSP熒光分布。A.The localization of empty vector pBinceGFP under fluorescence microscope；B.The localization of pBinceGFP-ChEP085；C.The localization of pBinceGFP-ChEP085-noSP.

A.含有相應(yīng)重組載體的農(nóng)桿菌菌液處理注射 6 d 后的本氏煙表型觀察；B.本氏煙葉片經(jīng)過脫色處理后的表型觀察。1.PVX；2.PVX-INF1；3.PVX-ChEP085；4.PVX-ChEP085-noSP。

2.5 效應(yīng)子基因ChEP085的敲除及回補(bǔ)

本研究采用同源重組的方法對(duì)編碼該蛋白的基因進(jìn)行敲除，之后再將該基因回補(bǔ)，以驗(yàn)證該效應(yīng)子的功能，敲除策略如圖5所示。

圖5 ChEP085基因敲除策略Fig.5 Knockout strategy of gene ChEP085

以清水和希金斯炭疽菌野生型菌株基因組DNA為對(duì)照，使用3對(duì)引物對(duì)敲除突變體進(jìn)行驗(yàn)證。使用ChEP085基因引物85-F和85-R進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，基因敲除突變體不能擴(kuò)增到條帶，而希金斯炭疽菌野生型菌株可擴(kuò)增得到大小為675 bp的條帶(圖6-A)；使用潮霉素基因引物Hyg-F和Hyg-R擴(kuò)增時(shí)，基因敲除突變體可以擴(kuò)增得到一條大小為865 bp的條帶，而希金斯炭疽菌野生型菌株不能擴(kuò)增到條帶(圖6-B)；使用基因敲除引物85ko-F和85ko-R擴(kuò)增時(shí)，基因敲除突變體可以擴(kuò)增得到一條大小為2 515 bp的條帶，而希金斯炭疽菌野生型菌株擴(kuò)增得到一條大小為1 770 bp的條帶(圖6-C)。

A.引物85-F/R擴(kuò)增PCR產(chǎn)物；B.引物Hyg-F/R擴(kuò)增PCR產(chǎn)物；C.引物85ko-F/R擴(kuò)增PCR產(chǎn)物。M.DL5000 Marker；1—4.ΔChEP085-1/-2/-6/-8 敲除轉(zhuǎn)化子；5.雙蒸水；6.野生型菌株。A.PCR products were amplified using primers 85-F/R；B.PCR products were amplified using primers Hyg-F/R；C.PCR products were amplified using primers 85ko-F/R.M.DL5000 Marker；1—4.ΔChEP085-1/-2/-6/-8 knockout mutants；5.ddH2O；6.Wild type.

本研究一共驗(yàn)證得到4株正確的基因敲除突變體，分別命名為ΔChEP085-1、ΔChEP085-2、ΔChEP085-6、ΔChEP085-8，之后再隨機(jī)選取2個(gè)突變體ΔChEP085-2、ΔChEP085-8，以希金斯炭疽菌野生型菌株基因組DNA為對(duì)照，進(jìn)行Southern Blot驗(yàn)證。由于選取探針位置在潮霉素基因上，故希金斯炭疽菌野生型菌株基因組沒有雜交條帶，而基因敲除突變體雜交得到一條大小為2 577 bp的條帶，如圖7所示，結(jié)果證明了ChEP085基因被成功敲除，且替換目的基因的潮霉素基因片段在基因敲除突變體中為單拷貝。后期選取ΔChEP085-8基因敲除突變體(后統(tǒng)稱為ΔChEP085)進(jìn)行了相關(guān)生物學(xué)性狀的觀察。

1.野生型菌株；2.基因敲除突變體ΔChEP085-2；3.基因敲除突變體ΔChEP085-8。1.Wild type；2.ΔChEP085-2 knockout mutant；3.ΔChEP085-8 knockout mutant.

回補(bǔ)突變體經(jīng)過G418的初步篩選后，以希金斯炭疽菌野生型菌株和基因敲除突變體DNA為對(duì)照，使用2對(duì)引物對(duì)基因回補(bǔ)突變體進(jìn)行驗(yàn)證：使用引物85-F和85-R擴(kuò)增時(shí)，希金斯炭疽菌野生型菌株和基因回補(bǔ)突變體可以擴(kuò)增得到一條大小為672 bp的條帶，而基因敲除突變體不能擴(kuò)增到條帶(圖8-A)；使用引物G418-F和G418-R擴(kuò)增時(shí)，野生型菌株和基因敲除突變體不能擴(kuò)增到條帶，只有基因回補(bǔ)突變體可擴(kuò)增得到大小為715 bp的條帶(圖8-B)。最后得到4株驗(yàn)證正確的基因回補(bǔ)菌株，包括M12、2-13、8-7、8-9。后期選取M12回補(bǔ)突變體(后統(tǒng)稱為CΔChEP085)進(jìn)行了相關(guān)生物學(xué)性狀的觀察。

A.引物85-F/R擴(kuò)增結(jié)果；B.引物G418-F/R擴(kuò)增結(jié)果；M.DS2000 Marker；1.雙蒸水；2.野生型菌株；3.ΔChEP085突變體；4.回補(bǔ)質(zhì)粒p822-85hb；5—9(M12、2-13、8-5、8-7、8-9).回補(bǔ)轉(zhuǎn)化子。

2.6 野生型菌株、ΔChEP085突變菌株及互補(bǔ)菌株基本生長情況的測(cè)定

菌絲生長5 d后(圖9-A)，觀察菌落形態(tài)，同時(shí)測(cè)量菌落直徑發(fā)現(xiàn)，野生型菌株、ΔChEP085突變菌株及互補(bǔ)菌株的菌落形態(tài)無顯著差異，菌落直徑也無顯著差異(圖9-B)。

A.PDA 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；B.菌落直徑比較；圖中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。不同字母表示在 P<0.05 時(shí)差異顯著。圖10—11同。

2.7 野生型菌株、ΔChEP085突變菌株及CΔChEP085互補(bǔ)菌株產(chǎn)保量及致病力情況分析

為明確ChEP085基因?qū)Ξa(chǎn)孢量的影響，對(duì)希金斯炭疽菌野生型菌株、ΔChEP085突變菌株及互補(bǔ)菌株的產(chǎn)孢量進(jìn)行了測(cè)定(圖10)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ΔChEP085突變菌株的產(chǎn)孢量顯著低于野生型和CΔChEP085(P<0.05)。說明ChEP085基因在希金斯炭疽菌產(chǎn)孢中起著重要的作用。

圖10 野生型菌株、ΔChEP085突變菌株及CΔChEP085互補(bǔ)菌株的產(chǎn)孢量分析Fig.10 Analysis of conidia production of wild type，ΔChEP085 mutants and CΔChEP085 conplementary strains

此后，為研究該效應(yīng)子對(duì)致病力的影響，分別將野生型、ΔChEP085和CΔChEP085菌株的孢子濃度調(diào)節(jié)到1.0×106個(gè)/mL，然后噴灑至寄主植物擬南芥葉片上，在27 ℃、濕度100%、12 h/12 h光照/黑暗交替條件下培養(yǎng)5 d后，再觀察發(fā)病情況(圖11-A)。根據(jù)葉片的發(fā)病面積，劃分為不同的病級(jí)，并統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ΔChEP085突變菌株的病情指數(shù)為42.0±2.65，顯著低于野生型90.0±6.7和CΔChEP085菌株87.7±2.52(P<0.05)(圖11-B)。說明該效應(yīng)子ChEP085在希金斯炭疽菌致病過程中起到了重要作用。

A.野生型、ΔChEP085突變菌株及CΔChEP085互補(bǔ)菌株孢子噴灑擬南芥5 d后，擬南芥的發(fā)病情況；B.對(duì)應(yīng)的病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)。

3 結(jié)論與討論

近年來，隨著越來越多的病原真菌基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的完成，針對(duì)各種真菌效應(yīng)子的研究也逐漸深入，炭疽菌屬中效應(yīng)子的功能也越來越多地被揭示。在平頭炭疽菌(C.truncatum)中，效應(yīng)子CtNUDIX在活體營養(yǎng)階段后期表達(dá)，在煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)該基因能誘導(dǎo)類似過敏性反應(yīng)(HR)的細(xì)胞死亡，過表達(dá)該基因?qū)е虏≡ブ虏×?；膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)效應(yīng)子CgDN3能抑制寄主HR反應(yīng)，其敲除突變體喪失對(duì)寄主植物的侵染能力[19]；黃瓜炭疽菌(C.orbiculare)的分泌蛋白NIS1能誘導(dǎo)本氏煙草細(xì)胞死亡，且這一壞死反應(yīng)能在侵染后期被CgDN3所抑制[20]，另一個(gè)效應(yīng)子CoDN3能抑制NIS1誘導(dǎo)的煙草細(xì)胞壞死，表明其具有抑制ETI途徑的功能[19-20]，CoMC69對(duì)黃瓜炭疽菌成功侵染起關(guān)鍵作用[20]；而在希金斯炭疽菌中，基于全基因組測(cè)序，為研究關(guān)鍵致病基因提供了條件，其中侵染早期階段(附著胞穿透和活體營養(yǎng)階段)有大量編碼假定分泌效應(yīng)子的基因被激活[5]，這些效應(yīng)子可能干擾或抑制植物免疫反應(yīng)以促進(jìn)病原菌的侵染。其中，效應(yīng)子ChELP1和ChELP2抑制幾丁質(zhì)觸發(fā)的寄主免疫反應(yīng)，且ChELP1是希金斯炭疽菌發(fā)揮毒力所必需的效應(yīng)子[21]；候選效應(yīng)子ChEC6和ChEC36集中分泌在附著胞孔處，而ChEC34、ChEC89則聚集在初生菌絲附近的界面體中[22]。

本研究基于本實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果[16]，借助煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)和qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，ChEP085效應(yīng)子能夠穩(wěn)定引起煙草壞死，并且在亞細(xì)胞定位試驗(yàn)中顯示綠色熒光蛋白(即ChEP085與綠色熒光蛋白融合表達(dá))聚集在細(xì)胞膜，ChEP085基因在整個(gè)侵染階段保持較低表達(dá)量的同時(shí)，在侵染擬南芥后24 h表達(dá)量明顯提高，說明編碼候選效應(yīng)子ChEP085的基因在希金斯炭疽菌侵染寄主的早期階段(附著胞穿透和活體營養(yǎng)階段)被激活，與此類似的是禾谷炭疽菌(C.graminicola)中，效應(yīng)子Cgf1和CgEP1就是在活體營養(yǎng)階段進(jìn)行表達(dá)并幫助病原菌在寄主體內(nèi)成功定殖的[23-24]。因此，效應(yīng)子ChEP085很可能在此時(shí)對(duì)病原菌的成功侵染發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本研究對(duì)編碼ChEP085效應(yīng)蛋白的基因進(jìn)行敲除發(fā)現(xiàn)，該基因?qū)τ谙＝鹚固烤揖纳L和菌落形態(tài)幾乎沒有影響，但與野生型和CΔChEP085菌株相比，ΔChEP085突變體的產(chǎn)孢量及致病力均顯著降低。說明ChEP085基因與希金斯炭疽菌的產(chǎn)孢能力和致病力密切相關(guān)。綜上，效應(yīng)子ChEP085在希金斯炭疽菌體內(nèi)可能參與希金斯炭疽菌產(chǎn)孢的調(diào)控；在希金斯炭疽菌侵染過程中，ChEP085可能在活體營養(yǎng)階段被大量分泌，定殖于寄主植物的細(xì)胞膜上，并抑制寄主植物的免疫反應(yīng)，幫助病原菌侵入寄主植物。