小麥TaSPP基因的克隆及表達(dá)分析

景凡麗，張沛沛，苗永平，陳 濤，劉 媛，楊德龍

(1.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

小麥(TriticumaestivumL.)是我國四大主糧作物之一，為全球35%以上的人口提供了大約20%的總熱量和蛋白。近年來由于區(qū)域性、季節(jié)性干旱日益頻發(fā)，嚴(yán)重影響小麥生長發(fā)育，從而導(dǎo)致小麥不同程度減產(chǎn)[1-2]。因此，提高小麥自身抗旱性，培育耐旱品種，降低干旱對小麥產(chǎn)量的影響是小麥抗旱節(jié)水研究的熱點(diǎn)問題。研究表明，在小麥生育后期，干旱加速旗葉衰老，光合速率下降，在這種情況下，儲存在莖稈和葉鞘中的可溶性碳水化合物(Water-soluble carbohydrates，WSC)成為籽粒灌漿的主要碳源，對補(bǔ)償籽粒灌漿、改善粒質(zhì)量和產(chǎn)量形成具有重要作用[3-4]。因此，研究干旱調(diào)控小麥莖稈可溶性碳水化合物積累轉(zhuǎn)運(yùn)的生理和分子調(diào)控機(jī)制對旱地小麥分子遺傳改良具有重要意義。

蔗糖作為可溶性碳水化合物的組成部分，在平衡小麥“源-流-庫”關(guān)系中起著至關(guān)重要的作用。蔗糖作為光合作用的最終產(chǎn)物，從葉片中轉(zhuǎn)運(yùn)出來，并通過韌皮部的篩管、伴侶細(xì)胞復(fù)合物進(jìn)行運(yùn)輸[5]，蔗糖運(yùn)輸?shù)綆炱鞴俸蟊幻附到猓瑸榉枪夂掀鞴俚纳L和淀粉等貯藏積累提供了必要的碳源[6]。同時，蔗糖還可以作為滲透保護(hù)劑和低溫防護(hù)劑增強(qiáng)植物對非生物脅迫的耐受性[7]。

蔗糖磷酸酶和蔗糖磷酸合成酶作為合成蔗糖的關(guān)鍵酶，在蔗糖合成中具有重要的作用。SPS基因已經(jīng)在小麥、水稻(OryzasativaL.)、玉米(ZeamaysL.)、馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)和甘蔗(SaccharumofficinarumL.)等作物中被克隆，且SPS活性與蔗糖積累呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，SPS基因序列包含3個同源基因，在時間和空間表達(dá)各不相同[8-9]。在棉花(Gossypiumspp.)和番茄(LycopersiconesculentumL.)中發(fā)現(xiàn)過表達(dá)株系的SPS基因活性增加[10-11]。Nemati等[12]對2個干旱和敏感小麥品種進(jìn)行干旱處理，發(fā)現(xiàn)在耐旱小麥品種中，SPS活性更高，說明干旱促使SPS基因的表達(dá)。相比于SPS基因，SPP基因研究相對薄弱。因此，本研究通過克隆TaSPP的cDNA序列，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并利用實(shí)時熒光定量PCR分析TaSPP基因的組織表達(dá)模式以及對各種非生物脅迫響應(yīng)的表達(dá)特性，以期為小麥抗逆分子遺傳改良提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

供試小麥品種為晉麥47。

挑取大小均勻的種子30粒，用2%的次氯酸鈉消毒5 min，無菌水沖洗，置于滅菌的培養(yǎng)皿中加入蒸餾水，放置于人工氣候室中培養(yǎng)，光周期為16 h光照/8 h黑暗。待幼苗長至兩葉一心時，選擇長勢一致的幼苗，進(jìn)行非生物脅迫處理，采用200 mmol/L NaCl、20%PEG-6000、100 μmol/L ABA和IAA處理小麥幼苗，分別脅迫0，3，6，12 h后用剪取葉片，經(jīng)液氮處理后置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。將未處理的小麥幼苗轉(zhuǎn)移至花盆中，采集旗葉、葉鞘、莖、根、穎花以及灌漿中期的種子，經(jīng)液氮冷卻后置于-80 ℃保存，用于總RNA的提取。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 利用NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)和EnsemblPlant(https：//plants.ensembl.org/)檢索TaSPP基因的同源序列。由于不同拷貝的CDS序列一致性為98.53%，因此使用Primer 5.0軟件設(shè)計通用引物擴(kuò)增TaSPP基因的cDNA序列，引物送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具體序列見表1。

表1 擴(kuò)增cDNA、熒光定量的引物Tab.1 Primers for cDNA amplification and fluorescence quantification

1.2.2TaSPP基因cDNA克隆及載體構(gòu)建 利用EnsemblPlants數(shù)據(jù)庫獲得小麥TaSPP的基因序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫設(shè)計引物TaSPP-cDNA-F/R，使用E.Z.N.A.?Plant RNA kit試劑盒(OMEGA，美國)提取晉麥47葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(TOYOB，日本)合成單鏈cDNA，并以此為模板，引物TaSPP-F/R和高保真Easypfu酶(全金式，北京)擴(kuò)增目標(biāo)基因TaSPP的cDNA。PCR反應(yīng)體系：10×EasypfuBuffer 5 μL，dNTP 5 μL，上下游引物(10 μmol/L)2 μL，EasypfuDNA polymerase 1 μL，補(bǔ)充ddH2O至50 μL總體積。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸2.5 min，共35個循環(huán)。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，Tiangel Purfication Kit試劑盒(天根，北京)切膠回收目標(biāo)產(chǎn)物，并與pEASY-Blunt Clonging Vector(全金式，北京)載體連接，42 ℃水浴熱激將重組體轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，通過藍(lán)白斑篩選，將陽性克隆送往蘭州天啟基因生物有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3TaSPP基因的表達(dá)與差異分析 提取晉麥47不同組織和逆境脅迫處理葉片的總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用KOD SYBR qPCR Mix熒光定量試劑盒進(jìn)行基因表達(dá)試驗(yàn)，每個樣品設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。反應(yīng)體系為：KOD SYBR qPCR Mix 10 μL、上下游引物(10 μmol/L)1 μL、ROX Reference Dye(50×)0.4 μL、cDNA(50 μg/μL)2 μL、ddH2O 6.6 μL，共20 μL體系。PCR反應(yīng)在QuantStudioTMDesign & Analysis Software 實(shí)時熒光定量PCR儀中進(jìn)行，擴(kuò)增程序：98 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，68 ℃ 30 s，共計40個循環(huán)。以種子作為對照，管家基因ACTIN作為內(nèi)參基因，基因表達(dá)量采用2-ΔΔCt法。

1.2.4 小麥TaSPP基因的生物信息學(xué)分析 在線軟件PlantCARE數(shù)據(jù)庫(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預(yù)測TaSPP基因啟動子中順式作用元件。在線預(yù)測軟件NPS-SOPMA(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html)預(yù)測TaSPP的二級結(jié)構(gòu)，統(tǒng)計TaSPP二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲、延伸鏈等結(jié)構(gòu)所占的百分比。用ExPASy-SWISS MODE(https：//swissmodel.expasy.org/)預(yù)測TaSPP蛋白的三級結(jié)構(gòu)。在EnsemblPlants數(shù)據(jù)庫獲得TaSPP的蛋白質(zhì)序列并與其他物種多序列比對和一致性分析使用ClustalW進(jìn)行，將比對結(jié)果輸入MEGA 6軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining)，Bootstrap number 設(shè)置為1 000次重復(fù)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用GSDS(http：//gsds.gao-lab.org/)對TaSPP基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。利用在線分析軟件STRING(https：//string-db.org/)預(yù)測TaSPP-5A的蛋白互作。在線軟件pfam(http：//pfam.xfam.org/)預(yù)測TaSPS和TaSPP的功能結(jié)構(gòu)域。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaSPP的cDNA克隆及序列分析

以晉麥47的cDNA為模板，使用特異引物擴(kuò)增TaSPP基因，電泳檢測出目的片段長度約為1 200 bp(圖1)，與預(yù)期結(jié)果一致。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCR產(chǎn)物包含3條cDNA序列，位于5號染色體上，分別命名為TaSPP-5A、TaSPP-5B和TaSPP-5D，且3個TaSPP基因的cDNA全長分別為1 269，1 242，1 269 bp，編碼的蛋白分別含有422，413，422個氨基酸，序列一致性高達(dá)98.42%(圖2)?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明，TaSPP家族成員都包含8個外顯子和7個內(nèi)含子(圖3)。

圖1 TaSPP基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 The PCR amplification of TaSPP gene

圖2 TaSPP蛋白序列比對Fig.2 Sequence alignment of TaSPP proteins

圖3 小麥TaSPP的基因結(jié)構(gòu)Fig.3 Gene structure of wheat TaSPP

2.2 TaSPP基因的啟動子預(yù)測

利用在線數(shù)據(jù)庫PlantCARE分析TaSPP基因啟動子區(qū)的序列，結(jié)果顯示，TaSPP基因存在大量的光應(yīng)答元件(G-Box、Sp1)、激素應(yīng)答元件和脅迫應(yīng)答元件(ARE、CGTCA-motif、LTR、MBS、TGA-element、TGACG motif)。其中，激素應(yīng)答元件包括脫落酸和生長素應(yīng)答元件等；脅迫應(yīng)答元件包括低溫應(yīng)答元件和參與干旱誘導(dǎo)MYB結(jié)合位點(diǎn)元件(圖4、表2)。

圖4 TaSPP啟動子順式作用元件Fig.4 The cis-acting element of the TaSPP promoter

表2 TaSPP基因的順式作用元件及功能注釋Tab.2 Cis-acting elements and functional annotations of TaSPP gene

2.3 TaSPP蛋白的二級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用SOPMA對小麥TaSPP蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TaSPP蛋白結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲和延伸鏈4種成分組成(表3)，其中α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主要成分，β-折疊和延伸鏈相對較少。由于TaSPP基因的氨基酸序列高度相似，故利用在線軟件SWISS-MODEL對TaSPP-5A蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，預(yù)測結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)相一致，主要的結(jié)構(gòu)元件是α-螺旋和無規(guī)則卷曲(圖5)。

圖5 TaSPP蛋白的三級結(jié)構(gòu)Fig.5 Prediction of the tertiary structure of TaSPP

表3 TaSPP蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Tab.3 Predicted secondary structure of TaSPP protein %

2.4 TaSPP蛋白的進(jìn)化關(guān)系分析

為了進(jìn)一步了解TaSPP家族成員的進(jìn)化關(guān)系，將小麥3個TaSPP基因的蛋白序列與其他物種SPP蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。序列分析結(jié)果顯示，小麥TaSPP-5A、TaSPP-5B和 TaSPP-5D在同一分支上，并且與小麥近緣物種的同源性較高。TaSPP-5A和烏拉爾圖小麥SPP、TaSPP-5D和粗山羊草SPP、TaSPP-5B與擬斯卑爾托山羊草SPP蛋白序列相似度較高，進(jìn)一步說明小麥TaSPP在進(jìn)化過程中高度保守(圖6-A)。

2.5 TaSPP蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與功能結(jié)構(gòu)域分析

在線軟件STRING進(jìn)行蛋白互作預(yù)測發(fā)現(xiàn)，共有11個蛋白與TaSPP-5A互作，Traes_3DL_A2EB73B1D.2、Traes_4AL_2BC235062.1和Traes_7AS_A80BE362A.1是蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶，Traes_3AS_6505083E0.1、Traes_3B_55B913FD2.1、Traes_6DS_DAA89D248.1、Traes_3B_35D6F6CE7.1、Traes_6BS_9E57D74AC.1、Traes_3DS_9B89BAD5A.1和Traes_3AS_6505083E0.1推測是與蔗糖合成酶相關(guān)的蛋白，Traes_6DS_573CAD5E0.1沒有注釋基因號，因此無法對該基因進(jìn)行分類(圖6-B)。蛋白功能預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小麥含有S6PP和S6PP_C 2個結(jié)構(gòu)域，且蔗糖磷酸合成酶SPS的C肽端與SPP的N肽端具有類似的功能區(qū)域(圖7)。結(jié)果暗示小表明TaSPP蛋白具有行使催化功能的完整核心元件。TaSPS與TaSPP可能以復(fù)合體形式存在。

Zm.玉米；Os.水稻；At.擬南芥；Md.蘋果；Sc.番茄；Tu.烏拉爾圖小麥；As.擬斯卑爾托山羊草；Aet.粗山羊草；Nt.煙草；Gm.大豆；Pt.楊樹；St.馬鈴薯；Rc.蓖麻；Sc.黑麥。Zm.Zea mays；Os.Oryza sativa；At.Arabidopsis thaliana；Md.Malus domestica；Sc.Solanum lycopersicum；Tu.Triticum urartu；As.Aegilops speltoides；Aet.Aegilops tauschii；Nt.Nicotiana tabacum；Gm.Glycine max；Pt.Populus trichocarpa；St.Solanum tuberosum；Rc.Ricinus communis；Sc.Secale cereale.

圖7 TaSPS與TaSPP氨基酸序列功能域分析Fig.7 The conserved function domain of amino acid sequence of sucrose-phosphate synthase and sucrose-phosphate phosphatase in the wheat

2.6 TaSPP基因特異表達(dá)分析

為了挖掘小麥TaSPP基因的潛在功能，本研究基于實(shí)時熒光定量PCR，分析TaSPP在小麥旗葉、莖稈、葉鞘、穎花、種子和根中的相對表達(dá)量。結(jié)果表明，TaSPP在小麥各組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量存在差異，莖稈和旗葉中的表達(dá)顯著高于其他組織，其表達(dá)量分別是根的9.00，8.63倍(圖8)。

內(nèi)參基因.β-actin；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖9同。Reference gene.β-actin；Different lowercase letters indicate significant differences(P<0.05).The same as Fig.9.

利用qRT-PCR方法分析干旱、鹽、ABA和IAA處理下基因的表達(dá)情況，可以較全面地反映TaSPP基因在非生物脅迫中的應(yīng)答機(jī)制。結(jié)果表明，在PEG-6000、NaCl、ABA和IAA脅迫下TaSPP基因的表達(dá)均發(fā)生了變化，但由于脅迫條件的不同，基因表達(dá)變化存在差異(圖9)。其中，在NaCl脅迫條件下，TaSPP基因上調(diào)表達(dá)，處理6 h基因表達(dá)量最高；IAA處理下表達(dá)量呈先升后降的趨勢；在ABA處理6 h 后TaSPP基因表達(dá)量發(fā)生顯著上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)為1.7倍；PEG-6000誘導(dǎo)下基因呈先降后升的趨勢。

3 結(jié)論與討論

SPP作為蔗糖合成的關(guān)鍵酶基因，在蔗糖合成途徑發(fā)揮重要的作用。近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，從分子角度研究磷酸蔗糖磷酸酶代謝的調(diào)控機(jī)制已成為研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻、玉米、小麥、大麥(HordeumvulgareL.)、高粱(Sorghumbicolor(L.)Moench)、辣椒(CapsicumannuumL.)和番茄等多個物種中均鑒定到SPP基因[13-17]，并且包含高度保守的S6PP 和 S6PP_C結(jié)構(gòu)域[17-18]。在本研究中，小麥含有S6PP和S6PP_C共2個結(jié)構(gòu)域，表明TaSPP蛋白具有行使催化功能的完整核心元件。同時，TaSPS的C端與TaSPP的N端具有相同的催化結(jié)構(gòu)域S6PP，該結(jié)構(gòu)域在維持SPP酶的催化機(jī)理和空間結(jié)構(gòu)具有重要的作用。同時，Maloney等[19]研究也發(fā)現(xiàn)，SPS與SPP以復(fù)合物的形式存在，共同調(diào)控植物生長和生物量的合成。

圖9 TaSPP基因在ABA、PEG-6000、NaCl、IAA脅迫下的表達(dá)分析Fig.9 Expression analysis of TaSPP gene under ABA，PEG-6000，NaCl and IAA treatments

在植物中，蔗糖作為高等植物光合作用的主要產(chǎn)物，主要在葉片中合成，并通過莖稈積累和轉(zhuǎn)運(yùn)，是碳水化合運(yùn)輸?shù)闹饕问絒20-21]。轉(zhuǎn)化酶(INV)、蔗糖合成在植物中，蔗糖作為高等植物光合作用的主要產(chǎn)物，主要在葉片中合成，并通過莖稈積累和轉(zhuǎn)運(yùn)，是碳水化合運(yùn)輸?shù)闹饕问絒20-21]。轉(zhuǎn)化酶(INV)、蔗糖合成酶(Sus)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)和SPP作為蔗糖代謝途徑的關(guān)鍵酶，對蔗糖的合成與分解具有重要的作用[5，21-23]。黃堂偉等[21]研究表明，木薯中SPS基因在葉片中的表達(dá)量高于莖段和塊根。在水稻中，SPS基因主要在庫源器官中表達(dá)[23]。在本研究中，小麥TaSPP基因在各組織中均有一定的表達(dá)，在旗葉和莖稈中表達(dá)量最高，在根中表達(dá)量最低，說明TaSPP基因在蔗糖合成以及轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮重要作用。

轉(zhuǎn)錄調(diào)控在基因表達(dá)的激活和抑制中起關(guān)鍵作用，基因啟動子及其貢獻(xiàn)的順式調(diào)控元件與植物適應(yīng)環(huán)境脅迫密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，TaSPP基因存在大量的光應(yīng)答元件、激素應(yīng)答元件和脅迫應(yīng)答元件。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，HbSPP1基因在不同葉脈中及非生物脅迫下的表達(dá)量存在差異，推斷該基因可能在蔗糖韌皮部裝卸及抵御外界脅迫中具有重要的作用[24]。辣椒LZSPP1和LZSPP2基因在ABA處理后基因表達(dá)顯著升高[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，ABA脅迫誘導(dǎo)下小麥TaSPP基因上調(diào)表達(dá)，推測TaSPP基因可能通過ABA的信號途徑響應(yīng)非生物脅迫。結(jié)果暗示TaSPP基因可能通過影響蔗糖的合成、積累和激素調(diào)節(jié)，進(jìn)而在小麥應(yīng)對逆境脅迫過程中發(fā)揮重要作用。