小麥衰老相關(guān)基因TaSAG39的生物信息學(xué)及表達(dá)模式分析

孫麗麗，晉秀娟，趙 鍇，Md Ashraful Islam，盧 娟，王曙光，孫黛珍

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.省部共建有機(jī)旱作農(nóng)業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(籌)，山西 太原 030031)

小麥?zhǔn)鞘澜缟系谝淮蠹Z食作物，目前全球小麥年產(chǎn)量約7億t[1-2]，占世界糧食總產(chǎn)量的1/3，隨著人口總量的持續(xù)增加，全世界發(fā)展中國(guó)家對(duì)小麥產(chǎn)量的需求還將持續(xù)增加。葉片衰老是植物生長(zhǎng)發(fā)育的最后一個(gè)階段，過(guò)早啟動(dòng)衰老進(jìn)程會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生不良影響[3]。對(duì)于小麥而言，葉片衰老與籽粒灌漿同步進(jìn)行，適當(dāng)?shù)匮泳徦ダ夏軌蛱岣咝←湲a(chǎn)量、改善品質(zhì)[4-7]；然而葉片衰老受基因的精細(xì)調(diào)控[8-9]。因此，挖掘衰老相關(guān)基因，解析衰老分子機(jī)制，對(duì)于提高作物的產(chǎn)量和改善品質(zhì)具有重要的意義。

半胱氨酸蛋白酶(Senesence-specific cysteine protease,SAG39)又叫硫醇蛋白酶，是目前衰老相關(guān)基因(SAG)研究的熱點(diǎn)之一，不同植物在自然衰老或誘導(dǎo)衰老過(guò)程中的基因表達(dá)分析表明，半胱氨酸蛋白酶始終是最豐富的一類蛋白酶[10]。19世紀(jì)40年代以來(lái)，已有多種半胱氨酸蛋白酶從不同植物中被分離鑒定[11]。Beyene等[12]利用快速擴(kuò)增cDNA末端(RACE)的方法，從衰老和非衰老煙葉中分離到2個(gè)cDNA，命名為NtCP1和NtCP2，通過(guò)Northern雜交檢測(cè)成熟綠色葉片和衰老葉片NtCP1和NtCP2的表達(dá)，結(jié)果表明，NtCP1主要在老化的葉片中表達(dá)，被認(rèn)為是衰老特異基因，而NtCP2的表達(dá)只在成熟的綠葉中被檢測(cè)到，被認(rèn)為有可能與細(xì)胞程序性死亡相關(guān)。Liu等[13]分離了水稻中衰老相關(guān)基因OsSAG39的啟動(dòng)子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著葉齡的增加葉片逐漸進(jìn)入衰老階段，OsSAG39的表達(dá)量也逐步增加，衰老晚期時(shí)達(dá)到最大值，通過(guò)對(duì)OsSAG39的啟動(dòng)子進(jìn)行GUS表達(dá)分析也確定了該基因的衰老特異性。朱海生等[14]從草莓中克隆到半胱氨酸蛋白酶基因FaCP，分析發(fā)現(xiàn)，在果實(shí)成熟及葉片衰老過(guò)程中FaCP基因表達(dá)量顯著上升，表明FaCP可能參與調(diào)控草莓果實(shí)的成熟及葉片衰老。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中的SAG12[15]、玉米中的See1[16]、油菜中的BnSAG12-2[17]、煙草中的NtCP-23[18]等衰老相關(guān)基因均編碼半胱氨酸蛋白酶。目前，關(guān)于半胱氨酸蛋白酶在小麥中的研究主要集中于干旱[19-20]和抗病[21]方面，而在小麥衰老過(guò)程中發(fā)揮的作用尚不清楚。

基于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥育種課題組前期對(duì)2個(gè)不同持綠類型小麥品種晉麥39(非持綠型)和太綠113(持綠型)花后不同時(shí)期旗葉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)一個(gè)被注釋為衰老特異的半胱氨酸蛋白酶的轉(zhuǎn)錄本在衰老前期該基因表達(dá)量很低，但在衰老過(guò)程中其表達(dá)量極顯著升高，且在非持綠型品種中的表達(dá)量顯著高于持綠型品種[22]，初步推測(cè)TaSAG39與小麥葉片衰老有關(guān)。

為了進(jìn)一步探索TaSAG39的功能，本研究對(duì)該基因進(jìn)行系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析，并對(duì)不同脅迫下和葉片衰老過(guò)程中該基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析，以期為后期基因功能研究和分子育種提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試小麥品種晉麥39，主要用于不同脅迫處理下TaSAG39的表達(dá)模式分析；供試小麥品種煙農(nóng)19，主要用于自然衰老過(guò)程中TaSAG39的表達(dá)模式分析。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料處理 挑選籽粒大小一致且飽滿的晉麥39種子，用1%的NaClO溶液浸泡15 min后，用無(wú)菌水沖洗4～5次，沖洗干凈后室溫下用自來(lái)水浸泡24 h后，移入網(wǎng)盒(下有托盤)中，采用1%的花無(wú)缺培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液。置于人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：溫度22 ℃，相對(duì)濕度70%，光照強(qiáng)度9 000 lx，16 h光照/8 h黑暗。培養(yǎng)至一葉一心期(7 d左右)，對(duì)幼苗分別進(jìn)行不同脅迫處理(黑暗、34 ℃高溫、16.1% PEG、50 μmol/L MeJA、50 μmol/L IAA和250 mol/L NaCl)，并分別于誘導(dǎo)后0，1，2，3，6，12，24，48，72 h取新鮮葉片組織，經(jīng)液氮速凍后保存于-80 ℃，用于提取RNA。

用于自然衰老表達(dá)模式分析的煙農(nóng)19于2019年度種植在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站小麥試驗(yàn)基地(北緯37°25′，東經(jīng)112°25′)，分別在花后0，7，10，13，16，19，22，24，30 d取完整旗葉，經(jīng)液氮速凍后保存于-80 ℃，用于提取RNA。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA的合成 利用TRIzol法提取小麥葉片總RNA，然后根據(jù)全式金生物公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，保存于-80 ℃，用于后續(xù)熒光定量試驗(yàn)。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中注釋為SAG39的轉(zhuǎn)錄本序列在小麥基因組URGI數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//urgi.versailles.inra.fr/blast/)中BLAST獲得TaSAG39-5A、TaSAG39-5B、TaSAG39-5D等3個(gè)同源基因的cDNA和啟動(dòng)子候選序列。利用NCBI-ORF finder(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)工具獲取基因的開放閱讀框，并將其翻譯成氨基酸序列；將得到的氨基酸序列通過(guò)NCBI網(wǎng)站中的BLAST(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)功能，獲得其他物種中SAG39的氨基酸序列，用MEGA-X軟件對(duì)不同物種間SAG39構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)；利用在線工具Expasy-ProtParam(https：//web.expasy.org/ protparam/)進(jìn)行蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)分析；利用SOPMA(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page= npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/)分別對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用SignalP 5.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/index.php)和NetPhos 3.1 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測(cè)分析蛋白質(zhì)的信號(hào)肽以及蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)；用MEME(https：//meme-suite.org/meme/tools/meme)分析蛋白質(zhì)的保守基序；通過(guò)NCBI網(wǎng)站的Conserved Domain Database數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/ wrpsb.cgi)及Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//pfam.xfam.org/)分析蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域；用在線工具STRING(https：//string-db.org/)進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建；利用在線工具PlantCARE(http：//bioinfor matics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析TaSAG39基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物，其中，TaSAG39上游引物5′-AGGGTCTTGCGGCTGCTG-3′，下游引物5′-TCGAAGGCGTTGTCCATGAG-3′。內(nèi)參基因選擇小麥Actin基因，上游引物5′-CTCCCTCACAACAACAACCGC-3′，下游引物5′-TACCAGGAACTTCCATACCAAC-3′。使用TaKaRa公司的熒光定量試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR，每個(gè)樣品重復(fù)3次，按照公式2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥TaSAG39蛋白的同源性分析

根據(jù)TaSAG39基因編碼的蛋白序列，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST搜索功能，篩選得到其他物種中SAG39的氨基酸序列。運(yùn)用MEGA-X軟件的最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果表明(圖1)，小麥TaSAG39-5A、TaSAG39-5B、TaSAG39-5D與其他單子葉植物節(jié)節(jié)麥、野生二粒小麥、硬粒小麥、大麥、二穗短柄草、菰、水稻中的SAG39聚為一類，畫眉草、南荻、高粱、玉米、馬唐、谷子、柳枝稷、稷中的SAG39聚為一類。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，TaSAG39-5A、TaSAG39-5B、TaSAG39-5D基因所編碼的氨基酸在進(jìn)化上與節(jié)節(jié)麥、野生二粒小麥、硬粒小麥聚為一類，說(shuō)明其親緣關(guān)系最近，表明該蛋白氨基酸序列在小麥的進(jìn)化過(guò)程中具有較高的保守性。除此之外，其與大麥中的SAG39親緣關(guān)系最近。進(jìn)一步對(duì)TaSAG39蛋白進(jìn)行多重比對(duì)同樣發(fā)現(xiàn)(圖2)，不同物種中的SAG39氨基酸序列具有典型EFNIN結(jié)構(gòu)和催化三聯(lián)體(Cys-His-Asn)，這些結(jié)構(gòu)是木瓜蛋白酶家族基因的典型特征[23]。同時(shí)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，不同物種SAG39氨基酸序列中均含有相同的2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域組織蛋白酶前體抑制結(jié)構(gòu)域I29(Inhibitor_I29)和木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶Pept_C1結(jié)構(gòu)域(Peptidase_C1)。

圖1 TaSAG39蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of TaSAG39 protein

*.二硫鍵位點(diǎn)；黃色方框.EFNTIN結(jié)構(gòu)；藍(lán)色方框.半胱氨酸蛋白酶活性(Cys-His-Asn)；紅色線條.保守結(jié)構(gòu)域Inhibitor_I29和Peptidase_C1。*.The disulfide bond site；The yellow box.The structure of EFNIN；The blue box.The cysteine protease activity(Cys-His-Asn)；The red line.The conserved domain Inhibitor_I29 and Peptidase_C1.

2.2 小麥TaSAG39蛋白理化性質(zhì)

預(yù)測(cè)TaSAG39蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，TaSAG39蛋白編碼345～349個(gè)氨基酸，在3個(gè)同源蛋白中含量最高的氨基酸均為丙氨酸，TaSAG39-5A為15.3%、TaSAG39-5B為15.5%、TaSAG39-5D為15.4%，在TaSAG39-5A、TaSAG39-5D中含量最低的為谷氨酰胺，TaSAG39-5B中含量最低的為組氨酸，均為1.4%(圖3)。3個(gè)同源蛋白的分子質(zhì)量約為37 ku，理論等電點(diǎn)為5.53～5.67，為酸性蛋白；帶正電殘基(Arg+Lys)為35～36，帶負(fù)電殘基(Asp+Glu)為40～42，表明該蛋白在中性條件下帶負(fù)電；蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)為34.59～38.07，屬于穩(wěn)定蛋白；脂肪指數(shù)約為71，親水性約為-0.174，表明該蛋白為親水性蛋白(表1)。可以看出，這3個(gè)同源蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)差異不大。

圖3 TaSAG39氨基酸組成Fig.3 Amino acid composition of TaSAG39

表1 TaSAG39蛋白質(zhì)理化性質(zhì)Tab.1 Physicochemical properties of TaSAG39 protein

2.3 小麥TaSAG39蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

預(yù)測(cè)小麥TaSAG39s蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如圖4所示，TaSAG39s蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)均含有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈，且占比最大的均為無(wú)規(guī)則卷曲，為40.97%～42.61%；其次為α-螺旋，介于35.26%～38.68%；延伸鏈所占比例介于13.91%～16.47%；占比最少的為β-轉(zhuǎn)角，為6.02%～6.96%。由此可見，小麥TaSAG39蛋白的主要構(gòu)成元件為無(wú)規(guī)則卷曲，構(gòu)成酶活性部位或蛋白質(zhì)特異的功能部位，而α-螺旋為次要構(gòu)成元件來(lái)連接其他二級(jí)結(jié)構(gòu)。

圖4 TaSAG39蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of secondary structure of TaSAG39 protein

對(duì)TaSAG39s蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示(圖5)，3個(gè)同源蛋白的同源建模的參考模板均為SMTL中的6u7d.1.A，GMQE約為0.72，QMEAN4約為0.75，表明該結(jié)果可用。結(jié)果顯示，該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋構(gòu)成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。且發(fā)現(xiàn)TaSAG39-5A與TaSAG39-5D的三級(jí)結(jié)構(gòu)基本一致，而TaSAG39-5B的三級(jí)結(jié)構(gòu)略有不同，但是基本一致。

圖5 TaSAG39蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of tertiary structure of TaSAG39 protein

2.4 小麥TaSAG39蛋白的信號(hào)肽以及磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

TaSAG39的3個(gè)同源蛋白質(zhì)的信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果一致，分析結(jié)果顯示(圖6)，其蛋白質(zhì)N端含有一段18個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽序列，序列為MSRSTLIILALLAVSSAVA，推測(cè)TaSAG39基因編碼的蛋白可能為分泌蛋白。

圖6 TaSAG39蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction of signal peptide of TaSAG39 protein

磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果顯示(圖7)，TaSAG39s蛋白有35～37個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中，絲氨酸磷酸化位點(diǎn)最多，約18個(gè)，蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)占比第2(約13個(gè))，酪氨酸磷酸化位點(diǎn)最少，約6個(gè)；且其中有4個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)的值均高于0.980，約達(dá)標(biāo)準(zhǔn)值的2倍。因此，推測(cè)該基因通過(guò)絲氨酸磷酸化修飾調(diào)控為主、蘇氨酸磷酸化修飾調(diào)控為輔來(lái)實(shí)現(xiàn)其功能。

圖7 TaSAG39蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.7 Prediction of phosphorylation site of TaSAG39 protein

2.5 小麥TaSAG39蛋白的保守基序及其保守結(jié)構(gòu)域分析

為了更好地了解TaSAG39基因的功能，對(duì)小麥TaSAG39蛋白的保守基序、結(jié)構(gòu)域以及基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖8)，在小麥TaSAG39蛋白中含有10種保守基序，且除TaSAG39-5B中缺失一個(gè)Motif 10外，在3個(gè)同源蛋白中這些保守基序基本一致，在Pfam上預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)在Motif 1、Motif 3、Motif 4中均存在Peptidase_C1結(jié)構(gòu)域，Motif 2中存在Inhibitor_I29結(jié)構(gòu)域。同時(shí)將3個(gè)基因組的蛋白序列在NCBI中的Conserved Domain Database進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，結(jié)果表明(圖9)，TaSAG39的3個(gè)基因組均包含2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域組織蛋白酶前體抑制結(jié)構(gòu)域I29(Inhibitor_I29)和木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶Pept_C1結(jié)構(gòu)域(Peptidase_C1)，預(yù)測(cè)結(jié)果與保守基序預(yù)測(cè)結(jié)果相對(duì)應(yīng)。分析TaSAG39的基因結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)(圖10)，該基因位于第5號(hào)染色體上，3個(gè)基因組均包含2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，其中TaSAG39-5A全長(zhǎng)1 455 bp，編碼區(qū)1 041 bp；TaSAG39-5B全長(zhǎng)1 435 bp，編碼區(qū)1 050 bp；TaSAG39-5D全長(zhǎng)1 439 bp，編碼區(qū)1 038 bp。

圖8 TaSAG39蛋白的保守基序分析Fig.8 Conserved motif analysis of TaSAG39 protein

圖9 TaSAG39蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig.9 Conserved domains of TaSAG39 protein

圖10 TaSAG39的基因結(jié)構(gòu)分析Fig.10 Analysis of TaSAG39 gene′s structure

2.6 小麥TaSAG39蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)分析

通過(guò)在線工具STRING構(gòu)建TaSAG39蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TaSAG39蛋白與2個(gè)半胱氨酸蛋白酶抑制劑(TraesCS3D02G325100、TraesCS5A02G487700)、2個(gè)半胱氨酸蛋白酶RD19D(TraesCS2A02G187400、TraesCS2B02G219900)、4個(gè)糖苷水解酶(TraesCS3B02G045700、TraesCS4B02G021800、TraesCS4D02G019500、TraesCS2A02G122200)、1個(gè)14-3-3蛋白(TraesCS4B02G148900)和1個(gè)未注釋的蛋白(TraesCS2B02G234400)互作，其中TaSAG39與半胱氨酸蛋白酶抑制劑和半胱氨酸蛋白酶RD19D有多種證據(jù)表明存在相互作用關(guān)系(圖11)。

圖11 TaSAG39蛋白互作分析Fig.11 The analysis of TaSAG39 protein interaction networks

2.7 小麥TaSAG39基因的順式作用元件分析

利用PlantCARE對(duì)TaSAG39的3個(gè)基因組起始密碼子上游2 000 bp的序列進(jìn)行順式作用元件分析，結(jié)果表明(圖12)，TaSAG39的3個(gè)基因組啟動(dòng)子均存在著大量的順式作用元件，如響應(yīng)脫落酸的順式作用元件ABRE，光脅迫響應(yīng)元件G-box、GT1-motif、Sp1，茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA-motif、TGACG-motif，干旱響應(yīng)元件MYC、DRE core，生長(zhǎng)素響應(yīng)元件TGA-element，高溫響應(yīng)元件STRE，低溫響應(yīng)元件LTR、厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件ARE，其中光響應(yīng)元件和干旱響應(yīng)元件最多，茉莉酸甲酯、脫落酸以及溫度響應(yīng)元件相對(duì)較多；此外發(fā)現(xiàn)，TaSAG39-5A、TaSAG39-5D基因組啟動(dòng)子區(qū)還含有與分生組織表達(dá)相關(guān)的順式作用元件CAT-box，表明TaSAG39可能參與小麥生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)及非生物脅迫響應(yīng)。

圖12 TaSAG39啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件Fig.12 Cis-acting elements in the promoter region of TaSAG39

2.8 小麥TaSAG39的表達(dá)特性分析

為了進(jìn)一步明確小麥TaSAG39基因的潛在功能，根據(jù)該基因啟動(dòng)子上的順式作用元件，通過(guò)qRT-PCR分析其在自然衰老及非生物脅迫下的表達(dá)情況，從圖13可以看出，在自然衰老及6種非生物脅迫下，TaSAG39的表達(dá)量均發(fā)生了明顯變化。在自然衰老過(guò)程中，花后前期TaSAG39的表達(dá)量沒有明顯的變化，在花后30 d其表達(dá)量急劇增高，達(dá)到花后0 d的360倍；在黑暗處理中，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，TaSAG39的表達(dá)呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢(shì)，且在處理6 h基因的表達(dá)量達(dá)到最高，為處理前的4.5倍；在PEG模擬的干旱處理下，脅迫2 hTaSAG39的表達(dá)量達(dá)到對(duì)照的14倍，在隨后的脅迫時(shí)間內(nèi)表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；在生長(zhǎng)素(IAA)處理下，除脅迫2 hTaSAG39的表達(dá)量低于對(duì)照外，其余時(shí)間段均高于對(duì)照且呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，12 h達(dá)到最大值；在茉莉酸甲酯(MeJA)和高溫脅迫下，TaSAG39的表達(dá)量均呈上升—下降—上升—下降—上升的趨勢(shì)，分別在24，12 h表達(dá)量達(dá)到最大值，分別為對(duì)照的3.9,2.1倍；在NaCl處理下，除72 h外，TaSAG39整體表現(xiàn)出表達(dá)量下降趨勢(shì)，且在處理2 h降低至臨界值，為處理前的0.003倍左右。

不同小寫字母表示不同樣本之間TaSAG39表達(dá)量的顯著性差異(P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant difference in the expression of TaSAG39 gene in different samples at 0.05 level.

3 結(jié)論與討論

半胱氨酸蛋白酶是一類重要的蛋白水解酶，廣泛參與植物的各種生理過(guò)程，如種子萌發(fā)、低溫、干旱、鹽等環(huán)境脅迫以及衰老等[24-25]。因此，研究半胱氨酸蛋白酶對(duì)于研究植物抗逆和植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程具有重要作用。

本研究對(duì)小麥中半胱氨酸蛋白酶基因TaSAG39進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TaSAG39蛋白為穩(wěn)定的帶負(fù)電的親水性蛋白，且該蛋白主要由無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋構(gòu)成，與前人報(bào)道相一致[26]。此外，氨基酸序列中含有木瓜蛋白酶亞家族共有的活性位點(diǎn)Cys-His-Asn以及EFNIN結(jié)構(gòu)域，其中氨基酸序列N端有18個(gè)氨基酸殘基編碼的信號(hào)肽以及一個(gè)肽酶抑制劑結(jié)構(gòu)域，C端有木瓜蛋白酶亞家族的保守結(jié)構(gòu)域，與前人報(bào)道木瓜蛋白酶的氨基酸序列從N端到C端劃分為信號(hào)肽序列、前體肽序列和成熟酶序列3個(gè)區(qū)域一致[27]。

啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件，而順式作用元件作為啟動(dòng)子中與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的一段特異序列，其在啟動(dòng)子中的類型、數(shù)目以及它們之間的順序和距離都會(huì)影響到基因的表達(dá)效率及強(qiáng)弱[28]，因此，分析基因啟動(dòng)子所含順式作用元件可為研究基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)模式和功能提供一定的參考。本研究對(duì)TaSAG39啟動(dòng)子上的順式作用元件進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該基因的啟動(dòng)子上包含大量的非生物脅迫和激素響應(yīng)的順式作用元件，如干旱、光、熱、茉莉酸甲酯、生長(zhǎng)素以及脫落酸等。前人研究表明，在植物中半胱氨酸蛋白酶基因啟動(dòng)子區(qū)中常常含有許多脅迫響應(yīng)元件，如脫水響應(yīng)元件、脫落酸響應(yīng)元件等[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，TaSAG39在自然衰老、黑暗、干旱、高溫、鹽脅迫和茉莉酸甲酯以及生長(zhǎng)素處理下可以被不同程度地誘導(dǎo)表達(dá)，其中在自然衰老、黑暗、干旱、高溫脅迫以及茉莉酸甲酯、生長(zhǎng)素激素處理下上調(diào)表達(dá)，與小麥中其他編碼半胱氨酸蛋白酶的基因TaCP1[19]、TaCP3[20]表達(dá)模式相似；在鹽脅迫下表達(dá)受到抑制，與柑橘中CsCysP研究結(jié)果相反[29]。推測(cè)其原因可能是因?yàn)椴煌騿?dòng)子中所含有順式作用元件的種類和個(gè)數(shù)不同，因此其響應(yīng)脅迫時(shí)基因的表達(dá)模式也不同。

本研究通過(guò)蛋白互作分析發(fā)現(xiàn)，TaSAG39可能與半胱氨酸蛋白酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶RD19D、糖苷水解酶以及14-3-3蛋白之間發(fā)生互作。半胱氨酸蛋白酶抑制劑可通過(guò)與半胱氨酸蛋白酶的活性位點(diǎn)直接相互作用來(lái)抑制半胱氨酸蛋白酶的活性，進(jìn)一步阻止蛋白質(zhì)的水解，參與環(huán)境脅迫應(yīng)答、細(xì)胞程序性死亡以及新陳代謝的調(diào)節(jié)[30]，推測(cè)TaSAG39可能與半胱氨酸蛋白酶抑制劑相互作用來(lái)共同調(diào)節(jié)小麥葉片衰老及脅迫響應(yīng)。Kunert等[31]研究也表明，在菠菜的衰老葉片中半胱氨酸蛋白酶抑制劑可與半胱氨酸蛋白酶相互作用來(lái)參與菠菜衰老過(guò)程。14-3-3蛋白是一個(gè)特殊的磷酸化結(jié)合蛋白，能夠與含有絲氨酸和蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)的蛋白質(zhì)相互作用，在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及碳代謝中發(fā)揮著重要作用[32-33]。對(duì)TaSAG39s編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行磷酸化分析發(fā)現(xiàn)，其包含大量的絲氨酸和蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，推測(cè)14-3-3蛋白可能與TaSAG39蛋白結(jié)合進(jìn)而參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及碳代謝，其還有待于進(jìn)一步深入研究。