沙棘黃酮對(duì)大鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的影響及作用機(jī)制

焦艷 謝世靜 李喆

(滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，河北 滄州 061000)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是冠心病、腦血管疾病和血栓栓塞性疾病等缺血性心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，但目前AS的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚〔1〕。他汀類藥物是AS治療的基石，但存在藥物不良反應(yīng)。沙棘黃酮(TFH)是從中藥沙棘中提取出的主要有效成分，具有增強(qiáng)免疫、抗氧化、保護(hù)心血管系統(tǒng)等作用。研究發(fā)現(xiàn)，TFH可通過降低煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶蛋白表達(dá)及升高去乙?；?SIRT1)蛋白表達(dá)，提高機(jī)體防御氧化應(yīng)激能力〔2〕。由于目前關(guān)于TFH對(duì)AS大鼠斑塊影響的相關(guān)研究較少，因此本文就TFH對(duì)大鼠AS斑塊的影響及機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠，8月齡，體重200～220 g，購于第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(軍)2015-0014。主要試劑：TFH(青?？灯盏律镏破酚邢薰?，純度≥95%)；阿托伐他汀鈣片(北京嘉林藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：110808，規(guī)格：10 mg/片)；維生素D3滴劑(上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):121125，規(guī)格：30萬IU：1 ml)；CD4+、CD8+單克隆抗體(美國(guó)Biolegend公司)；Smad3抗體(英國(guó)Abcam公司)；免疫組化試劑盒(德國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)等。主要儀器：RM2125型Leica石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；1-15K型高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)；BH-2光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；XL20全自動(dòng)生化分析儀(德國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；FACS Calibur型流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton-Dickinson公司)等。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立〔3〕、分組及處理 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組5組，每組25只。模型組、陽性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組大鼠均按60萬IU/kg的總劑量腹腔注射維生素D3，注射3 d，同時(shí)給予高脂飼料喂養(yǎng)8 w，建立大鼠AS模型。造模第8周末，隨機(jī)抽取各組5只大鼠，取主動(dòng)脈組織做病理切片，出現(xiàn)主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，血管內(nèi)有斑塊形成，并伴有脂質(zhì)沉積的現(xiàn)象，說明造模成功。各組均剩余造模成功大鼠各20只，陽性對(duì)照組給予阿托伐他汀鈣10 mg/(kg·d)灌胃，實(shí)驗(yàn)組給予TFH 200 mg/(kg·d)灌胃，對(duì)照組與模型組則使用等量生理鹽水灌胃，各組均連續(xù)給藥4 w。

1.2.2全自動(dòng)生化分析儀〔4〕檢測(cè)各組血脂水平 末次干預(yù)結(jié)束后，大鼠均禁食24 h，給予戊巴比妥鈉30 mg/kg行腹腔麻醉，自心臟心室處插管，用紅色生化管采集動(dòng)脈血10 ml，3 000 r/min離心15 min，取上層血清，裝于離心管，用于血脂檢測(cè)。應(yīng)用XL20全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)以下血脂指標(biāo)水平，即血清中總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平。

1.2.3流式細(xì)胞儀法〔5〕測(cè)定各組血清T淋巴細(xì)胞亞群水平 末次干預(yù)結(jié)束后，血液采集同1.2.2，采集好的血液標(biāo)本，加入EDTA-K2抗凝，加熒光素標(biāo)記的抗CD4+、CD8+單克隆抗體80 μl，室溫孵育15 min，制備待測(cè)樣本，流式細(xì)胞儀用前向角測(cè)向角設(shè)二維點(diǎn)圖，用Gatel將淋巴細(xì)胞圈住，檢測(cè)Gatel內(nèi)細(xì)胞10 000個(gè)，使用CELL QUEST軟件獲取熒光信號(hào)并分析CD4+、CD8+T細(xì)胞百分比。

1.2.4蘇木素-伊紅(HE)染色〔6〕觀察大鼠主動(dòng)脈病理學(xué)形態(tài) 末次干預(yù)結(jié)束后，將各組大鼠放置于操作臺(tái)上，給予麻醉后將小鼠斷頭處死，75%酒精消毒，解剖取出頸部主動(dòng)脈，200 ml甲醛溶液固定后，不同濃度乙醇脫水，采用石蠟包埋制作常規(guī)石蠟病理切片，使用 HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察主動(dòng)脈病理學(xué)變化情況。

1.2.5免疫組織化學(xué)法〔7〕檢測(cè)Smad3表達(dá)情況 末次干預(yù)結(jié)束后，主動(dòng)脈組織采集同1.2.4。采用免疫組化法，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。按1∶100將Smad3抗體稀釋，4℃冰箱過夜。室溫下放置60 min，滴加二抗〔辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體〕50 μl，37℃孵育30 min；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，每張切片在光鏡下隨機(jī)選6個(gè)不同視野，采用BI-2000圖像分析系統(tǒng)計(jì)算Smad3蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)，與總細(xì)胞數(shù)之比即為陽性細(xì)胞百分比。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組血脂水平比較 與對(duì)照組相比，其余3組血清TC、TG、LDL-C水平顯著升高，而HDL-C水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，陽性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組TC、TG、LDL-C水平顯著降低，HDL-C水平顯著升高(P<0.05)；與陽性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組TC、TG、LDL-C水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組血清血脂、T淋巴細(xì)胞亞群水平比較

2.2各組血清T淋巴細(xì)胞亞群水平比較 與對(duì)照組相比，其余3組血清CD4+、CD4+/CD8+顯著降低，CD8+顯著升高；與模型組相比，陽性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組CD4+與CD4+/CD8+顯著升高，CD8+顯著降低(P<0.05)；與陽性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組CD4+、CD4+/CD8+顯著降低，CD8+顯著升高(P<0.05)。見表1。

2.3各組主動(dòng)脈病理學(xué)形態(tài) 對(duì)照組主動(dòng)脈血管壁結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)膜完整，無脂質(zhì)沉積，無斑塊形成，且表面無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組主動(dòng)脈內(nèi)膜結(jié)構(gòu)破壞，動(dòng)脈內(nèi)膜增厚、可見血管內(nèi)斑塊形成，并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及脂質(zhì)沉積；陽性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組主動(dòng)脈內(nèi)膜結(jié)構(gòu)稍有破壞，內(nèi)膜纖維帽增厚，斑塊病變程度及病變面積、范圍均較模型組減輕、減小，且斑塊穩(wěn)定性增加。見圖1。

圖1 光學(xué)顯微鏡下觀察主動(dòng)脈的病理學(xué)形態(tài)(HE，×200)

2.4各組大鼠主動(dòng)脈中Smad3表達(dá)情況 對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組主動(dòng)脈斑塊Smad3蛋白陽性細(xì)胞百分比分別為(16.12±4.63)%、(87.26±3.91)%、(39.73±4.82)%、(51.02±5.38)%。與對(duì)照組相比，其余3組Smad3蛋白陽性細(xì)胞百分比顯著升高，與模型組相比，陽性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組Smad3蛋白表達(dá)顯著降低，且陽性對(duì)照組顯著低于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。見圖2。

圖2 主動(dòng)脈斑塊中Smad3蛋白表達(dá)(免疫組化，×400)

3 討 論

脂代謝異常和血清中生長(zhǎng)因子水平異常是AS的重要危險(xiǎn)因素，同時(shí)，T淋巴細(xì)胞作為免疫因素在AS發(fā)生、發(fā)展過程中的作用越來越受到重視〔8〕。TFH有活血化瘀、調(diào)節(jié)血脂蛋白、抗腫瘤等藥理功效。研究發(fā)現(xiàn)，TFH可以顯著調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)性高脂血癥大鼠血脂水平〔9〕。TFH可顯著降低高脂飼料喂養(yǎng)大鼠的血脂水平，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂，減少肝細(xì)胞中脂肪變性〔10〕。本研究結(jié)果提示TFH可降低AS大鼠血脂水平，降低脂肪變性。研究發(fā)現(xiàn)，正常人的動(dòng)脈管壁罕見T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，而AS斑塊可見T淋巴細(xì)胞活化，CD4+T淋巴細(xì)胞增多，在不穩(wěn)定斑塊中，CD8+T淋巴細(xì)胞增多〔11〕。本研究結(jié)果提示TFH可調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群分布，提高細(xì)胞免疫功能。Smad3是參與AS炎癥信號(hào)的重要通路之一，研究表明白細(xì)胞介素(IL)-37和Smad3在AS斑塊中表達(dá)增高，并推測(cè)IL-37/Smad3可能參與AS的調(diào)節(jié)過程〔12〕。本研究結(jié)果提示TFH可降低Smad3表達(dá)，進(jìn)而改善AS。