miR-215-5p靶向FOXN1調(diào)控肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性

王紅山 楊大勇 余江濤 孫德利

(鄭州人民醫(yī)院普外科，河南 鄭州 450000)

原發(fā)性肝癌(HCC)是一種發(fā)病率較高的惡性腫瘤，其初期癥狀不明顯，導(dǎo)致早期診斷率較低，且HCC具有轉(zhuǎn)移率及復(fù)發(fā)率較高的特征，導(dǎo)致HCC每年新增死亡人數(shù)位于全身腫瘤的前列〔1〕。微小RNA(miRNA)是一類含有18～25 bp的小片段RNA，其主要通過特異性結(jié)合于相應(yīng)靶基因3′非編碼區(qū)域(UTR)區(qū)域部分或全部堿基，從而抑制靶基因mRNA翻譯或阻礙降解，參與機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育以及相關(guān)疾病的誘導(dǎo)產(chǎn)生過程，并對(duì)細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲等過程具有重要意義〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在多種腫瘤組織中異常表達(dá)，且在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中穩(wěn)定表達(dá)，不易被RNA酶降解〔3，4〕。因此，近年來將miRNA作為腫瘤生物學(xué)診斷的理想分子標(biāo)志物，對(duì)腫瘤的早期診斷、治療、靶向藥物的研發(fā)具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)miR-215-5p具有癌基因或者抑癌基因的作用。但miR-215-5p在肝癌高轉(zhuǎn)移的細(xì)胞較不轉(zhuǎn)移的Hep3B顯著上調(diào)〔5〕，表明miR-215-5p在肝組織發(fā)生、轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用，但其具體的作用機(jī)制不十分明確。因此本文通過敲低miR-215-5p觀察細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲等生物學(xué)特性，并進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，為肝癌的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 肝癌細(xì)胞系(MHCC97-H)購自北納生物，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自吉諾生物公司，Lipofectamine 2000購自美國(guó)Thermo公司；Trizol試劑購自美國(guó)Sigma公司，凋亡檢測(cè)試劑盒、噻唑藍(lán)(MTT)購自美國(guó)Bio Basic Inc公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)試劑盒購自日本TOYOBO公司，叉頭狀基因家族蛋白(FOX)N1野生型(FOXN1-wt)及FOXN1突變型(FOXN1-mut)雙熒光素酶報(bào)告基因、pcDNA-FOXN1、miR-215-5p mimics、anti-miR-215-5p及陰性對(duì)照購自上海吉瑪公司，鼠抗FOXN1抗體購自美國(guó)Sigma公司。酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀、PCR儀購自美國(guó)Thermo公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞系的培養(yǎng) MHCC97-H細(xì)胞系至于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)箱參數(shù)設(shè)置為5%CO2、37℃，加入胰酶消化、傳代。

1.2.2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MHCC97-H細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，隨機(jī)分為miR-215-5p-NC組(轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR-215-5p的陰性對(duì)照)、miR-215-5p組(轉(zhuǎn)染miR-215-5p mimics從而過表達(dá)miR-215-5p)、anti-miR-215-5p-NC組(轉(zhuǎn)染敲低miR-215-5p的陰性對(duì)照)、anti-miR-215-5p組(轉(zhuǎn)染anti-miR-215-5p從而敲低miR-215-5p)、NC組(轉(zhuǎn)染過表達(dá)FOXN1的陰性對(duì)照)、FOXN1組(轉(zhuǎn)染pcDNA-FOXN1從而過表達(dá)FOXN1)、FOXN1+miR-215-5p-NC組(共轉(zhuǎn)染miR-215-5p mimics陰性對(duì)照和pcDNA-FOXN1)、FOXN1+miR-215-5p組(共轉(zhuǎn)染pcDNA-FOXN1和miR-215-5p mimics)，對(duì)照組為正常培養(yǎng)的MHCC97-H細(xì)胞。在Lipofectamine 2000說明書指示下進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.3qPCR 各組細(xì)胞中加入Trizol試劑提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以β-actin為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算miR-215-5p的相對(duì)表達(dá)水平。其中，miR-215-5p擴(kuò)增引物由上海生工合成，miR-215-5p：上游引物：5′-CTCGAGATGTCATCCTCA-3′，下游引物：5′-GAATTCGTGAGTTCTTCTG-3′；β-actin：上游引物：5′-AAGATGACCCAGATC ATGTTTGAG-3′，下游引物：5′-GCAGCTCGTAGCTCTTCTCCAG-3′。擴(kuò)增條件為95℃ 5 min，95℃ 20 s，60℃ 1 min，72℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4MTT實(shí)驗(yàn) 收集各組5×103個(gè)MHCC97-H細(xì)胞接種96孔板，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，分別加入20 μl/孔MTT，37℃孵育4 h，加入150 μl/孔 二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞在490 nm的吸光值(A值)。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn) 收集5×105個(gè)MHCC97-H細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，加入500 μl緩沖液、5 μl膜聯(lián)蛋白(Annexin V)V-FITC、5 μl碘化丙啶(PI)混勻，避光孵育15～20 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)MHCC97-H凋亡率。

1.2.6Transwell實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前，提前將基質(zhì)膠融化、稀釋，覆蓋Transwell上室膜。收集各組MHCC97-H細(xì)胞，吸5×104個(gè)MHCC97-H細(xì)胞懸液加入Transwell上室，下室加入600 μl含15%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h；清洗上室，棄去殘留液體、細(xì)胞和基質(zhì)膠，多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min，顯微鏡下取5個(gè)區(qū)域拍照、計(jì)數(shù)，取平均值。

1.2.7雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 通過Target Scan Targetscan(http：//www.targetscan.org/vert_71/)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-215-5p與FOXN1的3′-UTR存在結(jié)合位點(diǎn)。野生型(FOXN1-wt)和突變型(FOXN1-mut)FOXN1 3′-UTR熒光素酶載體分別與miR-215-5p mimics和陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染，37℃培養(yǎng)48 h，測(cè)定雙熒光素酶的相對(duì)活性。

1.2.8Western印跡 取各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MHCC97-H細(xì)胞，在RIAP裂解液作用下提取蛋白，以10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)作為介質(zhì)進(jìn)行電泳，將FOXN1蛋白條帶轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。5%封閉液孵育2 h，TBST清洗3次，加入FOXN1(1∶200)、GAPDH一抗(1∶10 000)，孵育過夜，加入二抗(1∶1 000)孵育1 h，加入ECL發(fā)光液，Image J軟件檢測(cè)FOXN1蛋白灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-215-5p在MHCC97-H細(xì)胞系中的表達(dá)量 與人正常肝細(xì)胞(LO2)miR-215-5p相對(duì)表達(dá)量(1.000±0.059)相比，MHCC97-H細(xì)胞系表達(dá)量(3.285±0.296)顯著增加(P<0.05)。

2.2敲低miR-215-5p的表達(dá)量對(duì)MHCC97-H細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組相比，anti-miR-215-5p-NC組miR-215-5p表達(dá)量無明顯變化，但在anti-miR-215-5p組表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。anti-miR-215-5p組48及72 h OD值顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

2.3敲低miR-215-5p的表達(dá)量對(duì)MHCC97-H細(xì)胞凋亡、侵襲的影響 與對(duì)照組相比，anti-miR-215-5p-NC組細(xì)胞的凋亡率、侵襲細(xì)胞數(shù)無明顯變化，但anti-miR-215-5p組細(xì)胞凋亡率顯著增加，侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低(均P<0.05)。見表1、圖1、圖2。

表1 敲低miR-215-5p表達(dá)量對(duì)MHCC97-H細(xì)胞增殖及侵襲的影響

2.4miR-215-5p靶基因的預(yù)測(cè)和驗(yàn)證 Targetscan在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-215-5p的下游靶基因，發(fā)現(xiàn)FOXN1 3′UTR區(qū)域含有部分堿基可與miR-215-5p特異性結(jié)合；見圖3。進(jìn)一步通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，miR-215-5p過表達(dá)和FOXN1-wt聯(lián)合轉(zhuǎn)染入MHCC97-H細(xì)胞可顯著降低雙熒光素酶相對(duì)活性(P<0.05)；但miR-215-5p過表達(dá)與FOXN1-mut聯(lián)合轉(zhuǎn)染對(duì)雙熒光素酶的活性無明顯變化(P>0.05)。見表2。

圖1 敲低miR-215-5p的表達(dá)量對(duì)MHCC97-H細(xì)胞凋亡的影響

圖2 敲低miR-215-5p的表達(dá)量對(duì)MHCC97-H細(xì)胞侵襲的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

圖3 Targetscan在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-215-5p潛在靶基因

表2 過表達(dá)miR-215-5p對(duì)雙熒光素酶活性的影響

2.5上調(diào)/下調(diào)miR-215-5p對(duì)靶基因表達(dá)量的影響 與miR-215-5p-NC組FOXN1蛋白相對(duì)表達(dá)量(1.000±0.073)相比，miR-215-5p組(0.469±0.054)顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-215-5p-NC組FOXN1蛋白相對(duì)表達(dá)量(1.025±0.085)相比，anti-miR-215-5p組(2.852±0.236)顯著增加。見圖4。

1～4：miR-215-5p-NC組、miR-215-5p組、anti-miR-215-5p-NC組、anti-miR-215-5p組圖4 上調(diào)/下調(diào)miR-215-5p對(duì)FOXN1蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響

2.6過表達(dá)FOXN1和miR-215-5p對(duì)MHCC97-H細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 與NC組FOXN1蛋白相對(duì)表達(dá)量(1.000±0.059)相比，F(xiàn)OXN1組(3.658±0.327)顯著增加，抑制MHCC97-H細(xì)胞增殖、侵襲，促進(jìn)凋亡(見P<0.05)，與FOXN1組比較，F(xiàn)OXN1+miR-215-5p-NC組FOXN1蛋白相對(duì)表達(dá)量(3.743±0.353)、增殖、凋亡、侵襲無明顯變化(P>0.05)；與FOXN1+miR-215-5p-NC組相比，F(xiàn)OXN1+miR-215-5p組MHCC97-H細(xì)胞中FOXN1蛋白相對(duì)表達(dá)量(1.522±0.145)顯著降低，促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲，抑制凋亡(均P<0.05)。見表3，圖5。

表3 過表達(dá)FOXN1和miR-215-5p對(duì)MHCC97-H細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡的影響

1～4：NC組、FOXN1組、mRr-215-5p-NC組、FOXN1+miR-215-5p組圖5 過表達(dá)FOXN1和miR-215-5p對(duì)FOXN1蛋白的影響

3 討 論

研究證實(shí)多種miRNA在肝癌病理過程中發(fā)揮癌基因或致癌基因的作用，調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖、侵襲等〔6,7〕。在結(jié)直腸癌中，miR-215-5p表達(dá)量較正常對(duì)照組織表達(dá)量下調(diào)，其表達(dá)量與結(jié)腸癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期和總生存期有關(guān)，在結(jié)直腸癌演進(jìn)過程中發(fā)揮抑制作用，其作用機(jī)制主要是通過靶向調(diào)控HOXB9的表達(dá)量〔8〕。在肺癌病理過程中，miR-215表達(dá)量降低，并通過抑制ZEB2、TYMS、DTL表達(dá)參與肺癌細(xì)胞增殖、凋亡過程〔9,10〕。在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中，miR-215表達(dá)量顯著增加，且與患者的腫瘤分化程度、臨床分期等有關(guān)，并通過靶向調(diào)控RUNX1、FOXO1影響胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲等過程〔11～13〕。

Liu等〔14〕研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎病毒X蛋白突變體Δ127X蛋白(HBxΔ127)通過上調(diào)miR-215的表達(dá)水平，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。miR-215在阿霉素誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞中表達(dá)量上調(diào)，從而降低細(xì)胞的化療敏感性，進(jìn)一步促進(jìn)肝癌的惡化，影響患者的預(yù)后〔15〕。本研究結(jié)果表明miR-215-5p對(duì)肝癌組織轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用，下調(diào)miR-215-5p的表達(dá)量可阻礙MHCC97-H細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，從而影響肝癌組織的進(jìn)一步惡化。

FOXN1屬于FOX家族成員，是一種新的胃腸腫瘤抑癌基因〔16〕。本研究結(jié)果表明FOXN1是miR-215-5p的下游靶基因之一；miR-215-5p負(fù)反饋調(diào)節(jié)FOXN1表達(dá)量；miR-215-5p可通過抑制FOXN1調(diào)控MHCC97-H細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡。

綜上，miR-215-5p在高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞MHCC97-H中表達(dá)量增加；敲低miR-215-5p可通過抑制FOXN1表達(dá)量阻礙MHCC97-H細(xì)胞增殖、侵襲，促進(jìn)其凋亡，從而參與肝癌發(fā)生發(fā)展過程。但本實(shí)驗(yàn)只從細(xì)胞水平探究了miR-215-5p的作用及分子機(jī)制，未來會(huì)在多株細(xì)胞系及動(dòng)物模型中進(jìn)一步探究miR-215-5p的相關(guān)作用，為肝癌患者預(yù)后的提高提供理論依據(jù)。