microRNA-200a干擾肺癌患者外周血B細(xì)胞IL-18的表達(dá)

王雪海 李鋼 羅青松 謝家勇 甘崇志

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院胸外科，四川 成都 610072)

肺癌的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，病死率較高。經(jīng)過(guò)多年的研究，不斷優(yōu)化早期篩查、手術(shù)方案與術(shù)后放化療，患者的5年生存率得以提升〔1〕，但預(yù)后生活質(zhì)量較差。因此新治療方法的研究仍然任重道遠(yuǎn)。人們從免疫學(xué)的角度對(duì)肺癌預(yù)后不良進(jìn)行分析，認(rèn)為患者的免疫細(xì)胞已經(jīng)對(duì)腫瘤產(chǎn)生了耐受〔2〕。腫瘤免疫耐受指的是一些腫瘤細(xì)胞能通過(guò)某種機(jī)制擺脫患者免疫系統(tǒng)的監(jiān)控而遷徙、轉(zhuǎn)移，其生長(zhǎng)不受機(jī)體控制。關(guān)于腫瘤細(xì)胞如何逃逸的，現(xiàn)在還沒(méi)有很明確的機(jī)制。一些起到抗腫瘤作用的分子也參與了免疫耐受調(diào)控。白細(xì)胞介素(IL)-18是一種表現(xiàn)出抗腫瘤活性的細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)干擾素(IFN)-γ合成、促進(jìn)自然殺傷(NK)細(xì)胞進(jìn)而增強(qiáng)化Th1型免疫反應(yīng)〔3〕。部分長(zhǎng)度18～22核苷酸的microRNA(miRNA)能調(diào)控細(xì)胞因子表達(dá)。miRNA-200家族在多種腫瘤中呈現(xiàn)表達(dá)下調(diào)的特點(diǎn)〔4〕，其功能類(lèi)似于抑癌基因，與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移表現(xiàn)出密切的關(guān)系，在胃癌中的研究較多，但在肺癌中的研究國(guó)內(nèi)較少見(jiàn)。本研究探討miRNA-200a干擾肺癌患者外周血B細(xì)胞IL-18的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取2018年5月至2019年5月在四川省人民醫(yī)院就診的非小細(xì)胞肺癌患者47例為研究組，其中男29例，女18例，年齡39～67歲，平均(53.28±6.23)歲，病灶直徑1～6 cm，平均(3.6±0.12)cm。另隨機(jī)選取同期體檢的健康人群47例為對(duì)照組，其中男25例，女22例，年齡38～69歲，平均(54.06±5.82)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)過(guò)病理學(xué)診斷確診為非小細(xì)胞肺癌；沒(méi)有合并其他系統(tǒng)癌癥〔5〕。排除標(biāo)準(zhǔn)：并發(fā)免疫系統(tǒng)疾病；近期服用過(guò)免疫抑制類(lèi)藥物。入選患者知情并同意本研究?jī)?nèi)容。兩組一般資料無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性，研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2CD19B淋巴細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 兩組入院治療第2天清晨，保持空腹，從肘靜脈處抽取約30 ml外周血，采用密度梯度離心的方法分離血液中的外周血單核細(xì)胞(PBMC)。選用Mitenyi Bio-tech試劑盒，用免疫磁珠方法分離CD19B淋巴細(xì)胞，通過(guò)流式分析純度超過(guò)98%后培養(yǎng)在RPMI1640培養(yǎng)液〔含10%胎牛血清、20 ng/ml anti-CD40抗體、1×105U/L青霉素，100 mg/L鏈霉素、2 mmol/L L-谷胺酰胺(Gln)〕，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔48 h換液1次。將生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞傳代至6孔板中進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)〔6〕。

1.3細(xì)胞中RNA的提取 用Trizol試劑盒(tiangen公司，貨號(hào)DP121221)提取細(xì)胞中的總RNA。用Nanodrop檢測(cè)RNA A260/280值≥1.8時(shí)，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(tiangen公司，貨號(hào)KR106)，然后按照5 μl SYBR GREEN、1.4 μl cDNA、0.6 μl 5 μmol/L引物配制反應(yīng)體系；放入實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀器中，條件：95℃(15 min)〔95℃(10 s)、59℃(20 s)、72℃(20 s)〕40個(gè)循環(huán)，72℃(5 min)。U6為內(nèi)參，miRNA-200、IL-18相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

1.4miRNA-200a脂質(zhì)體的構(gòu)建 miRNA-200a質(zhì)粒由華大基因合成。取磷脂酰膽堿100 mg、膽固醇100 mg、1，2-二油?；蚜姿徕c100 mg，將3種粉末混合與4.5 ml氯仿中，帶氯仿?lián)]發(fā)后，取10 mg脂質(zhì)薄膜加入500 μl生理鹽水作對(duì)照組處理，研究組需多加0.5 mg質(zhì)粒，混勻，60℃震蕩15 min，三蒸水洗滌備用。

1.5向CD19B淋巴細(xì)胞中轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體 在對(duì)照組培養(yǎng)液中加入10 μg/ml miRNA-200a脂質(zhì)體與空白脂質(zhì)體，培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，加入新培養(yǎng)液，再加入1 μg/ml脂多糖(LPS)，處理48 h后提RNA檢測(cè)miRNA-200a與IL-18表達(dá)量。

1.6荷瘤小鼠模型的構(gòu)建 選擇8周齡、體重19～21 g的雄性C57BALB/c小鼠，飼養(yǎng)在(23±2)℃、相對(duì)濕度40%～70%的獨(dú)立通風(fēng)櫥中。肺癌細(xì)胞株KLN205購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究所，培養(yǎng)于Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)，每日換液1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，在小鼠背部皮下注射數(shù)目約為106個(gè)肺癌細(xì)胞，每日檢測(cè)1次瘤體大小〔7〕。

1.7miRNA-200a脂質(zhì)體對(duì)瘤體生長(zhǎng)的影響 在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的第0、4、8天，按照0.2 mg/只的劑量向荷瘤小鼠腹腔注射miRNA-200a脂質(zhì)體或空白脂質(zhì)體。每日檢測(cè)1次瘤體大小，記錄實(shí)驗(yàn)第12天的瘤體大小。

1.8培養(yǎng)液與荷瘤小鼠血清中IL-18的檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(碧云天，貨號(hào)PI553)檢測(cè)培養(yǎng)液或血清中IL-18水平。采用尾靜脈取血的方法收集小鼠血液，凝固后離心去上清液即為血清。應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)λ=450 nm處的吸光度值并借助標(biāo)準(zhǔn)曲線可得知培養(yǎng)液樣本中的IL-18含量。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 將實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果從電腦中拷貝出來(lái)，使用2-ΔΔCt法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析〔8〕。采用SPSS18.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組CD19B淋巴細(xì)胞中miRNA-200a與 IL-18表達(dá)水平比較 經(jīng)過(guò)流式篩選，兩組外周血細(xì)胞分離出的CD19B淋巴細(xì)胞純度達(dá)到98%，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。研究組外周血CD19B淋巴細(xì)胞中miRNA-200a及IL-8表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(均P<0.05)，見(jiàn)表1、圖1。

表1 兩組CD19B淋巴細(xì)胞中miRNA-200a與 IL-18表達(dá)對(duì)比

2.2轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體后CD19B淋巴細(xì)胞中miRNA-200a與 IL-18 mRNA表達(dá)水平比較 在對(duì)照組CD19B淋巴細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA-200a脂質(zhì)體與空白脂質(zhì)體并LPS誘導(dǎo)后，miRNA-200a脂質(zhì)體組miRNA-200a及IL-8 mRNA表達(dá)水平均顯著高于空白脂質(zhì)體組(均P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體后荷瘤小鼠瘤體生長(zhǎng)情況與血清中IL-18水平比較 實(shí)驗(yàn)第12天對(duì)荷瘤小鼠的瘤體生長(zhǎng)情況進(jìn)行檢測(cè)，miRNA-200a脂質(zhì)體處理組瘤體顯著小于空白脂質(zhì)體組(P<0.05)，miRNA-200a脂質(zhì)體處理組血清中IL-18水平顯著高于空白脂質(zhì)體組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表2 轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體后CD19B淋巴細(xì)胞中miRNA-200a與 IL-18 mRNA表達(dá)水平的對(duì)比

表3 轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體后第12天荷瘤小鼠瘤體生長(zhǎng)及IL-18水平的對(duì)比

2.4脂質(zhì)體處理前后培養(yǎng)液中IL-18水平比較 處理前，研究組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-18水平〔(257.31±3.98)μg/L〕顯著高于對(duì)照組〔(168.23±3.47)μg/L;t=10.906,P<0.05〕；脂質(zhì)體處理后，miRNA-200a脂質(zhì)體組培養(yǎng)液的IL-8水平〔(256.99±6.33)μg/L〕顯著高于空白脂質(zhì)體組〔(163.09±6.74)μg/L;t=11.285,P<0.05〕。

3 討 論

肺癌有很多分類(lèi)，其中非小細(xì)胞肺癌是最常見(jiàn)的一種，由于早期診斷缺乏特異性強(qiáng)的生物標(biāo)志物，晚期容易轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處，即使5年生存率得到有效提升，但患者預(yù)后生活質(zhì)量無(wú)法得到有效保障〔8〕。

IL-18是一種細(xì)胞因子，主要由巨噬細(xì)胞分泌并合成，IL-18能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖，促使活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ；同時(shí)IL-18還能激活NK細(xì)胞，發(fā)揮NK細(xì)胞抗腫瘤的生物學(xué)作用〔9〕。通過(guò)構(gòu)建不同的荷瘤動(dòng)物模型，IL-18在乳腺癌、淋巴瘤、肺癌、白血病、骨髓瘤等惡性腫瘤中起到一定的治療作用。miRNA是一種真核生物細(xì)胞內(nèi)源性的短RNA分子，長(zhǎng)約20 bp。雖然miRNA不直接編碼蛋白，但可通過(guò)直接作用于靶mRNA，也可與靶mRNA上3′端的非翻譯區(qū)相互結(jié)合，以這兩種方式來(lái)調(diào)控基因在轉(zhuǎn)錄后的水平〔10〕。研究表明，多種癌癥的發(fā)生與miRNA有著密切的關(guān)系。除了家族遺傳和一些證實(shí)的危險(xiǎn)因素以外，miRNA在肺癌發(fā)展的作用受到眾多研究人員的重視。肺癌由原發(fā)灶向周?chē)慕M織血管浸潤(rùn)侵襲并借助血液循環(huán)、淋巴循環(huán)可擴(kuò)散至鄰近或遠(yuǎn)處的組織器官，是引發(fā)患者病情加重或者是死亡的關(guān)鍵原因〔11〕。

miRNA-200a是最先被發(fā)現(xiàn)在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮調(diào)控作用的miRNA，能抑制機(jī)體調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，其正常水平的表達(dá)能防止炎癥反應(yīng)過(guò)度對(duì)機(jī)體的損傷。近些年的研究使miRNA-200a在調(diào)控固有免疫及適應(yīng)性免疫中發(fā)揮了重要作用〔12〕。在肺部其他疾病的研究中，如吸入性肺損傷，當(dāng)研究人員用IL-18處理細(xì)胞后，miRNA-200a表現(xiàn)出依賴時(shí)間與劑量的快速增長(zhǎng)趨勢(shì)〔13〕，說(shuō)明在肺部相關(guān)疾病的免疫調(diào)控中miRNA-200a扮演了重要角色。本研究進(jìn)一步說(shuō)明了miRNA-200a與IL-18正相關(guān)。

在胃癌或胃腫瘤中，由于表達(dá)上皮的相關(guān)基因沉默或缺失，miRNA-200家族表達(dá)水平普遍下降。已經(jīng)證明miRNA-200a與脈管瘤栓存在相關(guān)性，提示miRNA-200a可能與腫瘤的侵襲遷移相關(guān)〔14〕。大量研究表明，miRNA-200家族上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、β-catenin/Wnt通路的抑制因子。在鼻咽癌中的研究證明了miRNA-200a能直接靶向作用于β-catenin蛋白、抑制其翻譯，從而抑制β-catenin/Wnt通路〔15〕，但在胃癌中miRNA-200a是否遵循此調(diào)控方式還不得而知。在多種腫瘤細(xì)胞中，miRNA-200a表達(dá)下調(diào)能促使E盒結(jié)合鋅指蛋白(ZEB)1/ZEB2表達(dá)上調(diào)，抑制E-cadherin合成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT的發(fā)生從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲。此外miRNA-200家族也能與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β2發(fā)生作用，降低TGF-β2的表達(dá)進(jìn)而抑制EMT〔16〕。已知TGF-β2是TGF-β信號(hào)通路中的重要信號(hào)分子，而TGF-β信號(hào)通路又能調(diào)控EMT發(fā)生，進(jìn)一步證明了miRNA-200a與腫瘤相互作用的密切關(guān)系。

綜上，miRNA有廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值，與腫瘤密切相關(guān)的特異性miRNA，其編碼序列的發(fā)現(xiàn)提供了癌癥治療的特異性的靶點(diǎn)。隨著人們對(duì)miRNA的加工過(guò)程和其控制的基因的深入研究及生物信息學(xué)和miRNA基因芯片技術(shù)的發(fā)展，肺癌的發(fā)病機(jī)制將逐漸被闡明。