基于降低氧化應激損傷探究解毒益智方改善APP/PS1阿爾茨海默病小鼠神經(jīng)毒性作用機制

王田野 張鵬起 朱曉婷 馮麗娜 王嘉樂 崔婷婷 黎明全

(長春中醫(yī)藥大學 1中醫(yī)學院，吉林 長春 130017；2附屬第三臨床醫(yī)院腦病中心三療區(qū)；3中西醫(yī)結合學院)

阿爾茨海默病(AD)臨床主要癥狀為學習、認知及記憶力下降甚至喪失〔1〕，其發(fā)病受諸多因素影響，目前最為主流的學說為β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積。Aβ沉積可受多種因素調(diào)控，其中氧化應激狀態(tài)可對其沉積造成影響，如因應激狀態(tài)產(chǎn)生大量活性氧(ROS)〔2〕，使大多數(shù)抗氧化劑酶活性減弱，誘發(fā)多種產(chǎn)物，進一步引發(fā)后續(xù)惡性級聯(lián)反應如神經(jīng)元細胞總體數(shù)量減少、形態(tài)萎縮、能量代謝異常、線粒體功能異常，最終使Aβ沉積，導致機體出現(xiàn)認知障礙和衰老等〔3〕。本課題組多年來一直從事AD的臨床研究及基礎研究，創(chuàng)新提出“髓虛毒損”是AD發(fā)病的病機關鍵〔4〕，并結合“上下交損，當治其中〔5〕”創(chuàng)立解毒益智方(JDYZF)，在臨床應用多年，療效顯著。課題組認為AD病機為腎精虧虛，腦髓難以充養(yǎng)，氣血津液不能循行，瘀毒內(nèi)生，神機失用，發(fā)為本病〔6〕。解毒益智方由黃連、益智仁、川芎、地龍、龜板膠、山萸肉、酒大黃七味藥按比例(1∶2∶1∶1∶1∶1∶1)組成。黃連，瀉火燥濕解毒〔6〕；益智仁，充養(yǎng)腦髓、固攝腎精，配伍山茱萸，補益肝腎陰精，配伍龜板膠，補腎中元陽，三藥陰陽同補，加之補益肝陰，氣血充盈，使元神得以充養(yǎng)；酒大黃與黃連相合共奏清上焦火熱之功，亦有活血化瘀之能；川芎和地龍，走竄之性共同發(fā)揮活血行血通絡功效，使神清語明。七藥配伍，標本兼治，既補益虛損,又祛瘀生新，從而治療AD〔7,8〕。

JDYZF中多糖混合物是通過上調(diào)氧化應激相關基因壽命調(diào)控因子(daf-16)、熱休克因子(HSF)-1的表達量實現(xiàn)對線蟲的神經(jīng)毒性保護作用〔9〕，降低AD CL4176線蟲癱瘓率并延長其壽命。但JDYZF對于AD雙轉基因鼠在氧化應激調(diào)控機制的相關研究尚未開展。本研究采用淀粉樣前體蛋白β/早老素(APP/PS)1雙轉基因AD小鼠為實驗動物，以JDYZF為干預手段，探究JDYZF對AD小鼠的空間學習記憶能力的影響，明確JDYZF通過調(diào)控機體的氧化應激水平對AD小鼠神經(jīng)毒性起到保護作用。

1 材料與方法

1.1材料 JDYZF由黃連(拉丁名：Coptis chinensis Frach.，批號190802)；益智仁(拉丁名：Fructus Alpinae Oxyphyllae.，批號 045200303)；地龍(拉丁名：Pheretima aspergillum.，批號 C20053007)；山茱萸(拉丁名：Cornus officinalis，批號 494191101)；酒大黃(拉丁名：Radix Et Rhizoma Rhei，批號 494191101)；龜板膠(拉丁名：Chinemys reevesii，批號 494191101)；川芎(拉丁名：Rhizoma Chuanxiong，批號 494191101)組成，中藥飲片均由吉林省宏檢大藥房有限公司提供。多奈哌齊(衛(wèi)材藥業(yè)有限公司，批號 2012045)購于長春中醫(yī)藥大學附屬第三臨床醫(yī)院。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px,南京建成生物工程研究所有限公司,A003-1)；超氧化物歧化酶(SOD,南京建成生物工程研究所有限公司,A005-1)；試劑盒丙二醛(MDA,南京建成生物工程研究所有限公司,A001-3)。PCR引物設計(上海生物工程股份有限公司)。Morris水迷宮操作系統(tǒng)(安徽淮北正華生物儀器設備公司，ZH0065)；萬分之一電子天平(Sartorius 公司,BT125D);生物顯微鏡(Nikon公司，CI-L)。

1.2實驗方法

1.2.1動物實驗與分組 APP/PS1雙轉基因AD小鼠40只(SPF 級4月齡，雄性)、野生型 C57BL/6小鼠10只，均購于南京君科生物科技股份有限公司〔許可證號：SCXK(蘇)2020-0009〕。動物在適應性飼養(yǎng)〔溫度(25±1)℃，相對濕度(60±5)%，自由攝食水，12 h～12 h明暗交替〕7 d后，隨機將雙轉基因AD小鼠分為4組，模型組(n=10)、多奈哌齊組(n=10)、JDYZF低劑量組(n=10)、JDYZF高劑量組(n=10)，C57BL/6小鼠(n=10)為空白組。多奈哌齊組給予濃度0.45 g/kg鹽酸多奈哌齊，低、高劑量組分別給予10 g/kg及20 g/kg的JDYZF，空白組和模型組分別給予等體積生理鹽水，連續(xù)灌胃8 w。動物實驗操作均獲得長春中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2.2Morris水迷宮實驗 實驗前APP/PS1雙轉基因鼠進行行為學訓練(4個象限入水后，記錄小鼠在120 s內(nèi)找到站臺所需要時間，即逃避潛伏期)，每只動物每天固定時間訓練一次，連續(xù)訓練4 d后，將平臺撤去，進行空間探索實驗，記錄其運行軌跡及在120 s內(nèi)動物穿臺次數(shù)、目標象限停留時間。

1.2.3動物取材 水迷宮實驗結束48 h后，摘眼球取血并置于1.5 ml EP管中，4 000 r/min，4℃離心獲取血清，-80℃ 儲存。灌流后冰上斷頭取腦獲取小鼠兩側的海馬組織，部分放入液氮保存，余下放置于-80℃待測。由于小鼠腦組織較小，每組隨機取樣品進行熒光定量PCR實驗，一部分樣品進行相關免疫組化實驗，余下樣品4℃ 保存于40 g/L多聚甲醛，進行病理切片實驗。

1.2.4組織病理學檢查 用10%的多聚甲醛固定新鮮的腦組織，經(jīng)過石蠟包埋后切成4～5 μm的冠狀切片并進行蘇木素-伊紅(HE)染色，在光鏡下觀察海馬及皮層神經(jīng)元的病理學變化。

1.2.5氧化指標檢測 將小鼠海馬組織用磷酸鹽緩沖液(PBS)分別制成10 g/L的勻漿液(組織重量占勻漿液的比例為10%)，樣品準備完畢后用二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，根據(jù)試劑盒指示說明測定小鼠海馬組織勻漿上清液中SOD、GSH-Px及MDA的水平。

1.2.6免疫組化分析 將4℃保存于40 g/L多聚甲醛的海馬組織取出，按照常規(guī)方法脫水并去除石蠟，將切片置于修復盒(檸檬酸抗原修復緩沖液)中，微波爐內(nèi)進行抗原修復，自然冷卻后，置于洗滌液中洗滌，3% H2O2溶液室溫避光孵育25 min，3%牛血清白蛋白(BSA)均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min。分別滴加SIRT1抗體(1∶500)、核基因-紅系2相關因子(Nrf)2抗體(1∶200)、血紅素氧合酶(HO)-1抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜，滴加辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗鼠二抗于37℃中孵育1 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)反應10 min顯色后蒸餾水沖洗。后蘇木素復染，沖洗，脫水，透明，封片后，于3DHISTECH切片掃描儀成像(陽性細胞呈現(xiàn)棕褐色或棕黃色)。

1.2.7Real-time PCR實驗 通過Real-time PCR 檢測小鼠海馬區(qū)SIRT1、Nrf2、HO-1的mRNA的表達量。將小鼠海馬組織放入液氮預冷的玻璃勻漿器中，加入Trizol裂解液冰上充分研磨后，離心取上清，加入三氯甲烷充分混勻后靜置提取上清后加入異丙醇沉淀，4℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清，再次加75%乙醇洗滌后，離心棄上清，溶解RNA，55℃孵育5 min，依據(jù)試劑盒將總mRNA 逆轉錄為cDNA后進行PCR擴增，相應引物詳見表1，按照反應條件：94℃，10 min；40×(94℃，15 s；59℃，15 s；72℃，30 s)，進行熒光定量PCR，靶基因進通過2-ΔΔCt法計算相對表達水平。

表1 引物序列

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS26.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1JDYZF對空間學習記憶能力的影響 模型組逃避潛伏期較空白組顯著增加，穿越平臺次數(shù)、目標象限停留時間均較空白組顯著減少(P<0.05，P<0.01)。JDYZF高、低劑量組及多奈哌齊組小鼠逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)、停留目標象限時間均較模型組顯著改善，其中JDYZF低劑量組效果優(yōu)于JDYZF高劑量組(P<0.05，P<0.01)，見表2。

表2 各組Morris水迷宮實驗結果

2.2JDYZF對海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)的影響 如圖1所示，與空白組相比，模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞排列疏松，細胞體積縮小，細胞核緊縮，神經(jīng)元細胞數(shù)量減少；JDYZF治療后，神經(jīng)細胞排列較為緊密，細胞核仁清晰，染色質豐滿，數(shù)量明顯增多，且JDYZF低劑量組與多奈哌齊組效果較為顯著。

2.3JDYZF對氧化應激水平的影響 與空白組比較，模型組海馬組織中總 SOD及GSH-Px活性顯著下降(P<0.05),MDA含量明顯增加(P>0.05)；與模型組相比，給予不同劑量的JDYZF及鹽酸多奈哌齊后，小鼠血清中SOD及GSH-Px顯著增加，MDA表達量顯著降低，其中多奈哌齊組和JDYZF低劑量組作用更優(yōu)(P<0.05)。見表3。

圖1 JDYZF對APP/PS1小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)的影響(HE，×200)

表3 JDYZF對SOD、MDA、GSH-Px的影響

2.4JDYZF對海馬組織SIRT1、Nrf2、HO-1免疫組化影響 與空白組相比，模型組中抗氧化蛋白SIRT1、Nrf2、HO-1的陽性細胞數(shù)明顯減少；與模型組相比，JDYZF低劑量組、高劑量組及多奈哌齊組增加了SIRT1、Nrf2、HO-1的陽性細胞數(shù)，其中以JDYZF低劑量效果最為明顯。見圖2～4、表4。

2.5JDYZF對APP/PS1小鼠海馬組織中 Nrf2、SIRT1、HO-1的mRNA表達水平的影響 與空白組比較，模型組 Nrf2、SIRT1、HO-1的mRNA 表達水平明顯下降(P<0.05)；與模型組比較，多奈哌齊組、JDYZF低、高劑量組SIRT1、HO-1、Nrf2 mRNA 表達水平均升高，除JDYZF高劑量組HO-1 mRNA外，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。見表4。

圖2 各組海馬SIRT1免疫組化染色結果(×40)

圖3 各組鼠海馬Nrf2免疫組化染色結果(×40)

圖4 各組海馬HO-1免疫組化染色結果(×40)

表4 各組SIRT1、HO-1、Nrf2陽性面積比率及mRNA比較

3 討 論

AD作為一種不可逆的神經(jīng)退行性疾病，其主要的臨床表現(xiàn)為學習記憶功能的逐漸喪失及運動逐步減緩。機體的氧化應激失衡是AD發(fā)病的重要因素之一，AD患者體內(nèi)自由基活性氧(ROS)水平升高，會加速細胞膜脂質過氧化〔10〕，導致細胞膜損傷及神經(jīng)元細胞死亡進而加速AD發(fā)生及發(fā)展。

本研究Morris水迷宮實驗表明JDYZF可以起到改善AD小鼠的學習和記憶能力。有研究表明，SOD及GSH-Px可清除體內(nèi)多余的ROS，抑制其過度生成和積累，改善AD小鼠認知功能〔11〕。本實驗驗證JDYZF可通過提高對APP/PS1小鼠海馬組織抗氧化能力起效。而Keap1/Nrf2信號通路對機體氧化應激反應具有一定調(diào)控作用，該信號通路的激活對延緩AD發(fā)病及對病情發(fā)展起重要作用。研究表明〔12〕AD模型小鼠海馬組織中Nrf2，下游的抗氧化酶HO-1、NOQ1等mRNA水平降低，與Aβ淀粉樣蛋白沉積相關。研究表明〔13〕AD患者腦中Nrf2的含量遠低于正常人含量水平。向AD模型小鼠的海馬組織中注射編碼Nrf2的病毒載體可提高Nrf2、HO-1的mRNA表達量，明顯改善小鼠的空間學習記憶能力〔14〕。另一項野生型和Nrf2缺陷型小鼠胚胎神經(jīng)干細胞的體外試驗研究表明〔15〕：Nrf2基因過表達能夠減輕Aβ誘導的神經(jīng)毒性，而Nrf2缺陷型干細胞中Aβ誘導的神經(jīng)毒性明顯加重。上述研究均表明Nrf2能夠提高神經(jīng)元細胞的抗氧化能力、對Aβ誘導的神經(jīng)毒性具有保護作用，延緩AD進程。SIRT1可以將Nrf2快速激活,是Nrf2的上游調(diào)節(jié)因子〔16〕。SIRT1作為Nrf2的上游蛋白，是沉默信息調(diào)節(jié)因子(Sirtuins)家族的一員，可通過去乙?；揎椊档蚏OS水平，促進神經(jīng)元細胞存活，在AD發(fā)病和治療中發(fā)揮重要保護作用〔17〕。

AD病變最常累及的部位為海馬組織，其主要負責信息存儲，與學習能力及記憶力呈正相關〔18〕，AD發(fā)生后，海馬組織可出現(xiàn)老年斑〔19〕、神經(jīng)元纖維纏結〔20〕和神經(jīng)元大量丟失等。本實驗結果提示JDYZF可能激活了SIRT1/Nrf2/HO-1信號通路，從而對AD小鼠海馬組織的氧化應激損傷起到保護作用。同時，這一結果在APP/PS1小鼠海馬組織的免疫組化實驗中得到驗證。JDYZF可通過調(diào)節(jié)SIRT1/Nrf2/HO-1信號通路對抗AD小鼠中氧化應激水平失衡起效。