基于HPLC檢測老年癡呆患者血清淀粉樣變成分的方法

劉曉丹 呂玉洋 郭夢洋 張丹,2 呂殊星 鄭麗麗 孫續(xù)國

(1天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，天津 300203；2三河市醫(yī)院檢驗科)

老年癡呆(AD)主要病理學(xué)特征為大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)外有神經(jīng)纖維纏結(jié)和老年斑塊形成〔1〕。目前臨床診斷AD主要依據(jù)影像、臨床評估〔2〕，而AD臨床檢驗項目提出β-淀粉樣蛋白、早老蛋白-1等蛋白為檢測標(biāo)志物〔3〕，分析這些項目檢測方法的原理，均是基于免疫標(biāo)記的技術(shù)進行測定，檢測的這些AD標(biāo)志物為淀粉樣變前蛋白，并非沉積于組織內(nèi)的病理性淀粉樣變成分〔4〕。研究已經(jīng)證明，病理性淀粉樣變成分與淀粉樣變前蛋白具有相同抗原性，但是分子結(jié)構(gòu)不同。此外，本組先前發(fā)現(xiàn)AD血液存在病理性淀粉樣變成分〔5〕，臨床可以直接檢測血液病理淀粉樣變成分的檢測方法。

目前大量研究支持淀粉樣變蛋白聚合后可形成淀粉樣變沉積〔6〕，本文探討用高效液相色譜法(HPLC)分析發(fā)生變構(gòu)的淀粉樣變蛋白和(或)纖維技術(shù)，建立一步法定量檢測淀粉樣變成分的方法。

1 資料與方法

1.1研究對象 來自天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院、天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科診治中心確診的AD患者6例，平均年齡(66.80±13.18)歲，健康志愿者6例，平均年齡(69.21±8.94)歲。AD患者均符合美國國立神經(jīng)病、語言交流障礙和腦卒中研究所-AD及相關(guān)疾病學(xué)會(NINCDS-ADRDA)中的AD診斷標(biāo)準(zhǔn)。研究通過大學(xué)道德倫理委員會的批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。

1.2材料 色譜級乙腈和水購自美國Sigma-Aldrich公司。硫磺素T購自日本東京化成公司。其他化學(xué)品購自北京索萊寶有限公司。

1.3方法

1.3.1乙腈沉淀血清蛋白質(zhì) 將1 ml血清和1 ml乙腈混合并置于冰上1 h，以5 000 r/min離心5 min，分離上清。

1.3.2十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 將50 μg血清和上清液用于SDS-PAGE，用考馬斯藍(lán)染色，然后使用Quantity One v4.6.6分析。

1.3.3HPLC分離血清蛋白 將100 μl上清注入HPLC系統(tǒng)，該系統(tǒng)由Agilent 1260系列液相色譜儀組成，配備有四元泵和脫氣裝置，恒溫自動進樣器和柱室，多波長檢測器和化學(xué)工作站軟件。室溫下在Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱上，通過線性乙腈梯度(50%～86%)洗脫，以1.0 ml/min的流速進行蛋白質(zhì)的分離，洗脫時間為20 min。

1.3.4硫黃素(Th)T溶液測定淀粉樣變程度 收集保留時間1.5～3.0 min，10.0～14.0 min的上清，使用凍干機(Christ alpha 1-4LD Plus)干燥，然后重懸于50 mmol/L甘氨酸-HCl緩沖液(pH3.0)中，在37℃孵育5 d。取50 μl加入200 μl 2 μmol/L ThT溶液(50 mmol/L Tris，pH7.4)中，使用F-380熒光光譜儀(天津港東有限公司)獲得熒光光譜。ThT熒光發(fā)射波長為485 nm，激發(fā)波長為450 nm。每份樣本均測定4次。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 用GraphPad Prism8.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1乙腈沉淀血清中高分子量蛋白 AD患者及健康志愿者乙腈沉淀后上清液蛋白強度低于沉淀前(見圖1)，上清中保留了低分子量蛋白質(zhì)。

2.2利用HPLC技術(shù)分析血清中低分子量蛋白譜系 HPLC保留時間1.1 min AD患者(11.73±1.04)與健康志愿者蛋白譜強度(10.25±1.73)未見明顯差異(P>0.05)，在保留時間1.7 min，健康志愿者色譜峰強度(57.29±2.16)顯著高于AD患者(19.638±1.12，P<0.05)，而在11.3 min，AD患者色譜峰強度(119.31±2.75)顯著高于健康志愿者(44.84±1.84，P<0.05)。

2.3利用ThT測定AD患者血清上清淀粉樣變的熒光強度 保留時間10.0～14.0 min的AD患者血清上清ThT熒光強度顯著高于孵育前(P=0.000 4)，健康志愿者ThT熒光強度孵育前后無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

圖1 乙腈沉淀血清蛋白前后SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色

表1 ThT測定血清上清淀粉樣變的熒光強度

3 討 論

目前AD臨床檢驗共識項目是檢測淀粉樣變相關(guān)蛋白，而非病理性淀粉樣變纖維成分，建立液體活檢病理性淀粉樣變纖維的方法，將有利于臨床診斷。已經(jīng)有大量報道，熒光探針ThT能夠特異性與淀粉樣變纖維結(jié)合，其熒光強度能夠反映淀粉樣變水平〔7～9〕。另外，最近有研究報道，人血清白蛋白能夠抑制淀粉樣變形成〔10〕，在機體內(nèi)，這些血清高豐度蛋白干擾利用HPLC分析低豐度蛋白。

據(jù)研究報道，乙腈具有良好的降低血清球蛋白及清蛋白電荷特性〔11〕，可以降低血清中球蛋白比例，本實驗結(jié)果提示血清中高分子量蛋白得到沉淀，也減少了血清清蛋白及球蛋白的比例。

本研究結(jié)果說明AD患者血清中存在病理性淀粉樣變纖維成分；健康志愿者血清中不存在病理性淀粉樣變成分。HPLC對于蛋白成分具有良好的分離效果，結(jié)合一定濃度標(biāo)準(zhǔn)品，能夠進行定量分析。

綜上，本研究首次報道利用乙腈沉淀人血清高豐度蛋白，HPLC分離病理性相關(guān)淀粉樣變成分的分離條件，該方法為臨床輔助檢驗AD患者血清淀粉樣變纖維成分提供了一種方法。