三陰性乳腺癌患者新輔助化療前后MCM7基因表達(dá)及臨床意義

雷海

(德陽(yáng)市人民醫(yī)院乳腺外科，四川 德陽(yáng) 618000)

微小染色體維持蛋白(MCM)是廣泛存在的保守蛋白質(zhì)，對(duì)真核細(xì)胞復(fù)制作用明顯。MCM7是MCM 復(fù)合體之一，保證1個(gè)細(xì)胞周期中DNA復(fù)制1次〔1〕。MCM7功能異常可能會(huì)導(dǎo)致正常細(xì)胞增殖異常。MCM7基因會(huì)導(dǎo)致一些腫瘤的抑制因子表達(dá)，與肺癌、肝癌、乳腺癌等惡性腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)MCM7有少數(shù)報(bào)道，主要集中在免疫組化檢測(cè)方面。同時(shí)免疫組化和PCR兩種方法在乳腺癌新輔助化療前后變化的檢測(cè)仍未見有報(bào)道。目前研究認(rèn)為MCM7在乳腺癌的早期作用明顯，在乳腺癌的化療后表達(dá)如何仍未見有報(bào)道。MCM7蛋白及mRNA能否反映化療效果，是否有潛在的靶向治療意義仍沒有答案，尤其對(duì)于三陰性乳腺癌。

三陰乳腺癌分化差，內(nèi)分泌治療和人表皮生長(zhǎng)因子受體(HER)-2靶向治療效果差，治療手段單一，預(yù)后較差。三陰乳腺癌對(duì)化療較為敏感〔2,3〕。以前對(duì)乳腺癌新輔助化療(NAC)療效的評(píng)定僅限于以化療前后癥狀及體征來(lái)評(píng)定，很少有從乳腺癌分子機(jī)制對(duì)化療療效客觀評(píng)價(jià)的報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)三陰乳腺癌新輔助化療前后MCM7 水平的變化情況，分析其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 2014年1月至2017年12月德陽(yáng)市人民醫(yī)院乳腺科52例Ⅱ～Ⅲ期三陰性初治乳腺癌女性病人〔4〕。年齡為36～62歲，中位49歲。TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅱ期24例，Ⅲ期28例。血常規(guī)、肝腎功能檢查、心電圖均無(wú)明顯異常。全部患者確診前未接受過(guò)任何全身及局部治療，Karnofsky 評(píng)分均>90分。入組條件：①術(shù)前患者均行粗針穿刺病檢，確診乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌；②腫瘤大于3 cm，免疫組化雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和HER-2均為陰性，熒光原位雜交技術(shù)(FISH):無(wú)擴(kuò)增。 ③患者均為初治乳腺癌患者，無(wú)內(nèi)分泌治療及放療等任何治療。 ④患者化療前行肺部、肝臟等增強(qiáng)CT檢查和骨掃描檢查，無(wú)全身轉(zhuǎn)移。

1.2新輔助化療 52例患者術(shù)前NAC方案均采用TEC方案：第1天，予以多西他賽60 mg/m2(深圳萬(wàn)樂公司產(chǎn)品)，表柔比星 60 mg/m2(深圳萬(wàn)樂公司生產(chǎn))；第2天，環(huán)磷酰胺 500 mg/m2，21 d為1個(gè)周期。6個(gè)化療周期結(jié)束后行乳腺癌改良根治術(shù)。

1.3檢測(cè)項(xiàng)目及方法

1.3.1標(biāo)本及試劑 術(shù)前經(jīng)14G空心活檢針(BARD公司)穿刺組織及新輔助化療后術(shù)中切取的組織標(biāo)本作為檢測(cè)標(biāo)本。常規(guī)行組織的包埋石蠟、制片及組化檢測(cè)。

濃縮型兔抗人MCM7單抗(美國(guó)abcam公司)，稀釋濃度為1∶100。Trizol購(gòu)自中國(guó)的碧云天公司，試劑盒(逆轉(zhuǎn)錄)購(gòu)自Promega公司，熒光定量PCR試劑盒及引物合成均購(gòu)自大連生物公司。

1.3.2免疫組化檢測(cè) 免疫組織化學(xué)檢查采用S-P兩步法。 鼠抗人MCM7的單抗(濃縮型)購(gòu)自abcam公司。整個(gè)過(guò)程按說(shuō)明書進(jìn)行。用已有陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性的對(duì)照，陰性對(duì)照用磷酸鹽緩沖液(PBS)。 免疫組化參考Nishihara等〔5〕報(bào)道的標(biāo)準(zhǔn)，棕黃色細(xì)顆粒在細(xì)胞核內(nèi)為MCM7陽(yáng)性。隨機(jī)選取5個(gè)陽(yáng)性染色區(qū)利用Image J軟件對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞率檢測(cè)。使用Image J軟件檢測(cè)腫瘤組織平均的光密度，進(jìn)行MCM7水平測(cè)定半定量。

1.3.3熒光定量的逆轉(zhuǎn)錄酶鏈聚合反應(yīng)(RT-PCR) 組織勻漿：粉碎液氮后的標(biāo)本，每50～100 mg標(biāo)本加入1 ml TRIzol試劑，溶化勻漿。漿液常溫置5 min，充分解離核酸及蛋白。每1 ml TRIzol勻漿液中加入0.2 ml氯仿，劇烈搖震15 s后靜置2～3 min。4℃溫度下10 000r/min離心10 min。取上層(無(wú)色)移到另試管中，算所取水相量。加入等體積異丙醇(預(yù)冷)。靜置10 min，充分沉淀RNA。4℃ 10 000 r/min將其離心10 min。去清液，每管加1 ml 75%酒精去除殘存的異丙醇。4℃溫度7 500 r/min離心5 min。棄除上清液，沉淀干燥RNA。適量無(wú)核糖核酸酶(RNase)水溶解RNA沉淀。

盲選樣行預(yù)先實(shí)驗(yàn)，確定反應(yīng)條件。反轉(zhuǎn)錄和熒光PCR反應(yīng)：取1 μg RNA行cDNA合成，取5 倍緩沖液 4 μl、引物1 μl、10 mmol/L dNTP 2 μl、Rnasin 20 U、逆向M-MuIV逆轉(zhuǎn)錄酶(20 U/μl)1 μl，加焦碳酸二乙酯(DEPC)至20 μl，25℃ 10 min，42℃ 60 min，70℃ 10 min，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。熒光定量PCR體系25 μl中含SYBR Green Mix 12.5 μl。制定定量反應(yīng)溶解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線，以內(nèi)參GAPDH對(duì)MCM7 mRNA行定量檢測(cè)。熒光定量PCR擴(kuò)增條件的設(shè)置：94℃ 4 min；94℃ 20 min；60℃ 30 min；72℃ 30 min，循環(huán)35次，72℃時(shí)檢測(cè)信號(hào)。擬定閾值為產(chǎn)物所達(dá)到的循環(huán)圈數(shù)即Ct值(定量結(jié)果)。分析每例標(biāo)本的MCM7 mRNA表達(dá)水平。引物序列：MCM7F正義鏈：5'-TCCCTCGTAGTATCACGGTGC-3'，反義鏈：5'-ATGGGCTTCCAGGTAGGTTTC-3';(158 bp)；β-actin正義鏈：5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'。反義鏈：5'-ACCACAGCCTCGCTCACG-3'(205 bp)。

1.4結(jié)果判定 NAC后的病灶變化按世衛(wèi)組織(WHO)抗腫瘤藥物客觀療效評(píng)定〔4〕進(jìn)行。分別在NAC前及NAC后2個(gè)周期和4個(gè)周期及化療結(jié)束后由臨床及影像科的主治以上醫(yī)師根據(jù)病灶變化認(rèn)定效果。劃分完全的緩解(CR)，部分的緩解(PR)，穩(wěn)定狀態(tài)(SD)，進(jìn)展?fàn)顟B(tài)(PD)。CR+PR為臨床病灶總緩解率。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1病灶體積變化及組織學(xué)改變 新輔助化療后2個(gè)周期：40例患者的腫塊明顯縮小，CR 3例，PR 37例，總緩解率為76.9%(40/52)。PD 1例,立即行乳腺癌手術(shù)。新輔助化療后4個(gè)周期后43例患者的腫塊明顯縮小，CR 7例，PR 36例，總緩解率為87.8%(43/52)。新輔助化療結(jié)束后47例患者的腫塊縮小明顯，CR 12例，PR 35例，總緩解率90.4%(47/52)，SD 4例，PD 1例。

30例術(shù)后標(biāo)本肉眼顯示癌組織邊界較明顯，切面多為灰白色，砂礫樣。光鏡下可見部分腫瘤細(xì)胞有壞死變性現(xiàn)象，部分胞質(zhì)壞死凝固、細(xì)胞核皺縮。腫瘤區(qū)的管腔、血管變窄，有的甚至閉塞萎縮。鏡下可見MCM7蛋白主要在細(xì)胞核，很少表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)，呈顆粒狀。在癌旁正常組織未見表達(dá)。見圖1。

圖1 NAC前、后MCM7蛋白表達(dá)(S-P，×400)

2.2MCM7蛋白表達(dá) 新輔助化療后MCM7蛋白明顯表達(dá)低于化療前(P<0.05)。CR+PR組化療前MCM7蛋白表達(dá)比化療后高，有顯著差異(43.12±8.45 vs 21.87±6.17，P<0.05)，SD+PD組化療前MCM7蛋白表達(dá)高于化療后，但無(wú)顯著差異(43.45±6.25 vs 37.41±5.81，P>0.05)。

2.3MCM7 mRNA表達(dá) 新輔助化療前后MCM7 mRNA檢測(cè):52例患者新輔助化療前后乳腺癌標(biāo)本中的MCM7 mRNA表達(dá)分別為0.17±0.07和 0.12± 0.05?；熀驧CM7 mRNA的表達(dá)水平較化療前低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.062)。CR+PR組化療前MCM7 mRNA表達(dá)高于化療后，有顯著差異(0.175±0.06 vs 0.109±0.07;P<0.05)，SD+PD組化療前MCM7 mRNA表達(dá)高于化療后，但無(wú)顯著差異(0.164±0.05 vs 0.158±0.06；P>0.05)。

3 討 論

三陰乳腺癌是乳腺癌的亞型。研究表明，三陰乳腺癌對(duì)化療敏感性較其他亞型高〔3〕,新輔助化療在三陰乳腺癌治療中的效果更突出。三陰乳腺癌缺乏有效的分子治療靶點(diǎn)，同時(shí)也與缺乏評(píng)估其治療效果的特征性分子指標(biāo)。因此，找出能真正反映三陰性乳腺癌化療療效的分子指標(biāo)至關(guān)重要。

MCM7可以與其他MCM蛋白聚成多聚物，在調(diào)控DNA復(fù)制和延伸中有重要作用，同時(shí)與細(xì)胞周期的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增生、惡性腫瘤關(guān)系緊密〔6,7〕。此外MCM7蛋白還在一些抑癌及致癌信號(hào)通道中有關(guān)鍵作用，有研究提示MCM7蛋白在惡性腫瘤早期階段有重要作用〔8,9〕。研究〔10,11〕表明，MCM7蛋白在霍奇金淋巴瘤、肺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞中均呈高表達(dá)，是一種判斷癌細(xì)胞的生物學(xué)行為指標(biāo)。本研究中發(fā)現(xiàn)MCM7蛋白主要表達(dá)在乳腺癌細(xì)胞核中，在正常腺體細(xì)胞中較少表達(dá)。表明MCM7是乳腺癌的特異性表達(dá)蛋白，對(duì)乳腺癌診斷有價(jià)值。也表明其可能是乳腺癌潛在的基因治療靶點(diǎn)。研究表明〔12〕，MCM7在鼠、樹鼩、人的肝癌組織中蛋白表達(dá)明顯高于正常肝組織及癌旁中的表達(dá)水平，與本研究結(jié)果相同。

本研究免疫組化結(jié)果表明MCM7蛋白表達(dá)水平可成為簡(jiǎn)單有效判斷新輔助療效的病理指標(biāo)。MCM7 mRNA檢測(cè)和MCM7蛋白是相似的。表明MCM7蛋白能夠替代MCM7 mRNA的檢查反映MCM7基因的變化。Coli等〔13〕發(fā)現(xiàn)MCM7可為預(yù)測(cè)垂體腺癌復(fù)發(fā)及進(jìn)展獨(dú)立因素。Qu等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝癌的預(yù)后與MCM7表達(dá)有關(guān)；通過(guò)敲除MCM7基因功能可以顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，激活MAPK信號(hào)，上調(diào)CyclinD1表達(dá)，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)表明新輔助化療能明顯緩解三陰乳腺癌患者病情進(jìn)展，可能與抑制乳腺癌組織MCM7表達(dá)相關(guān)。MCM7對(duì)于判斷乳腺癌的浸潤(rùn)、預(yù)后及轉(zhuǎn)移意義重大，可能是乳腺癌的分級(jí)特異基因。

綜上所述，在乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中，MCM7蛋白的高表達(dá)和三陰乳腺癌的進(jìn)展相關(guān)密切，檢測(cè)MCM7蛋白和MCM7 mRNA可作為判斷新輔助化療效果的生物學(xué)指標(biāo)。MCM7蛋白可代替MCM7 mRNA反映MCM7基因的變化。由于MCM蛋白在三陰性乳腺癌細(xì)胞異常增殖調(diào)控中的重要作用，研究調(diào)控細(xì)胞MCM7蛋白表達(dá)有利于抗癌藥物的靶向研究。