鈣非依賴性磷脂酶A2在腎內(nèi)動(dòng)脈平滑肌收縮反應(yīng)中的作用

秦曉玥，李穗敏，曾 鵬，陳淑貞，王義蓉，鄺素娟，楊 慧，饒 芳,鄧春玉

[1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)醫(yī)學(xué)研究部臨床藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510080；3.華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006; 4.廣東省心血管病研究所心血管內(nèi)科，廣東 廣州 510080]

正常血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)通過(guò)細(xì)胞內(nèi)外鈣的交換和細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)的調(diào)節(jié)兩種方式來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。細(xì)胞膜主要通過(guò)L型鈣通道等電壓操縱性鈣通道，鈣庫(kù)操縱性鈣通道(store-operated calcium channels，SOC)和受體操縱的鈣通道控制細(xì)胞內(nèi)外Ca2+交換[1]。胞內(nèi)Ca2+是VSMCs重要的第二信使，參與VSMCs“興奮-收縮偶聯(lián)”與“興奮-轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)”過(guò)程，首先發(fā)揮“興奮-收縮偶聯(lián)”功能調(diào)節(jié)。常用的血管平滑肌收縮劑苯腎上腺素(phenyhrine，Phe)和5-羥色胺(5-hydroxy tryptamine，5-HT)分別與VSMCs膜上α、5-HT2A受體結(jié)合，通過(guò)與Gq蛋白結(jié)合而激活磷脂C(PLC)，使磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)水解為三磷酸肌醇(IP3)和二酰基甘油(DAG)，IP3與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上IP3受體結(jié)合誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+流入細(xì)胞質(zhì)中。同時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+耗竭，誘導(dǎo)SOC通道開(kāi)放，細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，稱為鈣庫(kù)操縱性鈣內(nèi)流(store-operated calcium entry, SOCE)[2]。此外，DAG還可以激活不依賴于肌漿網(wǎng)鈣釋放的花生四烯酸調(diào)控的鈣通道(arachidonate-regulated Ca2+，ARC)來(lái)增加細(xì)胞內(nèi)鈣濃度[3]。

SOC通道是廣泛存在于興奮性和非興奮性細(xì)胞中介導(dǎo)Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的重要通道，研究表明，許多疾病都與SOC異常有關(guān)，如SOCE的異常可增加血小板的黏附性并聚集，這可導(dǎo)致糖尿病的微血管和大血管病變的發(fā)生[4]；腎系膜細(xì)胞中SOC功能的下調(diào)，可抗腎臟纖維化等[5]。但是，腎內(nèi)動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞SOC通道的激活機(jī)制還需進(jìn)一步研究。已有報(bào)道SOC通道激活與鈣非依賴性磷脂酶A2(calcium-independent phospholipase A2，iPLA2)密切相關(guān)，有效的iPLA2不可逆抑制劑BEL可減少主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的SOC通道介導(dǎo)鈣內(nèi)流，抑制細(xì)胞增殖[6]。磷脂酶A2(PLA2)是一類水解磷脂酯鍵的酶，分解產(chǎn)生花生四烯酸(arachidonic acid，AA)和溶血磷脂等，iPLA2主要與膜相關(guān)，且已在心臟、小動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和腎臟中報(bào)道了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)iPLA2活性[7]。已有報(bào)道提出，PLA2除了可以調(diào)控SOC通道外，分解產(chǎn)生的微量AA還可以激活A(yù)RC通道[8]。然而，iPLA2在腎內(nèi)動(dòng)脈平滑肌鈣調(diào)控中的作用，有待進(jìn)一步闡明。本研究通過(guò)觀察BEL對(duì)腎內(nèi)動(dòng)脈血管張力的影響，探討iPLA2與腎內(nèi)動(dòng)脈平滑肌鈣調(diào)控的關(guān)系。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物18周齡SPF級(jí)C57BL/6小鼠，雄性，共30只，購(gòu)于廣東斯嘉景達(dá)生物科技有限公司，許可證號(hào)：SCXK(粵)2020-0052，飼養(yǎng)于華南理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已通過(guò)廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查(NoGDRE201208a)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物5-HT(091M5163V)、Phe(039K1453)、硝苯地平(nifedipine,57H1139)、毒胡蘿卜素(TG,049M4032V)、EGTA(111K5411)均購(gòu)于Sigma公司；Fluo-4AM(2298173)購(gòu)于賽默飛公司；AA(HY-109590)、BEL(HY-107411)購(gòu)于MCE公司；其余試劑皆為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)溶液Krebs Henseleit溶液(K-H溶液)(mmol·L-1)：NaCl 119、NaHCO325、 MgCl2·6H2O 1、KCl 4.7、KH2PO41.2、CaCl22.5、D glucose 11.1；高鉀K-H溶液(mmol·L-1)：KCl 60、NaCl 63.7、NaHCO325、MgCl2·6H2O 1、KH2PO41.2、CaCl22.5、D-glucose 11.1；Ca2+-free K-H溶液(mmol·L-1)：NaCl 119、NaHCO325、MgCl2·6H2O 1、KCl 4.7、KH2PO41.2、D-glucose 11.1、EGTA 0.05；Ca2+-free高鉀K-H溶液(mmol·L-1)：KCl 60、NaCl 63.7、NaHCO325、MgCl2·6H2O 1、KH2PO41.2、D-glucose 11.1、EGTA 0.05；含Ca2+臺(tái)式液(mmol·L-1)：NaCl 136、MgCl2·6H2O 1、KCl 5.4、NaH2PO4·2H2O 0.33、CaCl2·2H2O 1.0、HEPES 10.0、D glucose 10；張力實(shí)驗(yàn)所用溶液根據(jù)上述濃度配好后均通95% O2±5% CO2混合氣使其充分飽和，臺(tái)式液需用NaOH(3 mol·L-1)調(diào)至7.40。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器620M型小血管張力測(cè)定儀(丹麥，DMT公司)；PowerLab 8/30生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)(澳大利亞，AD公司)；Stemi DV4型體視顯微鏡(德國(guó)，ZEISS公司)；DK-8D型電熱恒溫水槽(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠)；Leica SP5-FCS激光共聚焦顯微鏡。

2 方法

2.1 小鼠離體腎內(nèi)動(dòng)脈血管環(huán)的制備離體腎內(nèi)動(dòng)脈血管環(huán)制備同已發(fā)表文獻(xiàn)[9-10]。頸椎脫臼法處死小鼠后，快速取出腎，放入4 ℃預(yù)冷并通混合氣的K-H溶液中，借助體視顯微鏡去除腎內(nèi)動(dòng)脈血管周?chē)钠渌M織，無(wú)損傷的分離出腎內(nèi)動(dòng)脈血管，剪成長(zhǎng)度為2.0 mm左右的血管環(huán)；用兩根直徑40 μm的不銹鋼絲先后穿過(guò)血管環(huán)，將其固定在張力測(cè)定儀浴槽內(nèi)的兩個(gè)鉗夾上，在穿入鋼絲的同時(shí)輕微摩擦去除內(nèi)皮，擰緊兩根鋼絲并使其處于平行狀態(tài)保證血管受力均勻。在恒溫37 ℃和持續(xù)通入混合氣的浴槽中固定好血管環(huán)，平衡30 min后，給予腎內(nèi)動(dòng)脈1.5 mN的基礎(chǔ)張力，每15 min置換溶液1次，并使基礎(chǔ)張力維持在1.5 mN，平衡60 min后加藥反應(yīng)。

2.2 血管反應(yīng)性及內(nèi)皮完整性測(cè)定血管張力反應(yīng)性檢測(cè)同已發(fā)表文獻(xiàn)[9,10]。待血管張力穩(wěn)定后，給予1.5 mN基礎(chǔ)張力，然后高鉀K-H溶液刺激，檢測(cè)血管反應(yīng)性。高鉀溶液刺激達(dá)到最大張力后，K-H溶液洗4次，使其恢復(fù)至基線，穩(wěn)定15 min后，調(diào)整基礎(chǔ)張力，再用高鉀K-H溶液置換K-H溶液，反復(fù)操作，直至連續(xù)兩次高鉀溶液刺激引起的血管張力值相差不超過(guò)10%，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。穩(wěn)定20 min后，加入血管收縮劑Phe(1 μmol·L-1)，血管收縮，待張力達(dá)最大值并趨于穩(wěn)定后加入血管舒張劑Ach(1 μmol·L-1)，若血管舒張程度在10%以內(nèi)，視為內(nèi)皮去除完全，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 實(shí)驗(yàn)藥物對(duì)離體腎內(nèi)動(dòng)脈血管張力變化的影響

2.3.1BEL對(duì)血管收縮劑誘導(dǎo)腎內(nèi)動(dòng)脈血管收縮反應(yīng)影響 對(duì)血管功能性檢測(cè)合格并檢測(cè)內(nèi)皮完整性的血管，采用濃度梯度給藥法，分別加入各濃度梯度的血管收縮劑5-HT(0.001～10 μmol·L-1)和Phe(0.001～10 μmol·L-1)，觀察血管張力的變化。當(dāng)血管收縮效應(yīng)達(dá)到最大值不再變化后，用K-H液洗脫4次，洗至基線穩(wěn)定后，加入溴烯醇內(nèi)酯(10 μmol·L-1)孵育30 min，重復(fù)上述5-HT和Phe濃度梯度給藥，觀察溴烯醇內(nèi)酯對(duì)血管收縮量效曲線的影響。

2.3.2BEL對(duì)L型鈣通道介導(dǎo)腎內(nèi)動(dòng)脈血管收縮反應(yīng)影響 另取血管功能性檢測(cè)合格并檢測(cè)內(nèi)皮完整性的血管，Ca2+-free高鉀K-H溶液洗脫至基線平衡，穩(wěn)定20 min加累計(jì)濃度CaCl2(0.001～5 mmol·L-1)，當(dāng)血管收縮反應(yīng)達(dá)到最大值不再變化后，用K-H液洗脫4次，洗至基線穩(wěn)定后，繼續(xù)用Ca2+-free高鉀K-H溶液洗至基線，加溴烯醇內(nèi)酯(10 μmol·L-1)孵育30 min，重復(fù)累計(jì)濃度CaCl2，觀察溴烯醇內(nèi)酯對(duì)L型鈣通道影響。

2.3.3BEL對(duì)肌漿網(wǎng)鈣釋放介導(dǎo)腎內(nèi)動(dòng)脈血管收縮反應(yīng)影響 另取功能檢測(cè)合格并檢測(cè)內(nèi)皮完整性的血管，在Ca2+-free K-H溶液洗脫后，加硝苯地平(1 μmol·L-1)孵育30 min，5-HT和Phe濃度梯度給藥，當(dāng)血管收縮反應(yīng)達(dá)到最大值不再變化后，用Ca2+-free K-H溶液洗脫4次，洗至基線穩(wěn)定后，加入硝苯地平(1 μmol·L-1)和溴烯醇內(nèi)酯(10 μmol·L-1)共同孵育30 min，重復(fù)上述5-HT和Phe濃度梯度給藥，觀察溴烯醇內(nèi)酯對(duì)血管收縮量效曲線的影響。

2.3.4BEL對(duì)SOC通道介導(dǎo)腎內(nèi)動(dòng)脈血管收縮反應(yīng)影響 另取血管功能性檢測(cè)合格并檢測(cè)內(nèi)皮完整性的血管，Phe(1 μmol·L-1)給藥達(dá)到最大濃度后，Ca2+-free K-H溶液洗脫至基線平衡，加硝苯地平(1 μmol·L-1)和TG(2 μmol·L-1)孵育30 min，加入CaCl2(2.5 mmol·L-1)，處理組加BEL(10 μmol·L-1)與硝苯地平和TG共同孵育，觀察BEL對(duì)SOC的影響。

2.4 激光共聚焦檢測(cè)BEL對(duì)平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度影響將來(lái)源于ATCC的人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞株均勻種在激光共聚焦專皿上，待其密度達(dá)80%左右，洗去培養(yǎng)基，PBS反復(fù)清洗，再重新給與1 mL培養(yǎng)基。避光下1 mL培養(yǎng)基中加入3 μL Fluo-4 AM(一種自身不發(fā)光，與Ca2+結(jié)合后顯熒光的螯合劑)，在暗處恒溫37 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min使熒光充分與細(xì)胞內(nèi)Ca2+結(jié)合。棄去含熒光染料培養(yǎng)基，臺(tái)式液洗滌，加入1 mL含鈣臺(tái)式液。加入硝苯地平(1 μmol·L-1)去除L型鈣通道影響，處理組加入BEL(10 μmol·L-1)共同孵育15 min。在激光共聚焦顯微鏡下找到細(xì)胞，設(shè)置熒光強(qiáng)度記錄模式，掃描6 min，掃描開(kāi)始后1 min左右加入AA(8 μmol·L-1)，觀察熒光變化情況。無(wú)熒光背景設(shè)為F0，細(xì)胞靜息狀態(tài)時(shí)熒光強(qiáng)度設(shè)置為F1，加入AA后最大熒光值記為F2，以(F2-F1)/(F1-F0)為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理同已發(fā)表文獻(xiàn)[9,10]。以最后兩次高鉀K-H溶液刺激張力值的均值為標(biāo)準(zhǔn)值，各藥物達(dá)穩(wěn)態(tài)的血管收縮張力值占標(biāo)準(zhǔn)值的百分?jǐn)?shù)即藥物引起血管收縮的大小。

3 結(jié)果

3.1 BEL抑制收縮劑誘導(dǎo)的小鼠腎內(nèi)動(dòng)脈血管張力使用累積濃度梯度法加入血管收縮劑5-HT(0.001～10 μmol·L-1)和Phe(0.001～10 μmol·L-1)，5-HT與Phe均可誘導(dǎo)小鼠腎內(nèi)動(dòng)脈血管呈濃度依賴性收縮，在達(dá)到最大濃度后洗脫至基線，待其穩(wěn)定后加入BEL(10 μmol·L-1)孵育，發(fā)現(xiàn)孵育BEL后的血管收縮劑5-HT和Phe誘導(dǎo)血管張力較對(duì)照組下降(P<0.01)。BEL孵育組對(duì)5-HT誘導(dǎo)腎內(nèi)動(dòng)脈量效曲線的Emax(85.43±13.30，n=12)明顯低于對(duì)照組(113.36±11.66，n=12)(P<0.01)，而pEC50在兩組間差異無(wú)顯著性(P>0.05)；BEL孵育組對(duì)Phe誘導(dǎo)腎內(nèi)動(dòng)脈量效曲線的pEC50(6.48±0.18，n=9)低于對(duì)照組(6.68±0.19，n=9)(P<0.05)，而Emax在兩組間差異無(wú)顯著性(P>0.05)。見(jiàn)Fig 1。

Fig 1 Effect of BEL on 5-HT and Phe-induced concentration-dependent vasoconstriction of intrarenal arterial rings in mice

3.2 BEL抑制L型鈣通道誘導(dǎo)的小鼠腎內(nèi)動(dòng)脈血管張力在Ca2+-free高鉀K-H溶液多次洗至基線平衡后，加入濃度梯度CaCl2(0.001-5 mmol·L-1)，發(fā)現(xiàn)CaCl2誘導(dǎo)血管呈濃度依賴性收縮。在達(dá)到最大濃度后洗脫至基線，待其穩(wěn)定后加入BEL(10 μmoL·L-1)孵育，與正常組對(duì)比，BEL孵育組對(duì)CaCl2誘導(dǎo)腎內(nèi)動(dòng)脈血管張力下降(P<0.01)。BEL孵育組對(duì)CaCl2誘導(dǎo)腎內(nèi)動(dòng)脈量效曲線的pEC50(3.16±0.13，n=6)低于對(duì)照組(3.39±0.16，n=7)(P<0.05)，而Emax差異無(wú)顯著性(P>0.05)。見(jiàn)Fig 2。

Fig 2 Effect of BEL on CaCl2 induced concentration-dependent vasoconstriction of intrarenal arteries in mice

3.3 BEL抑制肌漿網(wǎng)鈣釋放誘導(dǎo)的小鼠腎內(nèi)動(dòng)脈血管張力在Ca2+-free K-H溶液中加L型鈣通道阻斷劑硝苯地平(1 μmol·L-1)孵育后，采用濃度梯度法加入血管收縮劑5-HT(0.001～10 μmol·L-1)和Phe(0.001～10 μmol·L-1)，此時(shí)肌漿網(wǎng)鈣釋放誘導(dǎo)血管收縮，在達(dá)到最大濃度后洗脫至基線，待其穩(wěn)定后加入BEL(10 μmol·L-1)孵育，發(fā)現(xiàn)BEL孵育組與正常組對(duì)比，肌漿網(wǎng)鈣釋放誘導(dǎo)的濃度依賴性收縮明顯下降(P<0.01)，BEL孵育組對(duì)Phe誘導(dǎo)腎內(nèi)動(dòng)脈量效曲線的Emax和pEC50在兩組間差異均無(wú)顯著性(P>0.05)；BEL孵育組對(duì)5-HT誘導(dǎo)腎內(nèi)動(dòng)脈量效曲線的Emax(11.62±9.92，n=6)低于對(duì)照組(23.65±7.09，n=7)(P<0.05)，而pEC50在兩組間差異無(wú)顯著性(P>0.05)。見(jiàn)Fig 3。

Fig 3 Effects of BEL on 5-HT and Phe-induced sarcoplasmic reticulum calcium release-induced concentration-dependent vasoconstriction of intrarenal arterial rings in mice

3.4 BEL抑制SOC通道誘導(dǎo)的小鼠腎內(nèi)動(dòng)脈血管張力在Ca2+-free K-H溶液中加入L型通道阻斷劑硝苯地平(1 μmol·L-1)和誘導(dǎo)鈣庫(kù)釋放的TG(2 μmol·L-1)孵育后,再加入CaCl2(2.5 mmol·L-1)，此時(shí)SOC通道誘導(dǎo)腎內(nèi)動(dòng)脈血管收縮。在相同處理的另一組加BEL(10 μmol·L-1)孵育，與對(duì)照組相比，BEL孵育組SOC通道誘導(dǎo)血管收縮反應(yīng)低于正常組(n=8，P<0.05)。見(jiàn)Fig 4。

Fig 4 Effect of BEL on SOC channel-induced intrarenal artery vasoconstriction in mice

3.5 BEL抑制ARC通道誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流于含鈣臺(tái)式液中，在人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞株中加L型鈣通道阻斷劑硝苯地平(1 μmol·L-1)孵育，然后在激光共聚焦顯微鏡下觀察鈣離子熒光強(qiáng)度變化情況，在1 min左右加入AA(8 μmol·L-1)，熒光逐漸增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度上升。相同處理的另一組加BEL(10 μmol·L-1)孵育，發(fā)現(xiàn)BEL孵育后，與正常組相比，AA誘導(dǎo)的鈣離子熒光強(qiáng)度降低(ncontrol=44，nBEL=21，P<0.01)。見(jiàn)Fig 5。

Fig 5 Effect of BEL on calcium influx induced by ARC channels

4 討論

血管收縮劑與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合后，細(xì)胞內(nèi)鈣([Ca2+]i)增加，可與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，激活肌球蛋白輕鏈激酶，使肌球蛋白磷酸化，從而使平滑肌收縮[11]。[Ca2+]i增加的來(lái)源：細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入和細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放。細(xì)胞內(nèi)Ca2+主要是鈣庫(kù)Ca2+釋放，而L型鈣通道，SOC及ARC等通道開(kāi)放可使細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流。雖然大量研究已經(jīng)表明iPLA2被抑制后[Ca2+]i受到影響，但它的具體作用機(jī)制仍未知。

本研究發(fā)現(xiàn)BEL孵育后腎內(nèi)動(dòng)脈血管張力顯著降低，這表明BEL抑制血管收縮劑5-HT和Phe引起的腎內(nèi)動(dòng)脈血管平滑肌的收縮，已知鹵代烯醇內(nèi)酯與iPLA2的底物縮醛磷脂有結(jié)構(gòu)相似性，可與iPLA2共價(jià)結(jié)合并不可逆地抑制它，且對(duì)其他PLA2作用微弱，BEL在各種iPLA2報(bào)道中使用居多[8]，提示BEL可能通過(guò)抑制iPLA2的作用來(lái)抑制腎內(nèi)動(dòng)脈血管平滑肌收縮，如何抑制鈣通道影響[Ca2+]i增加，接下來(lái)進(jìn)行探討。

在課題組前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，L型鈣通道是細(xì)胞外鈣進(jìn)入的主要途徑，通過(guò)無(wú)鈣高鉀K-H溶液處理使血管張力基線平衡后，加入CaCl2，此時(shí)參與血管收縮的是L型鈣通道[12]。與對(duì)照組相比，BEL孵育組的血管張力稍微降低，這表明BEL對(duì)L型鈣通道也有一定的抑制作用。這與其他報(bào)道中，BEL可抑制KCl(60 mmol·L-1)誘導(dǎo)主動(dòng)脈血管環(huán)收縮結(jié)果一致，表明iPLA2參與L型鈣通道誘導(dǎo)血管收縮反應(yīng)[13]。

無(wú)鈣K-H溶液中加入硝苯地平阻斷L型鈣通道后，此時(shí)為肌漿網(wǎng)鈣釋放引起血管收縮。與對(duì)照組相比，BEL孵育后的肌漿網(wǎng)鈣釋放引起的血管張力明顯下降，提示BEL抑制肌漿網(wǎng)鈣釋放的功能，即iPLA2參與肌漿網(wǎng)鈣釋放作用。無(wú)鈣溶液中加入硝苯地平阻斷L型鈣通道，同時(shí)加入TG誘導(dǎo)鈣庫(kù)釋放，此時(shí)SOC通道打開(kāi)，細(xì)胞外鈣內(nèi)流，引起血管收縮。與對(duì)照組相比，BEL孵育后，SOC通道誘導(dǎo)的腎內(nèi)動(dòng)脈血管收縮反應(yīng)下降，表示BEL抑制SOC通道，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[14]，即iPLA2參與調(diào)控SOC通道，但報(bào)道顯示鈣庫(kù)釋放耗竭可激活iPLA2活性，從而激活SOC通道。我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在抑制iPLA2的活性后，鈣庫(kù)的鈣釋放功能下降，這表明iPLA2也參與調(diào)控鈣庫(kù)的鈣釋放作用。

由于直接使用AA刺激腎內(nèi)動(dòng)脈血管收縮反應(yīng)微弱，同時(shí)課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，雖然不同器官的平滑肌細(xì)胞具有不同的特征，但與冠脈平滑肌對(duì)Phe無(wú)反應(yīng)的現(xiàn)象相反，Phe可誘導(dǎo)大鼠和小鼠腎內(nèi)動(dòng)脈與主動(dòng)脈平滑肌收縮，后被證實(shí)大鼠和小鼠冠狀動(dòng)脈平滑肌的SOCE不介導(dǎo)血管收縮，在這一點(diǎn)上，我們認(rèn)為主動(dòng)脈平滑肌與腎內(nèi)動(dòng)脈平滑肌反應(yīng)具有相似性，故選用人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞探索ARC通道的作用[15]。在人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞株中，加入硝苯地平阻斷L型鈣通道作用后，在細(xì)胞外含鈣離子條件下加入AA，此時(shí)細(xì)胞熒光強(qiáng)度增加，表示細(xì)胞外鈣進(jìn)入胞內(nèi)，此時(shí)是AA激活的ARC通道介導(dǎo)細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流。在BEL孵育后，細(xì)胞的熒光增強(qiáng)，但與未加BEL組對(duì)比，其增強(qiáng)幅度明顯減弱，這表明BEL對(duì)ARC通道具有抑制作用，即iPLA2參與AA激活的不依賴鈣庫(kù)釋放的ARC通道作用。

綜上所述，本研究在腎內(nèi)動(dòng)脈平滑肌中較全面地探討了iPLA2對(duì)鈣調(diào)控作用，包括：SOC通道、L型鈣通道、肌漿網(wǎng)鈣釋放和ARC通道等。發(fā)現(xiàn)iPLA2被抑制后，肌漿網(wǎng)鈣釋放，SOC通道，ARC通道和L型鈣通道的作用均明顯減弱，從而使小鼠腎內(nèi)動(dòng)脈平滑肌收縮反應(yīng)降低。iPLA2的生理作用具有器官和組織特異性，與iPLA2在心臟、小動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和腎臟中報(bào)道的保護(hù)細(xì)胞免受氧化劑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡作用不同[7]，平滑肌中iPLA2與鈣調(diào)蛋白相連，在無(wú)催化活性狀態(tài)時(shí)，它與鈣和鈣調(diào)蛋白組成三元復(fù)合物[16]，被激活時(shí)參與平滑肌細(xì)胞收縮反應(yīng)，具體的機(jī)制有待在腎內(nèi)動(dòng)脈平滑肌中進(jìn)一步探討。