TRPV4-Nox2復(fù)合體對(duì)肥胖小鼠主動(dòng)脈舒張功能影響

高夢(mèng)茹, 韓 婧, 馬 鑫,

(江南大學(xué)1. 藥學(xué)院、2. 醫(yī)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

隨著人們生活方式現(xiàn)代化、膳食結(jié)構(gòu)改變以及缺少鍛煉等因素影響，肥胖已經(jīng)成為世界性的公共健康問(wèn)題。肥胖癥是一種慢性代謝性疾病，多數(shù)研究表明肥胖會(huì)引發(fā)氧化應(yīng)激[1]。以往的研究表明，氧化應(yīng)激常與內(nèi)皮功能紊亂相關(guān)，其特點(diǎn)是過(guò)量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生，導(dǎo)致一氧化氮生物利用度的降低，引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞收縮因子增加，進(jìn)而引發(fā)血管舒張功能障礙[2]。瞬時(shí)受體電位4型(transient receptor potential vanilloid type 4，TRPV4)是一種選擇性的陽(yáng)離子通道，可被多種因素激活，如溫度、機(jī)械力、化學(xué)激動(dòng)劑等[3]。最近，越來(lái)越多的證據(jù)表明，TRPV4在調(diào)節(jié)ROS產(chǎn)生和血管擴(kuò)張中起著重要作用[4]。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯氧化酶2(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，Nox2)，已被證明是ROS產(chǎn)生的重要調(diào)節(jié)器[5]，其他研究表明，Nox2在血管舒張功能中起著重要的調(diào)節(jié)作用[6]。TRPV4和Nox2均參與調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和血管舒張反應(yīng)，以往的研究也證明，TRPV4-Nox2能夠形成復(fù)合物起作用[7]，然而，探索TRPV4-Nox2復(fù)合體對(duì)肥胖引發(fā)的氧化應(yīng)激和血管舒張功能影響的研究較少，因而開(kāi)展了本研究，擬探討減弱TRPV4-Nox2的耦聯(lián)狀態(tài)是否能幫助改善肥胖引發(fā)的氧化應(yīng)激和血管舒張障礙，隨后以TRPV4-Nox2復(fù)合體為靶點(diǎn)進(jìn)行藥物篩選，擬尋找一種副作用更小靶向性更高的藥物，為肥胖相關(guān)并發(fā)癥的治療提供新思路和新策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡SPF級(jí)雄性C57 BL/6J小鼠(上海斯萊克公司)，飼養(yǎng)于江南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(倫理號(hào)：JN.No 20200515c0501230[061])，于無(wú)菌、通風(fēng)良好的環(huán)境進(jìn)行12 h晝夜交替飼養(yǎng)，小鼠飼養(yǎng)溫度在18 ℃～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。

1.1.2藥品與試劑 CM-H2DCFDA染料購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司(貨號(hào)C6827)，恩曲替尼(Entrectinib)購(gòu)自美國(guó)阿拉丁公司(貨號(hào)E302199-100 mg)，佛波酯(PMA)購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)sigma-aldrich公司(貨號(hào)P1585)，GSK1016790A購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)sigma-aldrich公司(貨號(hào)G0798)TRPV4抗體購(gòu)買(mǎi)自Alomone公司(貨號(hào)sc-130543)，Nox2抗體購(gòu)買(mǎi)自Santa-Cruz Biotech公司(貨號(hào)ACC-034)，F(xiàn)luo-4 AM購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司(貨號(hào)F14201)，腺相關(guān)病毒購(gòu)自和元生物有限公司(Flt1為內(nèi)皮細(xì)胞的啟動(dòng)子，幫助腺相關(guān)病毒靶向內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá))。

1.1.3儀器 Wire myograph 620 M(丹麥DMT公司)，激光共聚焦(德國(guó)蔡司公司)，凝膠成像儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)

1.2 方法

1.2.1模型建立及實(shí)驗(yàn)分組 將C57 BL/6J與敲除小鼠在檢疫間隔離1周，隨后隨機(jī)將這些小鼠分成兩組，放入飼養(yǎng)間飼養(yǎng)。飼養(yǎng)期間，一組小鼠喂正常飲食(含有25%脂肪)，另外一組小鼠喂食高脂飲食(含有45%脂肪)，期間每周定時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠體重，14周后，HFD組小鼠體重增長(zhǎng)未超過(guò)ND組體重20%的小鼠排除，其余進(jìn)行TC、LDL、HDL檢測(cè)，TC，LDL有明顯增加，HDL明顯減少說(shuō)明肥胖模型造模成功，否則排除。腺相關(guān)病毒小鼠模型構(gòu)建，取ND小鼠、HFD小鼠、TRPV4 KO-HFD小鼠，隨機(jī)分組，每組10只，實(shí)驗(yàn)組(Nox2 △3)：使用尾靜脈注射的方式向小鼠體內(nèi)注射AAV-Flt1 Nox2 △3病毒，用以減弱TRPV4-Nox2復(fù)合體耦聯(lián)強(qiáng)度；對(duì)照組(Vector)：使用尾靜脈注射的方式向小鼠體內(nèi)注射載體病毒。注射濃度根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)確定，注射后21 d，取主動(dòng)脈進(jìn)行免疫熒光觀察，共聚焦顯微鏡552 nm激發(fā)光能觀察到內(nèi)皮細(xì)胞有明顯紅光，說(shuō)明造模成功，否則排除。

1.2.2原代主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞分離與培養(yǎng) 取對(duì)照組與肥胖模型組小鼠，使用二氧化碳對(duì)小鼠進(jìn)行安樂(lè)死處理。打開(kāi)胸腔，快速分下主動(dòng)脈，使用無(wú)菌PBS清洗后，剪碎置于含胰酶(2 g·L-1)的PBS中，37 ℃水浴消化25 min，1 200～3 000 r·min-1離心5 min。收取沉淀，使用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基重懸種于6孔板中，2 h后更換培養(yǎng)基，此后5代內(nèi)可用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3血管張力試驗(yàn) 取小鼠的主動(dòng)脈血管，分割為2 mm長(zhǎng)度的小段，裝載到肌張力儀器的槽中，進(jìn)行平衡和復(fù)蘇處理，隨后進(jìn)行曲線記錄，待張力曲線穩(wěn)定后，加入1 μmol·L-1的去氧腎上腺素(phenylephrine，Phe)預(yù)收縮血管，隨后以濃度梯度的方式，加入乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)并觀察血管張力的變化。收集并處理數(shù)據(jù)，即可得到對(duì)照組與肥胖模型組小鼠的血管張力情況。

1.2.4免疫共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞種于玻片上，待長(zhǎng)至80%密度，固定30 min，通透10 min，隨后使用含有1% BSA的PBS對(duì)細(xì)胞進(jìn)行封閉。30 min后加入配置好的TRPV4與Nox2一抗，4 ℃過(guò)夜，隨后室溫孵育熒光二抗2 h。染色完成后，使用共聚焦顯微鏡進(jìn)行代表圖與FRET信號(hào)的采集。

1.2.5免疫共沉淀 冰上提取蛋白，向上清加入1/10體積Protein A+G瓊脂糖珠，在4 ℃下垂直旋轉(zhuǎn)混合30 min，去除非特異性結(jié)合蛋白。4 ℃，400g離心5 min，收集上清，使用BCA法測(cè)定蛋白濃度，稀釋蛋白至濃度相同后，根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)，向裂解液中加入相應(yīng)抗體，隨后4 ℃，垂直旋轉(zhuǎn)過(guò)夜混合。d2，向混合液中加入抗體量10倍體積的Protein A+G瓊脂糖珠，隨后繼續(xù)在4 ℃的條件下，使用垂直旋轉(zhuǎn)儀混合3 h。4 ℃，400g離心5 min，收集沉淀，使用PBS清洗3次后加入50 μL的2 × SDS loading buffer。渦旋混勻，煮沸樣品10 min，使用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)上清蛋白樣品。

1.2.6ROS檢測(cè) 分離原代主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，等待細(xì)胞生長(zhǎng)到80%密度后，將之種入共聚焦小皿。等待細(xì)胞生長(zhǎng)，待形態(tài)展開(kāi)后，使用NPSS清洗，隨后在避光的條件下染色15 min。運(yùn)用共聚焦顯微鏡采集圖像，采集時(shí)，共聚焦激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置成488 nm。拍攝完成后，使用共聚焦顯微鏡分析軟件分析熒光強(qiáng)度，使用對(duì)照組的熒光強(qiáng)度進(jìn)行歸一化處理，即可獲到處理組ROS的相對(duì)含量。

1.2.7細(xì)胞內(nèi)Ca2+檢測(cè) 向HEK-293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TRPV4質(zhì)粒，24 h后，使用恩曲替尼(10 μmol·L-1)預(yù)孵育30 min，NPSS清洗，隨后將5 μmol·L-1Fluo-4 染料與細(xì)胞共孵育30 min，清洗細(xì)胞去除多余染料，隨后使用激光共聚焦顯微鏡以488 nm激發(fā)光進(jìn)行信號(hào)收集，前30 s為基礎(chǔ)信號(hào)，30 s后加入TRPV4通道激動(dòng)劑GSK-1016790A(10 nmol·L-1)激活TRPV4通道，觀察鈣信號(hào)變化。

1.2.8Western blot實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)備SDS-PAGE膠，向小孔中加樣品，加樣完成后，在恒壓條件下，首先使用70 V的電壓進(jìn)行電泳30 min，隨后換成120 V電壓，電泳1～2 h。100 V，80 min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，隨后，加入5% BSA進(jìn)行封閉。1 h后，4 ℃孵育一抗過(guò)夜，接著室溫孵育二抗1 h，使用ECL顯色液進(jìn)行顯色，使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行代表圖采集。

2 結(jié)果

2.1 肥胖引發(fā)氧化應(yīng)激、血管舒張功能障礙，并增加TRPV4-Nox2復(fù)合體耦聯(lián)強(qiáng)度如Fig 1所示，與ND組相比，HFD組主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞ROS產(chǎn)生增加(P<0.05，F(xiàn)ig 1A-B)。HFD組主動(dòng)脈舒張與ND組相比，舒張功能減弱，最大舒張率明顯減少(P<0.05，F(xiàn)ig 1C-D)。通過(guò)FRET實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，HFD組TRPV4-Nox2復(fù)合體之間的物理相互作用強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(P<0.05，F(xiàn)ig 1E-F)。上述結(jié)果提示肥胖引發(fā)的TRPV4-Nox2復(fù)合體耦聯(lián)強(qiáng)度增加，或許是肥胖引發(fā)氧化應(yīng)激、血管舒張功能障礙的原因。

Fig 1 Obesity induced oxidative stress, vasodilatory dysfunction and enhanced physical association of TRPV4-Nox2 complex

2.2 減弱TRPV4-Nox2復(fù)合體耦聯(lián)強(qiáng)度可改善肥胖引發(fā)的氧化應(yīng)激及血管舒張功能障礙定點(diǎn)突變和免疫共振能量轉(zhuǎn)移結(jié)果顯示：Nox2上145-152號(hào)位的7個(gè)氨基酸是TRPV4和Nox2相互作用的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)(P<0.05，F(xiàn)ig 2A)，以此為基礎(chǔ)構(gòu)建的腺相關(guān)病毒(AAV-Flt1-Nox2 △3)可明顯減弱HFD組TRPV4與Nox2之間的物理相互作用(P<0.05，F(xiàn)ig 2B)；TRPV4 KO-HFD組小鼠，由于不存在TRPV4蛋白，該腺相關(guān)病毒不影響TRPV4-Nox2復(fù)合體物理耦聯(lián)(Fig 2C)。CM-H2DCFDA染色結(jié)果表明：在肥胖小鼠中減弱TRPV4-Nox2之間的物理相互作用，明顯減少了肥胖小鼠內(nèi)皮細(xì)胞中的ROS產(chǎn)生(P<0.05,Fig 2D)。血管張力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在肥胖小鼠中減弱TRPV4-Nox2之間的物理相互作用，可增加肥胖小鼠主動(dòng)脈血管對(duì)ACh的響應(yīng)，增加最大舒張率(P<0.05,Fig 2E)；而在敲除鼠中，上述改變不存在(Fig 2F和G)。這些結(jié)果提示減弱TRPV4-Nox2復(fù)合體物理相互作用強(qiáng)度，可幫助減輕肥胖引發(fā)的氧化應(yīng)激并恢復(fù)血管舒張功能障礙。

Fig 2 Decreasing association between TRPV4 and Nox2 improved obesity-induced oxidative stress and vasodilatory dysfunction

2.3 恩曲替尼不影響TRPV4和Nox2的表達(dá)與功能，僅減弱TRPV4-Nox2復(fù)合體耦聯(lián)強(qiáng)度之前的研究發(fā)現(xiàn)恩曲替尼是一種可降低TRPV4-Nox2復(fù)合體耦聯(lián)強(qiáng)度的藥物[8]，此處免疫共振能量轉(zhuǎn)移結(jié)果再次證明這一結(jié)論：與HFD組相比，恩曲替尼明顯減弱TRPV4-Nox2復(fù)合體物理相互作用(P<0.05,Fig 3A)。隨后，通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)恩曲替尼不影響TRPV4和Nox2的表達(dá)(Fig 3B和D)。在HEK-293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Nox2進(jìn)行CM-H2DCFDA染色實(shí)驗(yàn)，使用佛波酯(PMA)作為Nox2激動(dòng)劑，結(jié)果表明：Nox2激活明顯增加ROS產(chǎn)生，而使用恩曲替尼(10 μmol·L-1，30 min)處理不影響Nox2介導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，表明恩曲替尼不影響Nox2功能(Fig 3C)。使用轉(zhuǎn)染TRPV4的HEK 293進(jìn)行鈣內(nèi)流實(shí)驗(yàn)，使用GSK-1016790A作為T(mén)RPV4激動(dòng)劑，結(jié)果表明，恩曲替尼不影響TRPV4介導(dǎo)的鈣內(nèi)流，表明恩曲替尼不影響TRPV4功能(Fig 3E)。上述結(jié)果提示恩曲替尼針對(duì)肥胖產(chǎn)生的作用，是由減弱耦聯(lián)引起，而非改變了TRPV4和Nox2的表達(dá)和功能。

Fig 3 Entrectinib did not affect TRPV4 and Nox2 expression and function, but only decreased

2.4 恩曲替尼可改善肥胖引發(fā)的氧化應(yīng)激及血管舒張功能障礙CM-H2DCFDA染色結(jié)果表明：與HFD組相比，使用恩曲替尼預(yù)孵育明顯減少了肥胖小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中的ROS產(chǎn)生(*P<0.05，F(xiàn)ig 4A)；血管張力實(shí)驗(yàn)表明：恩曲替尼(10 μmol·L-1，30 min)預(yù)孵育后，明顯增強(qiáng)主動(dòng)脈血管對(duì)ACh的響應(yīng)，增加了最大舒張率(P<0.05，F(xiàn)ig 4B)。上述結(jié)果提示恩曲替尼可幫助改善肥胖引發(fā)的氧化應(yīng)激及血管舒張功能障礙，為肥胖并發(fā)癥的治療提供了新策略。

Fig 4 Entrectinib improved obesity-induced oxidative stress and vasodilatory dysfunction

3 討論

肥胖會(huì)引發(fā)慢性炎癥、代謝紊亂、氧化應(yīng)激等問(wèn)題，進(jìn)而引發(fā)內(nèi)皮功能障礙，破壞血管舒張功能[9]。以往的研究表明，TRPV4和Nox2是其中關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，然而，很少有人將TRPV4和Nox2作為整體進(jìn)行研究。本研究使用免疫共振能量轉(zhuǎn)移等技術(shù)，證明TRPV4-Nox2之間存在物理相互作用，這一結(jié)論與以往的研究一致[7]，同時(shí)，我們使用了肥胖模型小鼠，提供新的證據(jù)補(bǔ)充證明了肥胖會(huì)增加TRPV4-Nox2的物理相互作用。

ROS產(chǎn)生過(guò)量會(huì)引發(fā)內(nèi)皮功能紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致一系列的疾病，其中，血管擴(kuò)張功能障礙是引起廣泛關(guān)注的問(wèn)題之一。以往的研究表明，在正常血管中，內(nèi)皮依賴性舒張主要由3種血管擴(kuò)張劑[10]，一氧化氮[11]、前列環(huán)素[12]和內(nèi)皮衍生的超極化因子[13]介導(dǎo)，在不同的血管床中貢獻(xiàn)不同。在主動(dòng)脈血管中一氧化氮是主要舒張因子，而ROS的過(guò)量產(chǎn)生會(huì)影響一氧化氮的產(chǎn)生和利用度，破壞主動(dòng)脈舒張，因而本研究選取主動(dòng)脈血管進(jìn)行研究。我們發(fā)現(xiàn)肥胖引發(fā)氧化應(yīng)激并破壞主動(dòng)脈血管的舒張功能，這一結(jié)果與以往的發(fā)現(xiàn)一致[14-15]。此外，本研究還提供了新的證據(jù)證明，肥胖引發(fā)氧化應(yīng)激與主動(dòng)脈血管舒張功能障礙是由TRPV4-Nox2復(fù)合體物理耦聯(lián)強(qiáng)度增加引起的，減弱耦聯(lián)可以減少肥胖相關(guān)的ROS產(chǎn)生過(guò)量和血管舒張功能障礙。

TRPV4和Nox2在全身多處均有分布，使用藥物進(jìn)行系統(tǒng)性激活會(huì)引發(fā)多種副作用[16]，為減少副作用，本研究以TRPV4-Nox2復(fù)合體為靶點(diǎn)，進(jìn)行了藥物篩選，以復(fù)合體為靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)在于藥物靶向性的增加。以此為基礎(chǔ)，本研究另一重要發(fā)現(xiàn)是找到一種以TRPV4-Nox2復(fù)合體為靶點(diǎn)的藥物恩曲替尼，該藥物不影響TRPV4和Nox2的表達(dá)與功能，而僅減弱TRPV4和Nox2在肥胖條件下的過(guò)度耦聯(lián)，進(jìn)而減少肥胖小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中的ROS產(chǎn)生，幫助恢復(fù)主動(dòng)脈血管舒張功能。

綜上所述，在本項(xiàng)研究中，我們證明在肥胖小鼠中TRPV4-Nox2復(fù)合物的物理相互作用增強(qiáng)，并證明這種物理相互作用的增強(qiáng)是導(dǎo)致原代主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中ROS產(chǎn)生增加的原因，同時(shí)，我們首次提供了證據(jù)證明這種增強(qiáng)的物理相互作用是造成肥胖小鼠主動(dòng)脈血管舒張功能障礙的原因之一?；谶@些發(fā)現(xiàn)，我們確認(rèn)能靶向TRPV4-Nox2的藥物恩曲替尼，可幫助改善肥胖引發(fā)的氧化應(yīng)激與血管舒張功能障礙。這一研究為解釋肥胖相關(guān)病理問(wèn)題提供了新思路，同時(shí)為肥胖并發(fā)癥治療提供了新策略。