沒藥甾酮下調(diào)PXR/P-gp通路逆轉(zhuǎn)肝癌化療耐藥機(jī)制

夏黃帥，余卓倫，張其海，王 娟，許婉婷，徐宏彬,,3

(1．南京醫(yī)科大學(xué)上海十院臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 211166；2．南京中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院科教處，江蘇 南京 210017； 3. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院上海市第十人民醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200072)

肝癌是東亞國家發(fā)病率最高的癌癥之一，占所有癌癥的7%，而超過90%的原發(fā)性肝癌屬于肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[1]。在我國，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染，飲食攝入黃曲霉素和農(nóng)村地區(qū)飲用水污染是引發(fā)肝癌的高危因素[2]。HCC特點(diǎn)是高死亡率、高復(fù)發(fā)率、高轉(zhuǎn)移率和不良預(yù)后。常用化療藥物中包括5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)、鉑類抗腫瘤藥如順鉑(cisplatinum，DDP)[3]。5-FU是胸腺嘧啶合成酶抑制劑，通過錯(cuò)誤插入DNA和RNA，使胸腺嘧啶合成酶失活，從而抑制DNA的合成，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡[4]。DDP抗腫瘤的作用機(jī)制是與DNA單鏈或雙鏈交叉連接，導(dǎo)致DNA模板缺陷和DNA合成和復(fù)制終止[5]?；熓歉伟┚C合治療的手段之一，對部分患者有效，但由于化療藥物多藥耐藥(multi-drug resistance，MDR)的產(chǎn)生，其治療結(jié)果仍不理想[6-7]。

腫瘤細(xì)胞中多藥耐藥基因1(MDR1)的過度激活和其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp/ABCB1/MDR1)表達(dá)的顯著提高是腫瘤多藥耐藥產(chǎn)生的主要原因之一[6]；P-gp是一種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，利用ATP水解產(chǎn)生的能量將藥物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞膜；已知DDP、5-FU是P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)的底物[7-8]。孕烷X受體(pregnane X receptor，PXR)是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，一個(gè)控制藥物Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶表達(dá)的核內(nèi)受體。肝癌細(xì)胞中PXR激活后，誘導(dǎo)MDR1基因轉(zhuǎn)錄、增強(qiáng)P-gp表達(dá)，是肝癌化療產(chǎn)生獲得性多藥耐藥的重要機(jī)制[6, 9]。維拉帕米、環(huán)孢素等腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑由于毒副作用大，限制了其臨床應(yīng)用[10-11]，因此，從天然藥物中選取高效、低毒的單體化合物逆轉(zhuǎn)PXR/P-gp介導(dǎo)的肝癌耐藥，對改善肝癌化療療效具有重要意義。

沒藥是橄欖科植物地丁樹(CommiphoraMyrrhaEngl.)和哈地丁樹(CommiphoraMolmolEngl.)的干燥樹脂，沒藥甾酮(guggulsterone，GS)是從沒藥脂中分離出的植物甾醇，是沒藥主要活性成分，包含Z和E兩種同分異構(gòu)體(含量比約3/1)，其中Z構(gòu)型在抗腫瘤中發(fā)揮主要作用[12]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，沒藥甾酮通過調(diào)控P-gp表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)功能，能增強(qiáng)化療藥物對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用[13]。沒藥甾酮能否通過調(diào)控PXR/P-gp介導(dǎo)的肝癌多藥耐藥，改善其化療療效，目前尚未研究。本實(shí)驗(yàn)將對此進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞人源肝癌HepG2細(xì)胞，購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 藥物與試劑Z-沒藥甾酮(Z-guggulsterone，Z-GS，>98%，3134716)、順鉑(cisplatin，DDP, >99%，PHR1624)、5-氟尿嘧啶(fluorouracil，5-FU, 99.0%～101.0%, WXBC9054V)、利福平(rifampicin，RFP，≥97%, R3501)、酮康唑(ketoconazole，KTZ，≥98%，SLBR1290V)、二甲亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO，SHBM4129)、PI(protease inhibitor cocktail，P8340)、BSA(fetal calf serum，12003C) 、β-actin(IPSC1030)(美國sigma公司)；MEM(minimum essential medium，8119457)培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，12106C)、雙抗(青霉素、鏈霉素, A5955)、2.5%胰酶(trypsin, 1494079,美國Gibco公司)、PBS(GC19KA8119,上海生工公司)、CCK-8(Cell Counting Kit-8，PN534)(日本同仁化學(xué)科技有限公司)、Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡試劑盒(美國eBioscience公司, 225239-000)、BCA試劑盒(NA168202)(美國Thermo Fisher 公司)、SDS-PAGE上樣緩沖液(十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺，上海碧云天生物技術(shù)有限公司, 030620200610)、MDR1(美國Cell Signaling Technology公司, 2)、PXR(英國Abcam公司，GR3311698-2)、HRP-R(2311797)、HRP-M(1670013)(美國Jackson公司)、ECL化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒(S7017030)、qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox,H8001160,上海翊圣生物科技有限公司)；TRIzol(美國Invitrogen公司，235002)；PrimeScript RT regent Kit(AI51090A,日本TaKaRa公司)

1.3 儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱、Nanodrop 2000微量分光光度計(jì)(美國Thermo Fisher公司)；DMI 6000B倒置顯微鏡(德國Leica公司)；Synergy2多功能酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；ABI Q-DX熒光定量 PCR儀(美國ABI公司)；7900HT FAST Real-time PCR儀(德國Eppendorf公司);FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀(美國BD Bioscience公司)；AI600化學(xué)發(fā)光成像儀(美國通用公司)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與試劑配制人肝癌細(xì)胞株HepG2用含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的MEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度為37 ℃、5% CO2。細(xì)胞生長至密度為70%～80%時(shí)，用1×PBS清洗細(xì)胞，用0.25%胰酶(不含EDTA)于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化至鏡下觀察胞質(zhì)回縮，以1/4～1/3的比例傳代。各藥物用DMSO溶解成母液，使用時(shí)在MEM完全培養(yǎng)基中稀釋成所需濃度(最終DMSO<1‰)。

1.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞按6 000個(gè)/孔接種于96孔板中，每孔100 μL細(xì)胞懸液，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分為對照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組分別用Z-GS(1、3、10、30、100、200、400 μmol·L-1)單藥處理細(xì)胞24、48、72 h；DDP(1.562 5、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol·L-1)單藥、5-FU(0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20 mmol·L-1)單藥及聯(lián)合Z-GS(30 μmol·L-1)處理細(xì)胞24 h，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)4次。處理后每孔加入培養(yǎng)液體積10%的CCK-8試劑，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)反應(yīng)1.5 h，用酶標(biāo)儀檢測每孔450 nm處吸光度(A)，將每組吸光度求平均值，使用均值計(jì)算細(xì)胞存活率。存活率/%=(A對照組-A實(shí)驗(yàn)組)/(A對照組-A實(shí)驗(yàn)組) ×100%。

1.6 AnnexinⅤ-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡取對數(shù)生長期細(xì)胞，按2×104個(gè)/孔種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分為對照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組分別用DDP(6.25、12.5、25、50、100 μmol·L-1)單藥、5-FU(0.312 5、0.625、1.25、2.5、5 mmol·L-1)單藥及聯(lián)合Z-GS(30 μmol·L-1)處理24 h。收集各孔培養(yǎng)液中的懸浮細(xì)胞，用0.25%胰酶消化每孔貼壁細(xì)胞并用完全培養(yǎng)基終止消化后合并。用PBS清洗2次，加入100 μL Binding buffer和FITC標(biāo)記的Annexin-Ⅴ(20 mg·L-1)5 μL，室溫避光15 min，再加入PI(50 mg·L-1)5 μL，避光反應(yīng)5 min，加入400 μL Binding buffer，同時(shí)以不加Annexin-Ⅴ FITC/PI的一管作陰性對照。用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率，各組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。使用FACSDIVA軟件分析結(jié)果。

1.7 RT-qPCR法檢測mRNA表達(dá)取對數(shù)生長期細(xì)胞，按1.5×105個(gè)/孔接種于12孔板，每孔1 mL完全培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分為對照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組分別用不同濃度Z-GS(10、30、100、200 μmol·L-1)，DDP(50 μmol·L-1)、5-FU(2.5 mmol·L-1)單藥及聯(lián)用Z-GS(30 μmol·L-1)處理24 h。根據(jù)TRIzol Reagent說明書抽提總RNA，使用微量分光光度計(jì)測定RNA濃度和純度，A260/A280值均在1.8～2.0之間。根據(jù)PrimeScript RT reagent Kit說明書逆轉(zhuǎn)錄RNA，反應(yīng)條件為：37 ℃ 15min，85 ℃ 5s，cDNA儲存于-20 ℃。根據(jù)SYBR Green Master Mix (High Rox)說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)，qPCR反應(yīng)體系為10 μL，反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。引物序列如下：MDR1上游引物：5′-GGGAGCTTAACACCCGACTTA-3′,下游引物：5′-GCCAAAATCACAAGGGTTAGCTT-3′; GAPDH上游引物：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,下游引物:5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果以Ct值表示，目的基因MDR1相對于內(nèi)參基因GAPDH的表達(dá)量用2-ΔΔCt表示。

1.8 Western blot法檢測蛋白表達(dá)取對數(shù)生長期的細(xì)胞，3×105個(gè)/孔接種于6孔板，每孔2 mL完全培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分為對照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組分別用不同濃度Z-GS( 3、10、30 μmol·L-1)、DDP(25、50、100 μmol·L-1)單藥、5-FU(1.25、2.5、5 mmol·L-1)單藥、KTZ(40 μmol·L-1)和RFP(30 μmol·L-1)以及聯(lián)用Z-GS(30 μmol·L-1)處理24 h。使用含1%PI的2×loading冰上提取總蛋白，BCA法測定各組蛋白樣品濃度，加入SDS-PAGE并加熱10 min使蛋白變性。按每個(gè)樣品40 μg蛋白總量進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，待目的蛋白分離后于冰水浴條件下將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜，以5%BSA為封閉液室溫?fù)u床封閉1 h，將一抗用封閉液稀釋后(β-actin：1 ∶1 000、P-gp：1 ∶1 000、PXR：1 ∶200)，于4 ℃避光孵育過夜。次日用含0.1% Tween 20的PBST洗膜3次，每次10 min，二抗用封閉液稀釋后(HRP-R：1 ∶1 000、HRP-M:1 ∶1 000)，室溫避光孵育1 h，PBST洗膜3次，每次10 min。通過ECL化學(xué)發(fā)光法得到目的蛋白條帶，β-actin為內(nèi)參，圖像使用Image Studio分析。每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)5次。

2 結(jié)果

2.1 Z-GS顯著增強(qiáng)DDP和5-FU對HepG2增殖抑制作用與對照組相比，100、200、400 μmol·L-1Z-GS處理細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率分別為88.37%、79.46%、60.24%，明顯抑制HepG2細(xì)胞增殖(P<0.05，F(xiàn)ig 1A)；24 h Z-GS(≤30 μmol·L-1)對HepG2細(xì)胞增殖幾乎無影響(P>0.05)，所以選擇Z-GS(30 μmol·L-1)與化療藥物聯(lián)用進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol·L-1DDP單獨(dú)處理細(xì)胞24 h細(xì)胞存活率分別為97.18%、94.59%、81.11%、 70.79%、56.91%、40.95%、29.42%，與Z-GS(30 μmol·L-1)聯(lián)用后細(xì)胞存活率分別為83.93%、83.29%、74.65%、52.93%、36.52%、30.39%、26.77%；0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20 mmol·L-15-FU單獨(dú)處理細(xì)胞24 h細(xì)胞存活率分別為95.26%、92.54%、84.64%、79.16%、65.77%、43.31%、23.58%，與Z-GS(30 μmol·L-1)聯(lián)用后為88.90%、85.50%、77.78%、70.21%、54.49%、36.72%、17.67%。結(jié)果表明，與DDP、5-FU單藥組相比，聯(lián)用Z-GS(30 μmol·L-1) 明顯增強(qiáng)化療藥物對HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用(P<0.05,Fig 1C,D)。

2．2 Z-GS顯著增強(qiáng)DDP和5-FU對HepG2細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用與對照組相比，24 h Z-GS(30 μmol·L-1)對HepG2細(xì)胞凋亡幾乎無影響；DDP(12.5、25、50、100 μmol·L-1)處理HepG2細(xì)胞24 h后顯著促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡，與Z-GS(30 μmol·L-1) 聯(lián)用后，進(jìn)一步增加DDP對HepG2細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用，凋亡率分別由2.53%、3.27%、4.83%、8.93%、14.27%增加至4.6%、5.47%、10.17%、 16.97%、29.1%；與對照組相比，5-FU(2.5、5 mmol·L-1)明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡，與Z-GS(30 μmol·L-1) 聯(lián)用后，進(jìn)一步增加5-FU對HepG2細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用，凋亡率分別由0.73%、0.93%、1.07%、1.90%、3.33%增加至2.6%、3.8%、5.17%、9.63%、29.5%(P<0.05,Fig 2)。

Fig 2 Z-GS significantly increased DDP or 5-FU-induced apoptosis of HepG2 cells

2.3 Z-GS下調(diào)HepG2細(xì)胞中PXR和P-gp表達(dá)與對照組相比，3、10、30 μmol·L-1Z-GS處理HepG2細(xì)胞24 h后明顯降低HepG2細(xì)胞中PXR和P-gp蛋白表達(dá)，分別下調(diào)了17.81%、28.31%、47.18%和14.24%、31.44%、35.67%(P<0.05,Fig 3)；與對照組相比，DDP(25、50、100 μmol·L-1)明顯下調(diào)PXR和P-gp蛋白表達(dá)，且具有濃度依賴性，分別下調(diào)了14.90%、34.99%、38.02%和21.06%、36.81%、49.09%，Z-GS(30 μmol·L-1) 聯(lián)用增強(qiáng)DDP對PXR和P-gp蛋白表達(dá)的下調(diào)作用，進(jìn)一步下調(diào)了35.28%、28.87%、24.41%和19.13%、4.3%、19.18%(P<0.05,Fig 4)。與對照組相比，5-FU(1.25、2.5、5 mmol·L-1)明顯下調(diào)PXR蛋白表達(dá)，5-FU(2.5、5 mmol·L-1)明顯下調(diào)P-gp蛋白表達(dá),且具有濃度依賴性，分別下調(diào)了37.34%、43.80%、64.97%和39.30%、53.62%;Z-GS(30 μmol·L-1)聯(lián)用增強(qiáng)5-FU對PXR和P-gp蛋白表達(dá)的下調(diào)作用，進(jìn)一步下調(diào)了40.18%、31.47%、19.53%和46.30%、20.67%、14.68%(P<0.05,Fig 5)。

Fig 4 PXR and P-gp were down-regulated by DDP alone or combined with Z-GS for 24 h in HepG2 cells n=5)

Fig 5 PXR and P-gp were down-regulated by 5-FU alone or combined with Z-GS in HepG2 cells n=5)

2.4 Z-GS下調(diào)HepG2細(xì)胞中MDR1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平與對照組相比，30 μmol·L-1Z-GS明顯下調(diào)HepG2細(xì)胞中MDR1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，下調(diào)了30.22%；與對照組相比，50 μmol·L-1DDP明顯下調(diào)HepG2細(xì)胞中MDR1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，下調(diào)了52.81%，與30 μmol·L-1Z-GS聯(lián)用后，MDR1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)一步下調(diào)了10.02%；與對照組相比，2.5 mmol·L-15-FU明顯下調(diào)HepG2細(xì)胞中MDR1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，下調(diào)了16.91%，與30 μmol·L-1Z-GS聯(lián)用后MDR1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)一步下調(diào)了20.04%(P<0.05，F(xiàn)ig 6)。

Fig 6 Expression of MDR1 mRNA was suppressed by chemotherapeutic agents alone or combined with Z-GS in HepG2 cells n=3)

2.5 沒藥甾酮下調(diào)RFP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中PXR和P-gp表達(dá),進(jìn)一步增強(qiáng)KTZ對PXR和P-gp表達(dá)的抑制作用與對照組相比，30 μmol·L-1RFP明顯上調(diào)HepG2細(xì)胞中PXR、P-gp蛋白表達(dá)，分別增加36.86%、132.33%;與Z-GS(30 μmol·L-1)聯(lián)用后明顯下調(diào)了RFP誘導(dǎo)的PXR和P-gp蛋白表達(dá)，分別降低57.47%、53.04%；40 μmol·L-1KTZ明顯下調(diào)PXR、P-gp蛋白表達(dá)，分別減少51.77%、30.90%，與Z-GS(30 μmol·L-1)聯(lián)用后，進(jìn)一步下調(diào)KTZ抑制的PXR、P-gp蛋白表達(dá)，分別減少33.70%、41.00%(P<0.05,Fig 7)。

Fig 7 PXR and P-gp were regulated by RFP or KTZ alone or combined with Z-GS in HepG2 cells n=5)

3 討論

目前，原發(fā)性肝癌居我國常見惡性腫瘤第4位，腫瘤致死病因第2位[2]。臨床資料表明，肝切除術(shù)后5年復(fù)發(fā)率為60%～70%；全身治療和經(jīng)肝動(dòng)脈介入治療中使用的化療藥物耐藥問題也亟需解決[14]。近幾十年來，大量臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，中藥輔助治療腫瘤是一種安全、有效的途徑[8]。Z-GS是來源于中藥沒藥的主要活性成分，其可通過調(diào)控PI3K/AKT、 JAK/STAT和NF-κB等信號通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖[15]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，沒藥甾酮可通過抑制環(huán)氧酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)下調(diào)P-gp在人慢性髓源白血病細(xì)胞K562中表達(dá)，逆轉(zhuǎn)K562對伊馬替尼耐藥[16]；還可下調(diào)耐阿霉素乳腺癌細(xì)胞MCF-7中P-gp表達(dá)，增強(qiáng)阿霉素對耐藥細(xì)胞的增殖抑制作用[17]。

腫瘤多藥耐藥引起的化療失敗通常與腫瘤細(xì)胞中化療藥物濃度降低有關(guān)，而腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜上ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)子如P-gp/ABCB1/MDR1過表達(dá)是導(dǎo)致腫瘤多藥耐藥的重要因素[17]。P-gp表達(dá)受PXR調(diào)控，PXR 由N端DNA結(jié)合域(DNA binding domain，DBD)和C端配體結(jié)合域(ligand binging domain，LBD)組成，DBD有兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)和核定位序列(A/G)G(T/G)TCA，與靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合。PXR被激活前，和它的輔阻遏物結(jié)合并存在于細(xì)胞質(zhì)，和配體結(jié)合后，PXR構(gòu)象發(fā)生變化并且從與輔阻遏物的結(jié)合中游離出來，通過DBD的鋅指與視黃醇X受體(retinoid X receptor，RXR)結(jié)合形成異二聚體，使異二聚體穿過核孔進(jìn)入細(xì)胞核，這個(gè)過程中PXR還招募共激活物以和靶基因的啟動(dòng)子結(jié)合。PXR結(jié)合位點(diǎn)被MDR1基因上游增強(qiáng)子識別，然后開始MDR1基因轉(zhuǎn)錄[9]。本研究使用PXR誘導(dǎo)劑RFP和抑制劑KTZ初步證實(shí)了這一機(jī)制。

本研究結(jié)果表明，30μmol·L-1Z-GS對肝癌細(xì)胞HepG2無細(xì)胞毒作用，與化療藥物5-FU、DDP聯(lián)用，增強(qiáng)5-FU、DDP對HepG2細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用；進(jìn)一步研究表明，Z-GS下調(diào)PXR/MDR1 mRNA-P-gp通路活性，增強(qiáng)化療藥物抗肝癌作用。Z-GS有望改善DDP、5-FU臨床療效，具有與化療藥物聯(lián)合用于治療HCC的前景，本文將為體內(nèi)及臨床研究提供理論基礎(chǔ)。但沒藥甾酮是否對其他肝癌細(xì)胞系也有相似作用需進(jìn)一步研究；沒藥甾酮是如何調(diào)控肝癌細(xì)胞中PXR/P-gp通路活性，尚需深入研究；同時(shí)，沒藥甾酮是否通過其他調(diào)控機(jī)制下調(diào)肝癌細(xì)胞中MDR1基因轉(zhuǎn)錄和P-gp表達(dá)也需進(jìn)一步探索。