肉桂醛調(diào)控CD44s/STAT3信號通路抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和腫瘤細(xì)胞干性

朱素麗，陳運(yùn)昊，姚尖平，周興旺

(中山大學(xué) 1.中山醫(yī)學(xué)院生化與分子生物學(xué)教研室、 2.附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科、 3.附屬第一醫(yī)院心外科， 廣東 廣州 510080)

胰腺癌(pancreatic cancer，PC)惡性程度高，預(yù)后極差，具有發(fā)病隱匿、早期診斷困難、進(jìn)展快、轉(zhuǎn)移早等特點(diǎn)，5年整體生存率不到10%[1]。2020年的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表明，胰腺癌全球范圍內(nèi)的發(fā)病人數(shù)為49.6萬，而死亡人數(shù)就已經(jīng)達(dá)到46.6萬，幾乎與發(fā)病人數(shù)相當(dāng)，已經(jīng)成為癌癥死亡的第7大原因[2]。目前，手術(shù)切除是唯一可能的治愈手段，但僅20%的患者可接受手術(shù)，且超過80%的患者術(shù)后復(fù)發(fā)。大部分患者發(fā)現(xiàn)病情時已發(fā)生轉(zhuǎn)移，而對于晚期患者，主要采取的是全身化療聯(lián)合方案，但這也僅將患者的生存期延長6～12個月[3]。已有許多研究表明，腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)是導(dǎo)致PC易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和易耐藥的重要原因[4]。因此，研究發(fā)展不僅能夠抑制普通胰腺癌細(xì)胞，更能有效抑制胰腺癌干細(xì)胞的新治療策略至關(guān)重要。

肉桂醛(cinnamaldehyde，CA)是主要來源于樟科植物肉桂的一種醛類化合物，為黏稠狀黃色液體，自然界存在的肉桂醛均為反式結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)有研究表明，肉桂醛具有防治糖尿病、抑菌、抗病毒、抗癌等多種藥理活性，尤其是在抗結(jié)直腸癌方面，具有抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等作用[5]，被認(rèn)為是一種具有抗癌活性的天然分子。然而CA是否也能抑制胰腺癌生長尚不清楚。

CD44作為細(xì)胞外成分的重要受體，廣泛參與腫瘤細(xì)胞黏附、增殖、遷移等過程，在胰腺癌中，CD44的標(biāo)準(zhǔn)亞型即CD44s與腫瘤細(xì)胞干性密切相關(guān)，CD44s高表達(dá)被認(rèn)為具有促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的作用，可作為胰腺癌細(xì)胞干性標(biāo)志物[6]。轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞生長和存活方面至關(guān)重要，CD44s可激活STAT3的磷酸化，維持腫瘤干細(xì)胞自我更新和多向分化潛能，因此，抑制CD44s/STAT3信號通路是抑制胰腺癌生長和干性的途徑之一[7]。本研究首次發(fā)現(xiàn)肉桂醛可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞PANC-1的生長增殖，在此基礎(chǔ)上還研究了其對胰腺癌細(xì)胞干性的抑制作用，以及對相關(guān)的CD44s/STAT3信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 胰腺癌細(xì)胞PANC-1購自 American Type Culture Collection(ATCC)。

1.1.2藥物與試劑 反式肉桂醛，購于上海源葉生物有限公司(批號H02M6Q1，檢測純度≥99%)；高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶及青霉素-鏈霉素購于美國Thermo 公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8試劑)購于日本同仁研究所(Dojindo)；1%結(jié)晶紫(批號V5265)、DMSO(批號D2650)購于美國Sigma公司；CFSE染色試劑盒(批號C34554)購于美國Invitrogen；EGF(批號78016)、b-FGF(批號78003.1)、B27(批號05711)、ALDEFLUORTMKit(批號01700)以及DMEM/F12干細(xì)胞培養(yǎng)基(批號36254)購于加拿大干細(xì)胞技術(shù)有限公司(STEMCELL Technologies)；PrimeScriptTMRT Master Mix(批號RR036A)和TB GreenTMPremix Ex TaqTM(批號RR420A)購于日本TaKaRa；流式抗體APC-CD24和PE-CD44購于北京BioLegend生物科技有限公司；一抗抗體Nanog(批號4903)、Sox-2(批號3579)、Oct-4(批號2750)、GAPDH(批號5174)、p-STAT3(批號9145)、STAT3(批號9139)及CD44s(批號3540)均購于美國Cell Signaling Technology(CST)，山羊抗鼠二抗(批號SA00001-2)和山羊抗兔二抗(批號SA00001-1)購于中國Proteintech；STAT3激活劑Colivelin TFA(批號HY-P1061A)購于美國MedChemExpress生物科技公司。

1.1.3儀器 CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo)；酶標(biāo)儀(瑞士TECAN)；圖像掃描機(jī)分析軟件(美國Bio-Rad)；研究級倒置熒光顯微鏡(德國Leica)；10色分析型流式細(xì)胞儀(美國Beckman)；超微量紫外、可見光分光光度計(jì)(美國Thermo)；實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)(美國Bio-Rad)；Western blot電泳儀器、轉(zhuǎn)印槽及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 胰腺癌細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS、1×105U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，每隔2～3 d傳代一次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2CCK-8法檢測細(xì)胞存活率 將對數(shù)生長期的PANC-1細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為6×107個·L-1，接種于96孔板，每孔100 μL(6 000個細(xì)胞/孔)，d 2待細(xì)胞貼壁后，用遞增濃度的CA(0、5、15、20、30、50、70、100、150 μmol·L-1)進(jìn)行處理，每個藥物濃度設(shè)置3個復(fù)孔，分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48或72 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育45～60 min，使用酶標(biāo)儀在450 nm 處測量吸光度(OD)值；分別計(jì)算3個時間段的細(xì)胞生長抑制率，生長抑制率/%=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.2.3CFSE染色實(shí)驗(yàn) 將對數(shù)生長期的PANC-1細(xì)胞消化收集，加入Cell TraceTMCFSE染料(5 μmol·L-1)，37 ℃避光孵育15 min，加入完全培養(yǎng)液中和5 min，離心收集染色細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，流式收集分析數(shù)據(jù)。

1.2.4克隆形成實(shí)驗(yàn) 將對數(shù)生長期的PANC-1細(xì)胞制備成濃度為4×105個·L-1的單細(xì)胞懸液，均勻的接種于6孔板中，每孔加入2 mL(800個細(xì)胞/孔)，設(shè)置空白溶劑對照組、CA低濃度組(8 μmol·L-1)及CA高濃度組(16 μmol·L-1)；處理48 h后將培養(yǎng)基更換為無藥物的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)10 d后，甲醇固定15 min，0.5% 結(jié)晶紫染色，風(fēng)干后拍照并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5干細(xì)胞懸浮成球?qū)嶒?yàn) 制備含有EGF(20 μg·L-1)、bFGF(20 μg·L-1)、B27(10 μg·L-1)的DME:F12干細(xì)胞培養(yǎng)液，分別用含有指定濃度CA(0、8、16 μmol·L-1)的干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將濃度調(diào)整為2.5×106個·L-1，接種于超低黏附6孔板，每孔2 ml(5 000個細(xì)胞/孔)，每組設(shè)置3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)7 d后，使用倒置顯微鏡對單個球體進(jìn)行拍照、計(jì)算球體數(shù)目并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6實(shí)時熒光定量PCR檢測干性基因表達(dá) 將對數(shù)生長期的PANC-1細(xì)胞接種于6孔板，貼壁后用指定濃度的CA(0、8、16 μmol·L-1)處理48 h，隨后每孔加入1 mL TRIzol 試劑，提取細(xì)胞總RNA，使用超微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行純度檢測及含量測量、瓊脂糖電泳確定RNA完整性，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，具體操作根據(jù)PrimeScriptTMRT Master Mix和TB GreenTMPremix Ex TaqTM的試劑盒說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)相對定量方法進(jìn)行分析，計(jì)算2-ΔΔCt值，比較藥物處理組與空白溶劑組之間檢測基因的表達(dá)差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測CD44+CD24+細(xì)胞比例 將對數(shù)生長期的PANC-1細(xì)胞接種于6孔板，貼壁后加入指定濃度的CA處理48 h，胰酶消化，用4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌兩次，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個/100 μL后，將APC anti-human CD24抗體和PE anti-human CD44抗體以1 ∶40的比例加入100 μL細(xì)胞懸液中，4 ℃避光染色45 min，離心去上清，預(yù)冷PBS洗滌兩次，流式上機(jī)檢測CD44+CD24+亞群比例，用Flow Jo軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.8流式細(xì)胞術(shù)檢測ALDH+細(xì)胞比例 將經(jīng)不同處理后的PANC-1細(xì)胞收集，4 ℃預(yù)冷PBS洗滌兩次，預(yù)先將5 μL DEAB加入至陰性對照管中，用ALDEFLUORTMAssay Buffer調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109個·L-1，隨后添加5 μL活化的ALDEFLUORTM至1 mL細(xì)胞懸液中，混合并立即將0.5 mL混合物轉(zhuǎn)移到陰性對照管，避光孵育30 min，離心去上清，流式上機(jī)檢測ALDH+比例并做統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.9Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 使用指定濃度的CA處理PANC-1細(xì)胞48 h，加入適量含蛋白酶、磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液(50 mmol·L-1Tris-HCl, pH 7.6, 150 mmol·L-1NaCl, 0.1% SDS, 1% NP-40)，置于冰上震蕩裂解20 min后，4 ℃、1 2000 r·min-1離心15 min，取上清，用BCA試劑盒對蛋白濃度進(jìn)行檢測，加入蛋白緩沖液，100 ℃加熱變性10 min。蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，隨后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h，對應(yīng)一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，HRP標(biāo)記山羊抗兔/鼠二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，加入ECL發(fā)光液在化學(xué)發(fā)光儀上進(jìn)行顯色，采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8檢測CA對胰腺癌細(xì)胞存活率的影響CA結(jié)構(gòu)式如Fig 1A所示，用遞增濃度的CA分別處理PANC-1胰腺癌細(xì)胞24、48及72 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)束點(diǎn)加入CCK-8試劑對細(xì)胞存活率進(jìn)行檢測。如Fig 1B所示，CA可明顯降低PANC-1細(xì)胞的存活率，作用呈濃度和時間依賴性，其中CA處理下PANC-1細(xì)胞對應(yīng)的IC50值在24 h為114.67±6.21 μmol·L-1、在48 h為16.57±1.10 μmol·L-1、在72 h為12.77±0.12 μmol·L-1。

Fig 1 Effects of CA on cell viability of pancreatic cancer PANC-1 cells n=3)

2.2 CA抑制胰腺癌PANC-1細(xì)胞的增殖能力CFSE是一種可對活細(xì)胞染色的熒光染料，其熒光強(qiáng)度會隨著細(xì)胞增殖而逐級遞減。如Fig 2所示，與空白對照相比，CA處理后，細(xì)胞的熒光強(qiáng)度明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明CA可明顯抑制PANC-1細(xì)胞的增殖能力。

Fig 2 Effects of CA on proliferation of pancreatic cancer PANC-1 cells n=3)

2.3 CA抑制PANC-1癌細(xì)胞的克隆形成能力為了進(jìn)一步探究CA對單個胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響，采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。用CA(0、8、16 μmol·L-1)處理細(xì)胞48 h后，繼續(xù)用無藥物培養(yǎng)基培養(yǎng)至克隆長到肉眼可見大小，固定染色。如Fig 3所示，CA呈劑量依賴性使克隆體積變小，數(shù)量變少，在高濃度藥物處理組(16 μmol·L-1)，細(xì)胞的克隆形成能力幾乎被完全抑制。

Fig 3 Effects of CA on colony formation of

2.4 CA抑制胰腺癌PANC-1細(xì)胞的干細(xì)胞成球能力干細(xì)胞懸浮成球能力是反映腫瘤干性的一項(xiàng)重要指標(biāo)，腫瘤干細(xì)胞可耐受無血清培養(yǎng)基環(huán)境，而普通的腫瘤細(xì)胞在此環(huán)境中逐漸死亡，單個的腫瘤干細(xì)胞繼續(xù)生長形成干細(xì)胞球。如Fig 4所示，CA可明顯抑制胰腺癌細(xì)胞在無血清懸浮培養(yǎng)體系中的成球能力，使球體體積減小，數(shù)量變少。

Fig 4 Effects of CA on sphere-forming ability in suspension culture of PANC-1 cells n=3)

2.5 CA抑制胰腺癌腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)水平用指定濃度的CA處理PANC-1細(xì)胞48 h后，分別提取總RNA和總蛋白對干性相關(guān)基因Nanog、Sox-2及Oct-4的表達(dá)水平變化進(jìn)行檢測分析。如Fig 5A所示，在qRT-PCR結(jié)果中，與空白對照組相比，CA可呈濃度依賴性的抑制3種腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因的mRNA表達(dá)，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同樣，Western blot結(jié)果也表明，CA在蛋白水平對干性基因的顯著抑制作用(Fig 5B)。

Fig 5 Effects of CA on stemness-related gene expression in PANC-1 cells n=3)

2.6 CA減少PANC-1癌細(xì)胞的CD44+CD24+干細(xì)胞亞群比例CD44+CD24+亞群是胰腺癌干細(xì)胞亞群之一，具有胰腺癌干細(xì)胞特性。用不同濃度的CA作用PANC-1細(xì)胞48 h后，對細(xì)胞進(jìn)行CD44和CD24抗體染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD44+CD24+比例。如Fig 6所示，CA處理可減少細(xì)胞中的CD44+CD24+比例，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

Fig 6 Effects of CA on CD44+CD24+proportion in PANC-1 cells n=3)

2.7 CA減少PANC-1癌細(xì)胞的ALDH+干細(xì)胞亞群比例ALDH+亞群是另一重要的胰腺癌干細(xì)胞亞群。如Fig 7所示，CA作用48 h后，PANC-1的ALDH+細(xì)胞比例明顯下降，且效果隨濃度的升高進(jìn)一步加強(qiáng)。

Fig 7 Effect of CA on ALDH+ proportion

2.8 CA對PANC-1癌細(xì)胞CD44s/STAT3通路的影響CD44是胰腺癌細(xì)胞干性相關(guān)的表面標(biāo)志物之一，其中CD44s亞型與胰腺癌細(xì)胞干性功能密切相關(guān)，可使下游的信號分子STAT3磷酸化激活。如Fig 8A所示，CA可抑制CD44s的表達(dá)，同時，STAT3的磷酸化激活被抑制，而總STAT3表達(dá)幾無變化；進(jìn)一步采用STAT3激動劑Colivelin進(jìn)行回復(fù)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)當(dāng)STAT3磷酸化增強(qiáng)后(Fig 8B)，CA的抑制作用被部分回復(fù)(Fig 8C、D)，提示CA可能通過調(diào)控CD44s/STAT3通路抑制PANC-1細(xì)胞的增殖和腫瘤細(xì)胞干性。

Fig 8 Pancreatic PANC-1 cell proliferation and stemness affected by CA via CD44s/STAT3 pathway n=3)

3 討論

胰腺癌惡性程度高，預(yù)后極差，目前主要靠手術(shù)或化療控制癌癥進(jìn)展，但由于發(fā)病隱匿，轉(zhuǎn)移早，多數(shù)病人發(fā)現(xiàn)時已失去手術(shù)機(jī)會，只能采用全身治療方案：5-氟尿嘧啶、葉酸、伊立替康和奧沙利鉑四聯(lián)方案(FOLFIRINOX)或吉西他濱聯(lián)用紫杉醇[8]；然而，這些治療手段并未改變胰腺癌易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、易耐藥的治療困境，也未能有效延長病人的生存時間，因此，研究發(fā)展新的安全有效的治療策略非常重要。胰腺癌的發(fā)生發(fā)展非常復(fù)雜，一些癌癥相關(guān)基因的改變會對胰腺癌進(jìn)程產(chǎn)生影響，其中Kras是在胰腺癌中突變非常普遍的原癌基因，在早期就已出現(xiàn)，且參與胰腺癌生長、分化及轉(zhuǎn)移過程[9]，因此我們選擇了攜帶Kras突變的胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1進(jìn)行了研究。

從天然產(chǎn)物中挖掘活性成分是現(xiàn)代新藥研發(fā)的重要途徑之一。CA是主要來源于肉桂的天然產(chǎn)物，目前已被證明具有較為廣泛的抗腫瘤作用，主要是通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘發(fā)凋亡發(fā)揮抗腫瘤效果，天然分子抑制細(xì)胞增殖是經(jīng)典的抗胰腺癌研究方向之一[10]。已有研究表明，CA可通過PI3K/AKT通路抑制腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腸癌細(xì)胞凋亡[11]；還可以通過Wnt/β-catenin通路誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌發(fā)生凋亡，逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[12]。然而CA在胰腺癌的研究尚未見有研究報道。

本文首先通過CCK-8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CA對PANC-1胰腺癌細(xì)胞存活率有顯著影響，并進(jìn)而通過CFSE細(xì)胞增殖熒光染色實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了CA顯著抑制PANC-1癌細(xì)胞的增殖，此外，克隆形成實(shí)驗(yàn)可反映癌細(xì)胞群體依賴性和增殖能力兩個重要特性，我們的結(jié)果表明CA還可顯著抑制PANC-1癌細(xì)胞的克隆形成能力。說明天然產(chǎn)物CA可抑制胰腺癌細(xì)胞PANC-1的生長增殖。

腫瘤干細(xì)胞(CSCs)是腫瘤中占比非常小的一個亞群，1997年首次在急性白血病中發(fā)現(xiàn)[13]，隨后在越來越多的腫瘤中被證實(shí)，胰腺癌干細(xì)胞(pancreatic cancer stem cells，PCSCs)在2007年被分離證實(shí)，研究者發(fā)現(xiàn)與普通腫瘤細(xì)胞相比，PCSCs具有更強(qiáng)的致瘤性、無限增殖能力及多向分化潛能，因此不易被清除，被認(rèn)為是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、耐藥及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的重要原因之一[14]。現(xiàn)階段針對PCSCs的研究主要是通過靶向PCSCs的表面標(biāo)志物、靶向PCSCs的調(diào)控通路或誘導(dǎo)PCSCs分化來抑制PCSCs的生長，如采用單克隆抗體與表面標(biāo)志物的結(jié)合來達(dá)到抗胰腺癌作用的CD44單抗；使用mTOR通路抑制劑雷帕霉素、SHH通路抑制劑聯(lián)用吉西他濱也可有效抑制清除PCSCs，改善腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和耐藥[15]。然而臨床上胰腺癌治療目前仍缺乏針對PCSCs的安全有效藥物，不僅如此，已有多項(xiàng)研究表明，臨床使用的胰腺癌一線治療藥物吉西他濱還會增強(qiáng)胰腺癌的干性造成耐藥[16]，因此，研究發(fā)展能夠抑制PCSCs的新治療方略至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)CA可抑制PANC-1胰腺癌干細(xì)胞的懸浮成球能力，可顯著抑制胰腺癌干細(xì)胞干性相關(guān)的3種基因Nanog、Sox-2及Oct-4的表達(dá)水平；此外，通過流式檢測細(xì)胞中2種不同的干細(xì)胞亞群(CD44+CD24+細(xì)胞和ALDH+細(xì)胞)比例，還發(fā)現(xiàn)CA可呈濃度依賴性的減少胰腺癌細(xì)胞的干細(xì)胞比例，上述結(jié)果都表明CA對PANC-1腫瘤細(xì)胞干性的抑制作用。

PCSCs的調(diào)控機(jī)制是非常復(fù)雜的，涉及多條信號通路的參與如SHH、Notch1、Wnt/β-catenin、PI3K/AKT/mTOR信號通路，CD44s/STAT3通路已被證實(shí)對胰腺癌增殖和干性的維持意義重大。研究表明采用單克隆抗體抑制CD44s可使下游的Nanog/Sox-2干性基因及p-STAT3被抑制，從而抑制胰腺癌的增殖和干性[8]；與CD44-CD24-和ALDH-細(xì)胞相比，CD44+CD24+和ALDH+胰腺癌干細(xì)胞亞群的STAT3通路被異常激活，抑制STAT3通路可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞干性[17]。然而，由于成體干細(xì)胞等也表達(dá)CD44s，采用抗體治療的策略可能會對正常干細(xì)胞產(chǎn)生傷害，且單克隆抗體價格昂貴，目前臨床上也尚無成功上市的STAT3抑制劑，因此，仍需繼續(xù)研究發(fā)現(xiàn)針對CD44s/STAT3信號通路的安全性好的新藥物；而CA為傳統(tǒng)中藥單體，可作為食用香料使用，安全性較好。我們采用Western blot對CD44s/STAT3通路相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CA可降低p-STAT3和CD44s的表達(dá)，而STAT3蛋白表達(dá)幾無變化，為進(jìn)一步驗(yàn)證，我們采用STAT3的特異激動劑Colivelin TFA[18]進(jìn)行回復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)STAT3的磷酸化水平可部分回復(fù)CA對PANC-1細(xì)胞增殖和干性的抑制效果，說明CA可能通過CD44s/STAT3通路抑制PANC-1細(xì)胞的增殖和干性。

綜上，CA可抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和腫瘤細(xì)胞干性，減少胰腺癌干細(xì)胞比例，其機(jī)制可能與調(diào)控CD44s/STAT3信號通路有關(guān)。后續(xù)研究將利用體內(nèi)動物模型和臨床樣本繼續(xù)對此深入探討，為發(fā)展相關(guān)的胰腺癌新治療藥物提供更多科學(xué)依據(jù)。