GluA2亞基內(nèi)吞阻滯穿膜環(huán)肽CMT-3Y的設(shè)計(jì)合成與評(píng)價(jià)

嚴(yán)志祥 韓帥 陳積 祝青曄 董銘心

(1 青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院特種醫(yī)學(xué)系，山東 青島 266021； 2 青島大學(xué)藥學(xué)院； 3 青島大學(xué)附屬青島市婦女兒童醫(yī)院麻醉科)

Tat序列可介導(dǎo)生物大分子進(jìn)入細(xì)胞，并有生物相容性高、毒副作用低等優(yōu)點(diǎn)。但是Tat的遞送效率，特別是從內(nèi)吞小泡逃逸的效率亟待提高[5]；同時(shí)，在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)還面臨血漿耐受性差的問題[6-7]。解決Tat等細(xì)胞穿膜肽(CPPs)的缺陷一直是多肽藥物領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。有研究結(jié)果顯示了一系列兩親性CPP的環(huán)肽，其胞漿遞送效率高達(dá)7.5%～121.0%(相比之下Tat為2.0%),這些環(huán)狀CPP直接與質(zhì)膜磷脂結(jié)合，通過內(nèi)吞作用進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，然后從內(nèi)吞小泡體內(nèi)有效釋放[5,7-8]。兩親性CPP設(shè)計(jì)原則包括：引入機(jī)體內(nèi)酶不能識(shí)別的非天然氨基酸以及D型氨基酸，從而能夠提高多肽的穩(wěn)定性；引入含脂肪族側(cè)鏈的非天然氨基酸，降低多肽藥的極性，提高多肽藥物穿透能力；增加一定長度的聚乙二醇(PEG)修飾，既可提高多肽藥膜滲透性和穩(wěn)定性，同時(shí)又能將CPP與活性基團(tuán)拉開一定距離以保持多肽藥物的活性，但隨著PEG的延長，會(huì)導(dǎo)致相對(duì)分子質(zhì)量過大，不利于維持藥物的穿膜效率。本研究在環(huán)狀CPP的設(shè)計(jì)中引入含脂肪族側(cè)鏈非天然氨基酸、D型氨基酸和長度最短的聚乙二醇(miniPEG)，設(shè)計(jì)GluA2亞基內(nèi)吞阻滯穿膜環(huán)肽CMT-3Y，旨在提高3Y的穿膜能力、神經(jīng)保護(hù)活性和血漿穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料和設(shè)備

各種Fmoc保護(hù)的氨基酸(L/D)、非天然氨基酸以及合成所需的原料均購于北京偶合試劑有限公司，反相高效液相色譜(RP-HPLC)為安捷倫1220(分析型)和1260(制備型)、PC-12(高分化)細(xì)胞系購自于北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司，MDCK-MDR1細(xì)胞系購于青旗(上海)生物技術(shù)發(fā)展有限公司，CCK8試劑購于上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1CMT-3Y和陰性對(duì)照3Y的合成及表征方法CMT-3Y和陰性對(duì)照3Y均采用文獻(xiàn)報(bào)道的固相合成方法合成[8]。用RP-HPLC 1260對(duì)合成的多肽進(jìn)行純化，色譜柱為Positisil反相C18(半制備型)5 μm，4.6 mm×250 mm，流量為3 mL/min，色譜條件：水相為去離子水+體積分?jǐn)?shù)0.000 5的三氟乙酸(TFA)；有機(jī)相為乙腈+體積分?jǐn)?shù)0.000 5的TFA，在體積分?jǐn)?shù)0.1～0.7乙腈中梯度洗脫，時(shí)間為35 min，檢測波長為280 nm。稱量純肽質(zhì)量并計(jì)算肽分離收率，肽分離收率=實(shí)際純化量/理論純化量。用RP-HPLC 1220分別分析陰性對(duì)照3Y和CMT-3Y的粗肽和純肽的色譜純度表征，色譜柱為Positisil OSD-P反相C18(分析型)5 μm，4.6 mm×250 mm，流量為1 mL/min,色譜條件與純化的相同，在體積分?jǐn)?shù)0.1～0.9的乙腈中梯度洗脫，時(shí)間為32 min，檢測波長為280 nm。用質(zhì)譜表征陰性對(duì)照3Y和CMT-3Y的相對(duì)分子質(zhì)量。

1.2.23Y、Tat-GluA2-3Y和CMT-3Y穿膜效率評(píng)價(jià)方法 將MDCK-MDRI細(xì)胞以1.7×105個(gè)鋪入Transwell板小室頂端(AP側(cè))中，在AP側(cè)加入含體積分?jǐn)?shù)0.1胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，然后將Transwell板置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在第1、3、5、7天采用相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的方法[9]用電阻儀測量電阻值，并且在Transwell板AP側(cè)加入400 μL終濃度為20 mg/L的熒光黃，與細(xì)胞共同孵育3 h后，在激發(fā)光波長為427 nm、發(fā)射光波長為536 nm處用酶標(biāo)儀檢測熒光黃的吸光度(A)值。通過熒光黃的表觀滲透系數(shù)(Papp)值和電阻值來評(píng)估模型的緊密連接性，當(dāng)培養(yǎng)至第7天細(xì)胞緊密連接性良好時(shí)，分別將陰性對(duì)照組3Y、陽性對(duì)照組Tat-GluA2-3Y以及實(shí)驗(yàn)組CMT-3Y用HBSS緩沖液配制成500 mg/L的濃度。取400 μL各組藥物分別加入至培養(yǎng)7 d且電阻值符合要求的Transwell板小室AP側(cè)的細(xì)胞中，同時(shí)Transwell板基底側(cè)(BL側(cè))加入600 μL HBSS緩沖液，與細(xì)胞共孵育3 h，從BL側(cè)取樣并采用RP-HPLC檢測各藥物滲透濃度，各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值，計(jì)算各組Papp值。

將陰性對(duì)照組3Y、陽性對(duì)照組Tat-GluA2-3Y以及實(shí)驗(yàn)組CMT-3Y用HBSS緩沖液各配制成500 mg/L的質(zhì)量濃度。取100 μL各組藥物加入至平行人工膜滲透模型(PAMPA)的上方(AP側(cè))，在基底側(cè)(BL側(cè))加入370 μL HBSS緩沖液，避光室溫孵育3 h，然后取BL側(cè)液體進(jìn)行RP-HPLC檢測，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，同時(shí)計(jì)算各組藥物的Papp值。

1.2.33Y、Tat-GluA2-3Y和CMT-3Y神經(jīng)保護(hù)活性評(píng)價(jià)方法 將PC-12細(xì)胞以4×103個(gè)/孔鋪入96孔板中，在含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM、37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為空白組(只加入配Glu用的溶劑)、模型Glu組、藥物組(分別為0.001、0.010、0.050、0.100、1.000 mmol/L陰性對(duì)照組3Y、陽性對(duì)照組Tat-GluA2-3Y和實(shí)驗(yàn)組CMT-3Y)，用文獻(xiàn)報(bào)道的方法構(gòu)建Glu誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞神經(jīng)興奮損傷模型[10]，同時(shí)各組給予各濃度藥物進(jìn)行處理。模型構(gòu)建24 h后各孔加入20 μL CCK8共孵育2 h，在波長450 nm處用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞的吸光度(A)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，結(jié)果取均值，計(jì)算不同濃度下各組細(xì)胞存活率和半數(shù)最大效應(yīng)濃度(EC50)。

1.2.4Tat-GluA2-3Y和CMT-3Y在不同時(shí)間點(diǎn)體外血漿中的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)方法 采用相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的方法[11]進(jìn)行體外血漿穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，將Tat-GluA2-3Y和CMT-3Y分別用去離子水配制成10 g/L的濃度，分別取100 μL兩組多肽加入100 μL的大鼠血漿中使其終濃度為5 g/L，置于37 ℃烘箱中孵育0、0.5、1.0、2.0、4.0，6.0、12.0、24.0 h。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值，比較不同時(shí)間Tat-GluA2-3Y和CMT-3Y的酶降解率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 3Y合成結(jié)果

3Y(Ac-YKEGYNVYG-NH2，結(jié)構(gòu)式見圖1A)在以去離子水(含體積分?jǐn)?shù)0.000 5的TFA)-乙腈溶液(含體積分?jǐn)?shù)0.000 5的TFA)60∶40為流動(dòng)相情況下出峰，粗肽色譜純度為88.53%，純化以后色譜純度則為98.54%(見圖1B)，3Y分離收率為59.8%。3Y理論相對(duì)分子質(zhì)量為1 133.50，測得相對(duì)分子質(zhì)量為1 133.61(見圖1C),兩者相對(duì)分子質(zhì)量一致。

A：3Y結(jié)構(gòu)式，B：3Y的RP-HPLC圖譜，C：3Y質(zhì)譜圖

2.2 CMT-3Y的合成結(jié)果

CMT-3Y序列見圖2A,結(jié)構(gòu)見圖2B。在以去離子水(含體積分?jǐn)?shù)0.000 5的TFA)-乙腈溶液(含體積分?jǐn)?shù)0.000 5的TFA)70∶30為流動(dòng)相情況下出峰，粗肽色譜純度為69.54%，純化后色譜純度為99.36%(圖2C)，分離收率為46.06%，CMT-3Y理論相對(duì)分子質(zhì)量為2 317.168，測得相對(duì)分子質(zhì)量為2 317.156(圖2D),兩者相對(duì)分子質(zhì)量一致。

A:CMT-3Y序列(&代表L-2-萘丙氨酸，#代表miniPEG)，B:CMT-3Y結(jié)構(gòu)圖，C:CMT-3Y的RP-HPLC圖，D:CMT-3Y質(zhì)譜圖

2.3 穿膜活性評(píng)價(jià)

2.3.1MDCK-MDR1跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)模型的可靠性評(píng)價(jià)MDCK-MDR1跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)模型在培養(yǎng)第7天時(shí)的電阻為(305.09±3.56)Ω·cm2(圖3)，熒光黃滲透評(píng)價(jià)測得Papp值為3.57×10-7cm/s，在第1、3、5天的熒光黃滲透評(píng)價(jià)的Papp值分別為1.03×10-2、2.34×10-4、4.98×10-5cm/s,說明MDCK-MDR1在第7天能夠形成緊密連接良好的致密單層，可以用于藥物穿膜評(píng)價(jià)。

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)MDCK-MDR1細(xì)胞在Transwell板中的電阻參數(shù)

2.3.23Y、Tat-GluA2-3Y和CMT-3Y的穿膜效率評(píng)價(jià)結(jié)果 在MDCK-MDR1跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)模型上Tat-GluA2-3Y的Papp值為(2.56±0.05)×10-5cm/s，CMT-3Y為(9.33±0.03)×10-5cm/s，CMT-3Y的穿膜效率約是Tat-GluA2-3Y的3.6倍，兩者間比較差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=170.57，P<0.01)；在PAMPA模型上Tat-GluA2-3Y的Papp值為(3.55±0.06)×10-5cm/s，CMT-3Y的值為(9.59±0.03)×10-5cm/s，CMT-3Y的穿膜效率約是Tat-GluA2-3Y 2.7倍，兩者間比較差異有顯著意義(t=138.80，P<0.01)。3Y在兩個(gè)模型上通過RP-HPLC均未檢測出。

2.4 不同濃度的Tat-GluA2-3Y、CMT-3Y和3Y的神經(jīng)保護(hù)活性評(píng)價(jià)

析因設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果顯示，藥物濃度、組別、濃度和組別的交互作用對(duì)模型Glu組、空白組、Tat-GluA2-3Y組、CMT-3Y組和3Y組的細(xì)胞存活率有明顯影響(F濃度=94.54，F(xiàn)組間=108.67，F(xiàn)交互=31.15，P<0.01)；且隨著藥物濃度的上升，Tat-GluA2-3Y和CMT-3Y組的細(xì)胞存活率也隨之提高(F=31.46、65.49，P<0.01)，而3Y組不同濃度間的細(xì)胞存活率差異無顯著性(P>0.05)；模型Glu組中細(xì)胞的存活率為(10.57±4.81)%，空白組為(100±0.04)%，3Y組與模型Glu組間細(xì)胞存活率比較差異無顯著意義(P>0.05)，而空白組、Tat-GluA2-3Y組和CMT-3Y組與模型Glu組間細(xì)胞存活率比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中CMT-3Y組的細(xì)胞存活率高于Tat-GluA2-3Y組(P<0.05)。見表1。此外，Tat-GluA2-3Y組的EC50值為(50.62±3.60)μmol/L，CMT-3Y組為(35.53±5.47)μmol/L，兩者EC50值比較差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.60，P<0.05)。

表1 Glu誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞在Tat-GluA2-3Y、CMT-3Y和3Y中的存活率

2.5 Tat-GluA2-3Y和CMT-3Y不同時(shí)間點(diǎn)血漿穩(wěn)定性比較

重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果顯示，時(shí)間、組別、時(shí)間和組別交互作用對(duì)血漿中酶降解率具有明顯影響(F時(shí)間=40 742.07，F(xiàn)組別=38 998.63，F(xiàn)交互=9 323.67，P<0.01)；且隨著血漿孵育時(shí)間的延長，Tat-GluA2-3Y組和CMT-3Y組在血漿中酶降解率隨之升高(F組內(nèi)=17 702.36、58 347.85，P<0.01)；各時(shí)間點(diǎn)Tat-GluA2-3Y組酶降解率高于CMT-3Y組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.75～914 199.40，P<0.01)。見表2。

表2 Tat-GluA2-3Y和CMT-3Y在血漿中酶降解率比較

3 討 論

多肽藥物具有高生物活性、高專一性和低毒性等優(yōu)點(diǎn)，在臨床應(yīng)用廣泛[12]。然而，線性多肽的首尾端有游離的氨基和羧基，且極性較高，因此線性多肽具有半衰期短和透膜性差等缺陷。環(huán)肽可降低藥物的極性及封閉裸露的氨基和羧基，從而提高藥物的穿膜能力和血漿穩(wěn)定性，是多肽藥物研究熱點(diǎn)。本研究設(shè)計(jì)并合成了環(huán)化的兩親性CPP的CMT-3Y，結(jié)果顯示，該環(huán)肽提高了藥物的穿膜效率、神經(jīng)保護(hù)活性和血漿穩(wěn)定性，為多肽修飾提供了研究的思路。

本研究中采用的MDCK-MDR1細(xì)胞系是以人源MDR1基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞而成，該細(xì)胞系能夠表達(dá)極性化的P-gp蛋白，常用于構(gòu)建評(píng)價(jià)化合物穿透血腦屏障和腸道黏膜能力的體外快速篩選模型[9]。本研究結(jié)果顯示，用MDCK-MDR1細(xì)胞構(gòu)建穿膜模型時(shí)，電阻值在第5天達(dá)到了高峰，為(425.21±4.45)Ω·cm2，隨后呈下降趨勢，第7天時(shí)電阻值達(dá)(305.09±3.56)Ω·cm2，電阻值變化情況與目前相關(guān)的研究結(jié)果一致[9]。研究表明，當(dāng)電阻值>150 Ω·cm2時(shí)，細(xì)胞已形成了緊密連接性[13]。本研究MDCK-MDR1跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)模型電阻值在第5天已達(dá)標(biāo)準(zhǔn)，但熒光黃Papp值仍超過2×10-6cm/s，未達(dá)到相關(guān)研究報(bào)道的標(biāo)準(zhǔn)[14],當(dāng)?shù)?天時(shí)熒光黃的Papp值為3.57×10-7cm/s(<2×10-6cm/s)，才符合實(shí)驗(yàn)要求。MDCK-MDR1跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)模型在細(xì)胞完成分化、形成致密單層且電阻值符合要求的條件下可以用于穿膜評(píng)價(jià),該模型在第2～3天即可形成致密單層，但細(xì)胞完成分化則需要6～7 d[9]。本研究中熒光黃的Papp值在第7天時(shí)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，MDCK-MDR1跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)模型可用于穿膜評(píng)價(jià)。

本研究結(jié)果顯示CMT-3Y的穿膜效率是Tat-GluA2-3Y的3～4倍，穿膜效率大幅提高但增加的倍數(shù)不及文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果[15]。文獻(xiàn)報(bào)道環(huán)狀CPP偶聯(lián)的貨物為熒光素，相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)較小，且其穿膜效率檢測是通過統(tǒng)計(jì)環(huán)狀CPP偶聯(lián)的熒光素貨物在細(xì)胞內(nèi)的發(fā)光值，該檢測方式不能夠模擬藥物在體內(nèi)的穿膜情況。而本研究采用的MDCK-MDR1跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)模型不僅能評(píng)價(jià)藥物的胃腸道穿膜能力，還能評(píng)價(jià)穿透血腦屏障的能力，可更好地模擬藥物在體內(nèi)穿膜情況；此外，PAMPA是由帶負(fù)電的磷脂雙分子層組成，可更好地模擬藥物在體內(nèi)被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的能力，是藥物穿膜能力篩選的有力模型。

多肽藥物的穿膜效率受到多種因素的影響。一方面，會(huì)受到多肽藥物極性大小的影響，本研究通過RP-HPLC檢測的結(jié)果顯示，CMT-3Y的極性小于Tat-GluA2-3Y。CMT-3Y上環(huán)兩親性CPP與Tat相比，環(huán)兩親性CPP中含有非極性側(cè)鏈的非天然氨基酸，降低了多肽向細(xì)胞膜遷移過程中的吉布斯自由能，進(jìn)而提高了多肽藥物被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)能力。另一方面，Tat和采用的環(huán)兩親性CPP均含有一定數(shù)目帶正電荷的精氨酸，其與細(xì)胞膜表面產(chǎn)生的靜電作用使細(xì)胞膜變薄，能夠通過主動(dòng)攝取的方式瞬時(shí)穿透細(xì)胞膜[16]。而將CPP環(huán)化后能夠降低其與細(xì)胞膜結(jié)合的熵?fù)p失[17]，故環(huán)化后的兩親性CPP穿膜效率更高。此外，CPP氨基酸數(shù)目亦能影響多肽藥物的穿膜效率，本研究CMT-3Y中的CPP中有7個(gè)氨基酸，而Tat-GluA2-3Y的Tat有11個(gè)氨基酸，因此CMT-3Y的氫鍵受體和氫鍵供體數(shù)目較少。相關(guān)研究表明藥物氫鍵受體和氫鍵供體數(shù)目越少，其穿膜效率越高[18-19]。

高分化狀態(tài)的PC-12細(xì)胞能夠表達(dá)神經(jīng)元的表型，高分化狀態(tài)的PC-12細(xì)胞也表達(dá)AMPA受體的A2亞基[20]。此外，本研究中的空白組細(xì)胞存活率與模型Glu組比較差異具有顯著性，說明PC-12細(xì)胞的神經(jīng)興奮性損傷是由Glu介導(dǎo)的，與相關(guān)研究結(jié)果一致[10]，故高分化狀態(tài)的PC-12細(xì)胞可用于本研究的細(xì)胞活性評(píng)價(jià)。本研究中CMT-3Y的EC50值低于Tat-GluA2-3Y，說明CMT-3Y具有較高的神經(jīng)保護(hù)活性。本研究結(jié)果顯示，藥物的活性大小與穿入細(xì)胞的藥量有關(guān)，一方面，Tat-GluA2-3Y和CMT-3Y的活性基團(tuán)相同，但CMT-3Y穿透細(xì)胞的能力更強(qiáng)，因此CMT-3Y的神經(jīng)保護(hù)活性優(yōu)于Tat-GluA2-3Y；另一方面，在一定范圍內(nèi)藥物濃度越高，穿入細(xì)胞的藥物含量越多，Tat-GluA2-3Y和CMT-3Y神經(jīng)保護(hù)活性也隨之增強(qiáng)。CMT-3Y的活性高與其穩(wěn)定性高也有關(guān)，在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在，活性片段能夠更好地發(fā)揮生物活性。此外，本研究中CMT-3Y的CPP與活性基團(tuán)的距離要大于Tat-GluA2-3Y，相關(guān)研究表明，CPP與活性基團(tuán)保持一定的距離能夠提高多肽藥物的活性[8]。

本研究結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的延長Tat-GluA2-3Y以及CMT-3Y在血漿中酶降解率均會(huì)上升，但是Tat-GluA2-3Y在血漿中12 h降解了約95%，而CMT-3Y在24 h才降解了約57%，表明CMT-3Y的血漿穩(wěn)定性更好。一方面，環(huán)肽通過限制構(gòu)象，增強(qiáng)了多肽的剛性，增大反應(yīng)間原子的距離，減少識(shí)別氨基和羧基的特定蛋白酶的水解；另一方面，CMT-3Y中含有3個(gè)D型氨基酸和1個(gè)非天然氨基酸，血漿中的酶主要識(shí)別L型氨基酸，不能識(shí)別D型氨基酸和非天然氨基酸。相關(guān)研究表明，將L型氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)镈型氨基酸，能夠提高藥物的穩(wěn)定性[21]；此外，一定長度下的PEG修飾在提高血漿穩(wěn)定性方面也發(fā)揮著效應(yīng)，PEG能夠改變多肽的理化性質(zhì)，封閉多肽的正電荷，防止血漿蛋白與多肽結(jié)合，提高其穩(wěn)定性[22]。

綜上所述，CMT-3Y依靠其含有脂溶性側(cè)鏈基團(tuán)以及較短的多肽鏈等優(yōu)勢使穿膜效率高于Tat-GluA2-3Y。此外，CMT-3Y引入了非天然氨基酸、D型氨基酸、PEG以及環(huán)化的兩親性CPP，從而能夠避免血漿中一些酶的水解，提高了CMT-3Y的血漿穩(wěn)定性。由于CMT-3Y的高穿膜效率、高穩(wěn)定性以及環(huán)狀CPP與活性基團(tuán)保持有一定距離，從而使CMT-3Y具有較高的神經(jīng)保護(hù)活性。本研究可為多肽藥物的修飾改造提供思路和數(shù)據(jù)支持。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

作者貢獻(xiàn)：嚴(yán)志祥、韓帥、陳積、祝青曄和董銘心參與了研究設(shè)計(jì)；嚴(yán)志祥、董銘心參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions： The study was designed byYANZhixiang,HANShuai,CHENJi,ZHUQingye, andDONGMingxin. The manuscript was drafted and revised byYANZhixiangandDONGMingxin. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.