碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的研究進(jìn)展

魏曉鳳,范 翰,馬 俊,汪俊卿,李丕武

齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 生物工程學(xué)院 生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室,山東 濟(jì)南 250353

隨著工業(yè)的日益發(fā)達(dá),能源需求日漸緊張,生物質(zhì)資源因其來源廣泛、綠色低耗逐步被眾多研究者注意,其中生物酶降解生物質(zhì)資源可以有效緩解能源問題,但在具體實踐中存在諸多問題,例如酶的利用效率低下、生物質(zhì)資源的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性與商品化酶種類少的矛盾等。生物質(zhì)原料中碳水化合物含量巨大,以纖維素、淀粉、幾丁質(zhì)等形式存在[1],通常情況下分子量大、降解困難,為應(yīng)用生產(chǎn)帶來巨大挑戰(zhàn)。

針對碳水化合物建立的碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(http://www.cazy.org),是涉及能夠降解、修飾或者產(chǎn)生糖苷鍵酶類的相關(guān)結(jié)構(gòu)域的數(shù)據(jù)庫資源[2-3],基于酶蛋白序列相似性可歸類為不同的蛋白質(zhì)家族,其中包括糖苷水解酶(GHs)、糖基轉(zhuǎn)移酶(GTs)、多糖裂解酶(PLs)、碳水化合物酯酶(CEs)、輔助活性酶類(AAs)以及碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBMs)。

碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域是一類非催化活性的具有折疊結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),能夠與多糖(特別是不溶性多糖)進(jìn)行特異性結(jié)合[4]。根據(jù)最初發(fā)現(xiàn)的幾個結(jié)合纖維素的模塊,CBM曾經(jīng)被歸類為纖維素結(jié)合域 (Cellulose binding domain,簡稱CBD)。隨著不斷發(fā)現(xiàn)碳水化合物活性酶中的其他模塊結(jié)合纖維素以外的碳水化合物,開始出現(xiàn)“碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域”這一術(shù)語[5]。截至2021年10月,基于氨基酸序列的相似性,CBM被分為88個家族,大部分來自于細(xì)菌中的酶類,并且與細(xì)胞壁聚合物結(jié)合的家族居多。其中第50家族占比最高,包含123 000多種CBM,占總CBM的44%左右,另外48、5、13和32家族也占比較高,分別占比15.6%、4.8%、4.3%、4.1%。大部分CBM的氨基酸殘基數(shù)在30～250個之間,可以位于肽鏈的N端、C端或中間[6]。

近年來,關(guān)于CBM的結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制、重組融合以及與底物結(jié)合的研究逐漸增多,這對促進(jìn)碳水化合物的研究以及推動碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的廣泛應(yīng)用具有重大作用。

1 CBM的命名、分類以及結(jié)構(gòu)

1.1 CBM的命名與分類

最早發(fā)現(xiàn)的幾種CBM根據(jù)氨基酸序列相似性依次命名為Type I至Type XIII,隨著越來越多CBM被發(fā)現(xiàn),CBM改用家族進(jìn)行命名,其中第1家族至第13家族等同于最早命名的Type I至Type XIII,基于蛋白質(zhì)序列的一致性,目前CBM分為88個家族。為了提高準(zhǔn)確度,CBM命名也可以加入物種來源及其來源的酶,例如來源于日本纖維弧菌(CellvibriojaponicusUeda107)木聚糖酶XynA的第10家族CBM,可以命名為CjCBM10或CjXynACBM10。如果酶含有相同家族的串聯(lián)CBM,則加入CBM在酶中相對于N-末端的位置相匹配的數(shù)字,例如CBM10-1、CBM10-2。

1.2 CBM的結(jié)構(gòu)與分類

過去幾十年通過用X射線晶體學(xué)和核磁共振譜測定了不同家族CBM的三維結(jié)構(gòu)。在CBM分類中,根據(jù)蛋白質(zhì)折疊和三維結(jié)構(gòu)分類為7個“折疊族”[7],分別為β-三明治、β-三葉折疊、半胱氨酸結(jié)、獨(dú)特型、OB折疊、hevein折疊和獨(dú)特型含hevein-折疊,其中以β折疊最為常見。

β-三明治“折疊族”CBM通常包括兩個β折疊,每個β折疊由3～6條反平行β鏈組成。大部分此類折疊能夠結(jié)合金屬離子[8],這一特性利于結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。另外2006年Hashimotoz[9]在Boraston[7]研究的基礎(chǔ)上提出可以將β-三明治結(jié)構(gòu)細(xì)分為β-果凍卷和免疫球蛋白兩類結(jié)構(gòu)。β-三葉折疊是一個連續(xù)的氨基酸序列,具有四個β鏈以及兩個發(fā)夾結(jié)構(gòu)。Valerie等[10]在研究β-三葉折疊結(jié)構(gòu)的CBM時發(fā)現(xiàn)Streptomyceslividans的CBM13因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征,大大增加了對底物的高度親和性。Hevein折疊是一個僅具有大約40個氨基酸的結(jié)構(gòu)域,具有兩個小β片和一個小的螺旋區(qū)域,但是可以有效容納延伸的結(jié)合位點,剩余的折疊族是僅含β-折疊和卷曲的30～60個AA的小多肽,其配體特異性的多樣性較低。

除此之外,還可以根據(jù)CBM底物特性將其再次分為三種類型[7,11],A型(CBMs TypeA),也稱為表面結(jié)合型；B型(CBMs TypeB),也稱為鏈?zhǔn)浇Y(jié)合型；C型(CBMs TypeC),也稱為寡糖結(jié)合型(見表1)。

表1 CBM類型

A型CBM 表面具有芳香族氨基酸,因此有疏水性,同時能夠形成相對平坦的結(jié)合位點,故而對于不可溶的底物有較強(qiáng)的親和性,可以與結(jié)晶多糖結(jié)合,但是對于可溶性的多糖卻難以結(jié)合[12-13]；B型CBM采用結(jié)合單聚糖鏈的碳水化合物結(jié)合凹槽,底物的聚合程度能夠影響結(jié)合能力,通常能夠結(jié)合聚合度較高的底物(如木聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖、混合鍵的葡聚糖和非結(jié)晶纖維素)[14-15],另外除了保守芳香族氨基酸影響,氫鍵在B型CBM底物特異性的結(jié)合過程中具有關(guān)鍵作用；C型 CBM 可以有效結(jié)合短寡糖(一糖、二糖、三糖),由于其不具有類似B型的延伸結(jié)合位點凹槽,所以底物結(jié)合較為集中[16],同時結(jié)合位點表現(xiàn)的口袋拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),能夠有效識別聚糖的非還原末端[17]。

由圖1可見,CBM的結(jié)合位點與周圍殘基的獨(dú)特互補(bǔ)能夠顯示不同的表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),YeCBM32結(jié)合位點的不同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可能是與多糖鏈內(nèi)部結(jié)合有關(guān)系,例如,聚半乳糖醛酸裂解酶能夠利用堿性氨基酸側(cè)鏈和糖的酸性糖醛酸基穩(wěn)定相互作用的鹽橋。另外,通過定點誘變可以驗證碳水化合物活性位點的位置,YeCBM32中色氨酸用丙氨酸取代,發(fā)現(xiàn)色氨酸丟失會影響他們的環(huán)境[18]。腸道共生菌Roseburia中CBM86中不變賴氨酸(K95)的側(cè)鏈對于底物結(jié)合至關(guān)重要,因為它為堆疊在 Y62 上的木糖基環(huán)提供了唯一的帶電氫鍵,實驗表明,突變體能夠保留整體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),但是親和力大大下降[19]。

注:PDB ID a—4B9C;b—1EXG；c—1GU3；d—1J84；e—1I82；f—1W9W。

2 作用機(jī)制

2.1 鄰近作用

CBM可以增加底物附近的酶濃度[20],導(dǎo)致多糖水解增加。Cécile Hervé[21]研究發(fā)現(xiàn),在植物細(xì)胞壁完整的情況下,擁有纖維素導(dǎo)向的CBM可能會為多糖降解酶帶來選擇性優(yōu)勢。主要是通過酶與細(xì)胞壁物質(zhì)保持緊密接觸來完成。酶通過其纖維素特異性CBM結(jié)合到細(xì)胞壁,而催化模塊能夠接近目標(biāo)底物,該底物能夠達(dá)到與纖維素微纖維緊密結(jié)合的效果。

2.2 疊加作用

通常碳水化合物活性酶中含有不止一個CBM[22],多CBM會產(chǎn)生一定的疊加效應(yīng)。產(chǎn)氣莢膜梭菌分泌一種多模塊唾液酸酶,其在N末端具有CBM32和CBM40。CBM32結(jié)合N-乙酰半乳糖胺和半乳糖,而CBM40識別唾液酸,它們的串聯(lián)排列可能起到增強(qiáng)對含有各自配體的糖綴合物的親和作用[23]。具有3個CBM的雙功能酶CelA,其中具備纖維素結(jié)合能力的有2個,剩余1個起輔助作用。酶作用底物時由表面向深層降解,從而底物產(chǎn)生空腔結(jié)構(gòu)[24],劉亮等[25]研究發(fā)現(xiàn),甘露聚糖酶-乙酰酯酶雙功能酶44884具有2個CBM65,對底物甘露聚糖以及結(jié)晶纖維素有良好的結(jié)合活性,并且對催化域的水解均有明顯促進(jìn)作用。

2.3 底物靶向作用

CBM可以通過將酶引導(dǎo)到富含木葡聚糖的細(xì)胞壁區(qū)域來增強(qiáng)活性[26]。唐存多[27]通過構(gòu)建C端帶有CBM的reAuMan5A-CBM融合蛋白,經(jīng)過在P.pastorisGS115中進(jìn)行蛋白表達(dá)及純化后,發(fā)現(xiàn)重組融合蛋白能夠與微晶纖維素具有92.3%的結(jié)合,但是底物與reAuMan5A并無結(jié)合能力,這表現(xiàn)出重組融合蛋白reAuMan5A-CBM具有良好的纖維素結(jié)合能力。GHs的CBM靶向不溶性多糖,即附加在木聚糖降解酶上的CBM35能識別GlcA。酶被轉(zhuǎn)移到半纖維素多糖上,從而使酶能夠到達(dá)目標(biāo)底物[17]。

2.4 微晶破壞作用

研究發(fā)現(xiàn),碳水化合物活性酶中的某些CBM能夠破壞結(jié)晶型多糖,從而有利于酶的催化結(jié)構(gòu)結(jié)合底物,提高酶的催化效率,但是這種破壞作用的研究尚不透徹[28]。目前,研究發(fā)現(xiàn)可以分為兩種破壞方式,直接氧化催化以及通過底物氫鍵斷裂實現(xiàn)。CBM2a和CBM44在單獨(dú)存在時具有破壞纖維素纖維結(jié)構(gòu)的作用,同時可以釋放小碎片,表現(xiàn)出疏解結(jié)晶纖維素的能力[29]。后來研究中發(fā)現(xiàn)對淀粉也有此作用,CBM與淀粉特異性結(jié)合的同時破壞淀粉表面,從而提高底物分解率。

3 CBM融合表達(dá)與應(yīng)用

3.1 CBM融合及重組表達(dá)

基因工程的快速發(fā)展,使得可以通過CBM的融合來提高酶的熱穩(wěn)定性、活性和底物結(jié)合能力[30-31]。來源于某些生物體的CBM穩(wěn)定性較高[32-33],屬于熱穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)域。有研究顯示,熱穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)域在和不穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域發(fā)生融合后,通常能夠達(dá)到提高后者熱穩(wěn)定性的效果。因此在酶分子理性改造過程中,借助穩(wěn)定CBM可以改善酶學(xué)性質(zhì),例如穩(wěn)定性、最適溫度以及pH等。另外借助CBM能夠特異性結(jié)合底物的特性,通過融合和重組表達(dá)的生物方法,使不同CBM與同一種催化結(jié)構(gòu)域融合,可以達(dá)到降解不同類型的碳水化合物的效果。CBM融合與重組表達(dá)見表2。

表2 CBM融合與重組表達(dá)

但是并非所有CBM融合都會產(chǎn)生積極作用,有些結(jié)構(gòu)域能夠相互融合,但與此同時也影響了功能。CBM融合位置不同產(chǎn)生的作用也存在區(qū)別,在之前的研究中表明,CBM可以融合在C端或N端,少數(shù)還會位于中間[6]。β-甘露聚糖酶 AuMan5A 與來源于海棲熱孢菌ThermotogamaritimaCBM27分別結(jié)合在C端和N端,對酶學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生了不同影響[41]。

除此之外,CBM與催化活性結(jié)構(gòu)域融合時使用的連接肽(Linker)對于融合效果也會有一定程度的影響[42]。連接肽通常具有較高的脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸。殼聚糖酶與CBM5的重組融合中將FNIII作為連接催化模塊和CBM的接頭[36],能夠有效提高融合效率和酶穩(wěn)定性。接頭的選擇對多模塊酶的組裝和功能具有重要意義,連接體的長度和剛性調(diào)整可以影響催化結(jié)構(gòu)域和CBM之間的分子內(nèi)相互作用。

3.2 碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的應(yīng)用

3.2.1 纖維素改性

CBM能夠識別并特異性結(jié)合到晶體表面的特性,為纖維素的修飾改性提供了可能性。Kevin A?ssa等[43]研究發(fā)現(xiàn)CBM2a對結(jié)晶纖維素有很強(qiáng)的親和能力,將CBM2a引入到纖維素表面進(jìn)行改性,能夠為纖維素表面提供強(qiáng)有力的非共價修飾,可以增加干燥后功能化纖維素納米晶體的再分散性,并基于空間相互作用提高了懸浮穩(wěn)定性。Zhang等[44]通過CBM與角質(zhì)酶對醋酸纖維素纖維進(jìn)行表面改性,另外造紙過程中加入CBM也使成紙機(jī)械性得到改善[45]。

3.2.2 生物材料

近年來,借助大腸桿菌以及畢赤酵母等重組表達(dá)系統(tǒng),CBM還被研究為生物醫(yī)學(xué)工具,即通過生物材料的功能化,促進(jìn)了不同領(lǐng)域的應(yīng)用。Barbosa等[46]研究發(fā)現(xiàn),CBM3能精確修飾纖維素水凝膠,在溫和的生物條件下能夠促進(jìn)纖維素水凝膠的功能化,而不需要復(fù)雜的化學(xué)接枝過程,能夠?qū)崿F(xiàn)纖維素基水凝膠在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

3.2.3 分子探針

重組CBM可用于分子探針,用于表征和監(jiān)測天然、工程多糖的變化以及固定和改善酶性質(zhì)。分子探針的相對熒光強(qiáng)度可以用來量化在酶促分解期間發(fā)生的結(jié)構(gòu)變化,為闡明纖維素的超分子亞結(jié)構(gòu)及其對酶可及性提供了一種定量方法[47]。Gourlay等[48]通過監(jiān)測纖維尺寸和評估纖維表面熒光標(biāo)記的 CBM 的結(jié)合特征,證明膨脹素靶向纖維素纖維位錯內(nèi)的無定形區(qū)域,促進(jìn)這些位錯處的纖維斷裂。

CBM重組有助于闡明分子進(jìn)化,以及許多生物過程中涉及的碳水化合物-蛋白質(zhì)相互作用,除了以上應(yīng)用,CBM重組融合也可以應(yīng)用于改善酶性質(zhì)、細(xì)胞固定化、新型金屬吸附劑等生物醫(yī)學(xué)、復(fù)合材料和電子相關(guān)領(lǐng)域,也可以借助CBM作高通量篩選碳水化合物活性酶的新型多功能微陣列方法,CBM的廣泛應(yīng)用展示出其作為生物技術(shù)工具的廣闊前景。

4 展 望

CBM作為結(jié)構(gòu)功能域,在近年來吸引眾多研究人員關(guān)注。碳水化合物與蛋白質(zhì)相互作用對于許多生物過程是必不可少的,而CBM在碳水化合物的識別中起著關(guān)鍵作用。隨著新家族CBM的探索以及與多糖結(jié)合機(jī)制的研究,對將來改造碳水化合物活性酶和高效利用碳水化合物提供理論基礎(chǔ)。另外基因工程的發(fā)展大大促進(jìn)CBM融合技術(shù),未來CBM在功能材料、生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域?qū)⒕哂懈鼮閺V泛的應(yīng)用。