球孢白僵菌形態(tài)轉(zhuǎn)換的內(nèi)在機(jī)制分析

張 靜,張童生,李敬龍,邱 磊

齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 生物工程學(xué)院 生物基材料與綠色造紙國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 濟(jì)南 250353

病原真菌改變自己的細(xì)胞形態(tài)來適應(yīng)新環(huán)境的現(xiàn)象是普遍存在的[1]。高度極化的多細(xì)胞菌絲態(tài)和單細(xì)胞的酵母態(tài)是最常見的細(xì)胞形態(tài),這兩種形態(tài)之間的轉(zhuǎn)換對(duì)病原真菌的致病性和生命周期非常重要[2]。菌絲與分生孢子相結(jié)合,有利于真菌對(duì)抗各種惡劣環(huán)境并擴(kuò)散生長(zhǎng)。波薩達(dá)斯球孢子菌(Coccidioidesposadasii)是一種能引起肺球孢子菌病的致病菌,在宿主死亡后以菌絲形態(tài)生長(zhǎng)在尸體和附近的土壤[3]。采用微衛(wèi)星位點(diǎn)分析不同地區(qū)的波薩達(dá)斯球孢子菌表明,南美的波薩達(dá)斯球孢子菌是由美國(guó)德克薩斯州的人類或其它哺乳動(dòng)物南遷帶來的[4]。菌絲態(tài)還有利于病原真菌從體外侵染宿主,比如秕糠馬拉癬菌(Malasseziafurfur)和威尼克外瓶霉菌(Exophialawerneckii)采用菌絲形態(tài)侵入人類的表皮表層引起皮膚病[5]。當(dāng)病原真菌侵入宿主后,多存在于宿主的吞噬細(xì)胞中,在那里它們與免疫系統(tǒng)的其它部分隔絕。由于吞噬細(xì)胞內(nèi)菌絲的長(zhǎng)期生長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞破裂,從而使真菌暴露在宿主免疫系統(tǒng)中,所以一些病原真菌會(huì)在宿主體內(nèi)由多細(xì)胞的菌絲生長(zhǎng)轉(zhuǎn)換為單細(xì)胞的酵母生長(zhǎng)[6]。還有一些病原真菌使用酵母細(xì)胞形態(tài)逃避宿主的免疫防御并改變宿主行為,偏側(cè)蛇蟲草菌(Ophiocordycepsunilateralis)的酵母樣細(xì)胞能夠侵入多刺蟻(Polyrhachisants)的肌肉或神經(jīng)系統(tǒng),控制螞蟻離開蟻穴,找到合適的葉子或樹枝后緊緊咬住后等待死亡[7]。

球孢白僵菌(Beauveriabassiana)是一種國(guó)內(nèi)外廣泛使用的廣譜性昆蟲病原真菌,在我國(guó)主要用來防治馬尾松毛蟲和玉米螟,取得了良好的效果[8-10]。相對(duì)于化學(xué)殺蟲劑,球孢白僵菌主要有保護(hù)生態(tài)系統(tǒng)、對(duì)環(huán)境無污染、對(duì)人體無害等優(yōu)點(diǎn)。作為一種國(guó)內(nèi)外廣泛使用的昆蟲病原真菌,其與宿主的相互作用被當(dāng)作模式系統(tǒng)進(jìn)行研究。球孢白僵菌一方面可以通過宿主的體壁、氣孔等途徑外部侵入,另一方面可以通過呼吸道和消化道等途徑內(nèi)部侵入[11]。在侵染循環(huán)中,球孢白僵菌主要經(jīng)歷了分生孢子,菌絲和芽生孢子三種形態(tài)[12]。分生孢子形態(tài)有利于球孢白僵菌隨風(fēng)擴(kuò)散和黏附到宿主體表;菌絲形態(tài)有利于侵入宿主體壁和攝取營(yíng)養(yǎng);芽生孢子形態(tài)會(huì)釋放細(xì)胞表面的碳水化合物,以逃避宿主免疫系統(tǒng)的檢測(cè),有利于球孢白僵菌在宿主體內(nèi)的增殖[13]。

本次研究模擬了球孢白僵菌在侵染宿主時(shí)的形態(tài)轉(zhuǎn)換,具體為分生孢子萌發(fā)形態(tài),營(yíng)養(yǎng)菌絲產(chǎn)孢形態(tài)和芽生孢子的繁殖形態(tài),通過RNA-Seq的手段尋找他們之間的關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 菌株

實(shí)驗(yàn)中使用的菌株為球孢白僵菌B.bassianaARSEF 2860。

1.2 培養(yǎng)基的配置

SDAY培養(yǎng)基:4%葡萄糖、1%蛋白胨、1%酵母粉和2%瓊脂。

GB培養(yǎng)基:2%蔗糖、0.5%蛋白胨。

NLB培養(yǎng)基:4% 葡萄糖、0.4% 硝酸銨、 0.3% 磷酸二氫鉀和0.3% 硫酸鎂。

1.3 樣本的培養(yǎng)

產(chǎn)孢形態(tài):將新鮮的球孢白僵菌分生孢子放到0.02%的吐溫80中混合均勻,調(diào)到懸浮液濃度為107mL-1,取100 mL的孢子懸浮液涂布到含有玻璃紙的SDAY培養(yǎng)基上,在恒溫25 ℃,12 h光照12 h黑暗的環(huán)境下倒置培養(yǎng)6 d,取下玻璃紙上的菌絲快速放到液氮中速凍,然后放到-80 ℃冰箱待用[14]。

萌發(fā)形態(tài):從在SDAY培養(yǎng)基上生長(zhǎng)14 d的菌絲上收集新鮮分生孢子,用0.02%的吐溫80懸浮后在漩渦振蕩器上混勻,接種到GB培養(yǎng)基中使其終濃度為106mL-1。在25 ℃的搖床中培養(yǎng),通過血球計(jì)數(shù)板測(cè)量分生孢子的萌發(fā)率,當(dāng)萌發(fā)50%左右時(shí)終止培養(yǎng),離心收集菌體并用PBS洗滌兩次后吸干上清液,放入液氮中速凍,然后放到-80 ℃冰箱中待用。

芽生孢子形態(tài):將新鮮球孢白僵菌菌絲接種到NLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h,然后濾紙過濾除去菌絲,收集芽生孢子后調(diào)節(jié)菌液濃度為106mL-1,再重新接種到NLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h,離心收集芽生孢子并用PBS緩沖液洗滌兩次后吸干上清液,放入液氮中速凍,然后放到-80 ℃冰箱中待用。

1.4 RNA的提取

將收集的樣品在液氮中研磨成粉末狀,然后取適量體積放入1.5 mL的離心管中,加入1 mL的Trizol,在漩渦震蕩儀上震蕩3 min后,在室溫下靜置5 min。把冷凍離心機(jī)調(diào)到4 ℃預(yù)冷,等溫度恒定后將離心管12 000 r/min離心10 min。取上清液至新的1.5 mL離心管,加入等體積的異戊醇上下顛倒混勻,在-20 ℃冰箱中靜置1 h后,在4 ℃離心機(jī)再次12 000 r/min離心15 min。棄上清,加入1 mL 75%乙醇,用移液槍吹洗沉淀。在4 ℃下10 000 r/min離心3 min,吸去上清液,放在冰上晾干。最后用30 μL DEPC水溶解沉淀[15]。

1.5 mRNA建庫(kù)與測(cè)序分析

本文章的建庫(kù)與測(cè)序分析交由華大基因公司負(fù)責(zé)。

2 結(jié)論和分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)量數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)分析

利用華大基因的BGISEQ-500平臺(tái),本項(xiàng)目對(duì)球孢白僵菌3種形態(tài)下的9個(gè)樣本(每種形態(tài)3個(gè)重復(fù)樣本)進(jìn)行分析,每個(gè)樣本得到約6.5 GB的數(shù)據(jù)。每個(gè)樣本得到的clean reads數(shù)超過4千萬條(表1)。

表1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)分析

2.2 三種形態(tài)下表達(dá)的基因差異

通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,萌發(fā)形態(tài)表達(dá)了5 995個(gè)基因,產(chǎn)孢形態(tài)表達(dá)了6 083個(gè)基因,而芽生孢子形態(tài)下表達(dá)的基因數(shù)量最多,達(dá)到了6 137個(gè)基因,其中5 029個(gè)基因是三種形態(tài)下共同表達(dá)的 (FPKM>10,圖1)?；虮磉_(dá)數(shù)目最多的芽生孢子形態(tài)比基因表達(dá)數(shù)目最小的萌發(fā)形態(tài)只多了142個(gè)基因,占芽生孢子態(tài)基因表達(dá)數(shù)目的2.3%,說明三種形態(tài)下表達(dá)的基因數(shù)量差別并不大。每一種形態(tài)下都有自己獨(dú)特的表達(dá)基因,比如在萌發(fā)形態(tài)中MFS transporter(BBA_06426和BBA_04496),產(chǎn)孢形態(tài)中的chitinase(BBA_09998)和芽生孢子形態(tài)的nitric oxide dioxygenase(BBA_04638)。表2中按平均表達(dá)量從高到低展示了在每種形態(tài)下特異表達(dá)的前五個(gè)基因。

圖1 萌發(fā)、產(chǎn)孢和芽生孢子三種形態(tài)下基因表達(dá)的數(shù)目,篩選標(biāo)準(zhǔn)FPKM>10

表2 在每種形態(tài)下會(huì)特異表達(dá)的基因

表2(續(xù))

2.3 種形態(tài)下基因表達(dá)量差異性

將差異基因的閾值設(shè)置為log2FC>2,Qvalue<0.001來對(duì)3種形態(tài)下基因的表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比。萌發(fā)與產(chǎn)孢之間的差異基因數(shù)量最多(2 196個(gè)),產(chǎn)孢與芽生孢子有1 454個(gè)差異基因,萌發(fā)與芽生孢子有1 280個(gè)差異基因(圖2)。有236個(gè)基因會(huì)隨著球孢白僵菌形態(tài)的改變顯著改變自己的表達(dá)量,并且在每種形態(tài)下的表達(dá)量都不相同(圖2A)。對(duì)這236個(gè)基因進(jìn)行GO富集分析,結(jié)果顯示有94個(gè)基因富集在catalytic activity,34個(gè)基因富集在了oxidoreductase activity,50個(gè)基因富集在與membrane相關(guān)的目錄(圖2B)。

3 結(jié) 論

球孢白僵菌的形態(tài)轉(zhuǎn)換與其致病生理過程息息相關(guān),對(duì)其不同形態(tài)下基因表達(dá)水平的研究能讓我們更清楚的了解球孢白僵菌的生長(zhǎng)與致病機(jī)理。本文通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序手段,去探索球孢白僵菌三種形態(tài)之間的區(qū)別與聯(lián)系,為后期的形態(tài)學(xué)研究打下了基礎(chǔ),同時(shí)指明了方向。我們下一步將從了解單個(gè)基因出發(fā),逐步破解球孢白僵菌形態(tài)轉(zhuǎn)換的密碼,以期望有一天我們可以使用基因工程改造出理想的菌株。