PRSS1和SPINK1基因熱點(diǎn)突變檢測(cè)對(duì)遺傳性胰腺炎高危人群的診斷價(jià)值

張文清,2 雷珂2 魏宏云 王彩霞3 王玲珍3 陳志紅3 李曉宇

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島 266003 1 消化內(nèi)科； 2 醫(yī)學(xué)研究中心，腫瘤免疫及細(xì)胞治療中心； 3 兒童醫(yī)學(xué)中心)

遺傳性胰腺炎(hereditary pancreatitis，HP)是一種少見(jiàn)的常染色體顯性遺傳性疾病，其臨床表現(xiàn)與復(fù)發(fā)性急性胰腺炎(recurrent acute pancreatitis，RAP)和慢性胰腺炎(chronic pancreatitis，CP)相似，占胰腺炎總數(shù)的1%[1]。HP與其他原因?qū)е碌囊认傺紫啾?，具有發(fā)病年齡早、家族聚集和胰腺癌發(fā)病率高等特點(diǎn)[2]。目前HP的發(fā)病機(jī)制仍不明確，既往遺傳學(xué)研究的結(jié)果表明，人陽(yáng)離子胰蛋白酶原(PRSS1)基因突變可引起常染色體顯性HP。除此之外，HP常見(jiàn)突變基因還有絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal 1型(SPINK1)基因和糜蛋白酶C(CTRC)基因等[3]。由于HP與RAP、CP臨床表現(xiàn)類似，基因熱點(diǎn)突變的檢測(cè)對(duì)明確診斷意義重大。有遺傳變異的HP患者建議40～75歲每年行MRI或CT檢查以確定是否有胰腺腫瘤發(fā)生[4]。對(duì)于攜帶囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(CFTR)基因突變CP患者可考慮進(jìn)行基因治療[5]。遺傳咨詢和基因測(cè)序可幫助HP患者明確診斷，并及早干預(yù)，以預(yù)防癌癥的發(fā)生。PRSS1和SPINK1基因突變或多態(tài)性是HP最常見(jiàn)的突變，據(jù)報(bào)道中國(guó)人群PRSS1基因的常見(jiàn)突變位點(diǎn)為c.86 A>T、c.346 C>T、c.364 C>T、c.365 G>A、c.623 G>C，SPINK1基因常見(jiàn)突變位點(diǎn)為c.101 A>G、c.194+2 T>C[6]。本研究通過(guò)檢測(cè)PRSS1和SPINK1基因的這7個(gè)最常見(jiàn)的熱點(diǎn)突變，對(duì)HP高危人群進(jìn)行篩選并明確病因，以探討PRSS1和SPINK1基因熱點(diǎn)突變檢測(cè)對(duì)HP高危人群的診斷價(jià)值。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2020年8月—2021年9月于青島大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科就診的HP高?；颊?，參考HP患者基因檢測(cè)適用人群的標(biāo)準(zhǔn)[7-8]，本研究的HP高?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)為：有CP、RAP和兒童胰腺炎家族史者；原因不明的RAP或CP患者；親屬有HP確定致病基因突變者；25歲以下發(fā)病的特發(fā)性CP患者。最后符合條件的患者共6例，男2例，女4例；成人3例，兒童3例；臨床表現(xiàn)為急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)1例，RAP 4例，CP 1例；血清淀粉酶升高者3例，空腹血糖偏高者3例，有腹痛表現(xiàn)者5例，有脂肪瀉者2例，超重者1例，體重下降者1例，有家族史者1例；6例患者均無(wú)并發(fā)癥發(fā)生；腹部CT檢查胰腺有不同程度的低密度影、輪廓飽滿、周圍脂肪間隙密度增高、多發(fā)斑點(diǎn)狀鈣質(zhì)影等異常影像學(xué)表現(xiàn)者4例。

1.2 方法

采集6例患者的外周靜脈血各3 mL，然后使用上海生工柱式血液基因組DNA抽提試劑盒提取DNA(B518253-0100)，使用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)并計(jì)算提取的DNA的濃度，將DNA稀釋至終濃度0.05 g/L以用于PCR檢測(cè)。使用primer blast軟件來(lái)設(shè)計(jì)覆蓋PRSS1和SPINK1基因7個(gè)突變位點(diǎn)的PCR引物，見(jiàn)表1。委托華大基因科技有限公司完成引物合成。

PCR擴(kuò)增體系：總反應(yīng)體系10 μL，其中DNA聚合酶(5×106U/L)0.2 μL，10-5mol/L各對(duì)引物混合物1 μL，0.05 g/L DNA模板2 μL，2×buffer 5 μL，超純水1.8 μL。置于PE 9700熱循環(huán)儀上：94 ℃ 5 min；98 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s -0.5 ℃/Cycle，72 ℃ 1 min，循環(huán)20次；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)15次；72 ℃延長(zhǎng)5 min。最后4 ℃保存。PCR產(chǎn)物由華大基因科技有限公司測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行Sanger測(cè)序。對(duì)于測(cè)序中發(fā)現(xiàn)的非熱點(diǎn)突變，以CP遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素?cái)?shù)據(jù)庫(kù)(http://www.pancreasgenetics.org/index.php)中已知致病突變和可能致病突變認(rèn)定為HP相關(guān)突變，數(shù)據(jù)庫(kù)中未有的突變，在PubMed(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)和ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)中查找是否有突變相關(guān)報(bào)道和致病性分析結(jié)果。

表1 PRSS1和SPINK1基因7個(gè)突變位點(diǎn)的PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for detection of seven mutation sites in PRSS1 and SPINK1

2 結(jié) 果

基因檢測(cè)結(jié)果顯示，6例患者中有5例檢測(cè)出基因突變，其中3例為PRSS1基因雜合性突變，2例患者為SPINK1基因雜合性突變。5例患者的具體情況如下：患者1基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有非熱點(diǎn)突變PRSS1 c.455-33 C>T突變，目前未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，為內(nèi)含子突變，來(lái)源未知，患有2型糖尿病(圖1A)。患者2基因檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)有PRSS1 c.235G>A突變，來(lái)源于母親，其母有相同PRSS1 c.235 G>A陽(yáng)性突變，但沒(méi)有臨床表現(xiàn)(圖1B)?；颊?基因檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)有SPINK1 c.194+2 T>C突變，來(lái)源于父親，其父具有相同SPINK1 c.194+2 T>C陽(yáng)性突變，但沒(méi)有臨床表現(xiàn)(圖1C)?；颊?基因檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)有SPINK1 c.194+2 T>C突變，來(lái)源未知，有胰腺炎家族史，其兒子、妹妹以及妹妹的子女均有胰腺炎發(fā)作病史，其妹妹檢測(cè)到同樣的基因突變(圖1D)?；颊?基因檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有PRSS1 c.364C>T突變，來(lái)源于其父親，其父亦具有相同的PRSS1 c.364 C>T(p.R122H)陽(yáng)性基因突變，但沒(méi)有臨床表現(xiàn)(圖1E)?；颊?和患者5在診斷時(shí)無(wú)胰腺炎家族史，但是其直系親屬篩查時(shí)發(fā)現(xiàn)有基因突變攜帶者。

A～E分別為患者1～5圖1 發(fā)生PRSS1、SPINK1基因突變5例患者的正向測(cè)序圖Fig.1 Forward sequencing results of 5 patients with PRSS1 and SPINK1 mutations

3 討 論

HP臨床表現(xiàn)缺乏特異性，與其他原因?qū)е碌腁P、CP較難區(qū)分。本研究6例患者中5例有腹痛表現(xiàn)，2例有脂肪瀉癥狀，除此之外，HP還有如家族聚集性、發(fā)病年齡早(兒童及少年就開始發(fā)病)及胰腺癌發(fā)病率高等特點(diǎn)，這為憑借臨床表現(xiàn)診斷HP增加了難度。胰腺組織反復(fù)炎癥易導(dǎo)致胰腺部分或廣泛纖維化、腺泡萎縮、胰管內(nèi)結(jié)石形成、假囊腫形成，最后進(jìn)展為CP，并可能伴有不同程度的胰腺內(nèi)、外分泌功能受損。

PRSS1和SPINK1基因突變或多態(tài)性是HP最常見(jiàn)的致病原因。通過(guò)對(duì)這兩個(gè)基因的熱點(diǎn)突變進(jìn)行檢測(cè)，可以快速篩查出HP患者，從而進(jìn)行早期干預(yù)治療[9]。PRSS1基因突變通過(guò)改變CTRC依賴性胰蛋白酶激活和降解進(jìn)一步導(dǎo)致自身活化增強(qiáng)[10]。PRSS1基因突變的患者較早出現(xiàn)胰腺外分泌功能不全和糖尿病[11]。一項(xiàng)針對(duì)HP患者及其家族成員以問(wèn)卷調(diào)查形式進(jìn)行的隊(duì)列研究結(jié)果顯示，217例攜帶PRSS1基因突變的患者中最常檢測(cè)到的突變是p.R122H(83.9%)，其中有37例攜帶PRSS1基因突變患者在研究期間死亡，有5例死于胰腺癌[12]。由于具有胰腺癌變的高風(fēng)險(xiǎn)，因此建議對(duì)HP患者進(jìn)行胰腺惡性腫瘤的主動(dòng)監(jiān)測(cè)[13]。在日本所進(jìn)行的一項(xiàng)全國(guó)性調(diào)查結(jié)果顯示，對(duì)HP患者及其家庭的基因檢測(cè)中41%發(fā)現(xiàn)有PRSS1基因突變，36%發(fā)現(xiàn)有SPINK1基因突變[9]。我國(guó)針對(duì)3個(gè)HP家系中10例患者和3例散發(fā)病例的回顧性分析顯示，3個(gè)家系中的HP患者起病年齡為8～46歲，其中<20歲起病7例，>20歲起病3例，以PRSS1基因突變多見(jiàn)，其中1個(gè)兩代成員均發(fā)病的家系中,存在隨代數(shù)延續(xù)、發(fā)病年齡提前的現(xiàn)象[14]。劉奇才等[15]針對(duì)1個(gè)HP家系的2例胰腺炎患者的PRSS1基因外顯子進(jìn)行測(cè)序，顯示均為PRSS1基因3號(hào)外顯子純合子突變(c.415T>A)。

成人CP的主要病因是過(guò)量飲酒，而在兒童中，CP的病因多種多樣，包括基因突變、解剖異常和代謝紊亂等。ORACZ等[16]針對(duì)265例CP患兒的臨床資料進(jìn)行分析顯示，有41例患兒被診斷為HP(15.5%)，診斷為HP患兒中88%家族史呈陽(yáng)性，并伴隨PRSS1基因突變。相比非HP患兒，患有HP的兒童臨床表現(xiàn)更為嚴(yán)重。特發(fā)性CP患兒應(yīng)考慮到遺傳原因，即使患兒沒(méi)有陽(yáng)性家族史。一項(xiàng)研究報(bào)告了1例13歲的特發(fā)性CP男孩，在幼兒期就存在不明原因的胰腺炎發(fā)作史，基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其攜帶了PRSS1基因的c.623G>C(p.G208A)突變和CTRC基因的c.180C>T(p.G60G)突變，為雜合狀態(tài)；對(duì)其家庭成員進(jìn)行基因檢測(cè)顯示，其母親為這兩種基因突變的攜帶者，但無(wú)臨床癥狀，其外祖母也發(fā)現(xiàn)有PRSS1的p.G208A突變[17]。本研究的3例兒童患者中，其父親或母親也均檢測(cè)出相同的基因突變，為突變攜帶者，但無(wú)相關(guān)臨床表現(xiàn)。由于HP是一種復(fù)雜的遺傳性疾病，受到環(huán)境和遺傳因素相互作用的影響，本研究中的3例患兒可能受其他未知風(fēng)險(xiǎn)因素的影響，而這些因素可能在其父母身上發(fā)揮的影響不大。推測(cè)基因突變的攜帶者或許可通過(guò)改變生活方式、合理飲食等措施，積極預(yù)防胰腺炎的發(fā)生。

由于PRSS1和SPINK1基因突變的比例很高，為了正確評(píng)估CP、RAP和HP患者，即使那些沒(méi)有明顯的胰腺炎易感因素或家族史的患者，也應(yīng)該考慮進(jìn)行基因檢測(cè)[18]。目前對(duì)HP的研究一般都是全基因組外顯子測(cè)序，費(fèi)用大、耗時(shí)長(zhǎng)。本研究通過(guò)Sanger測(cè)序分析對(duì)符合HP篩查條件的6例胰腺炎患者的SPINK1、PRSS1基因外顯子進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2例為SPINK1 c.194+2 T>C突變，1例為PRSS1 c.235 G>A突變，1例為PRSS1 c.364 C>T突變以及1例為PRSS1 c.455-33 C>T突變。本研究?jī)H僅針對(duì)了6例HP高危患者進(jìn)行了Sanger測(cè)序，即有5例檢查出基因突變，提示該檢測(cè)方法的陽(yáng)性率還是比較高的。另外本研究檢測(cè)到的PRSS1 c.455-33 C>T突變之前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，PRSS1 c.235 G>A突變?yōu)槭状卧谥袊?guó)人群中發(fā)現(xiàn)。對(duì)于新發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)可以繼續(xù)進(jìn)行迷你基因檢測(cè)，探索與非編碼RNA的相關(guān)性以及致病性等。對(duì)于未檢出常見(jiàn)基因突變的患者，可以考慮進(jìn)行耗時(shí)更長(zhǎng)、花費(fèi)更大的二次基因檢測(cè)，如對(duì)已發(fā)現(xiàn)的HP基因外顯子靶向測(cè)序或全部基因外顯子測(cè)序。

綜上所述，在HP高危人群中利用PCR擴(kuò)增聯(lián)合Sanger測(cè)序法檢測(cè)PRSS1和SPINK1基因的7個(gè)熱點(diǎn)突變，能快速、高效地發(fā)現(xiàn)HP相關(guān)的遺傳基因突變位點(diǎn)，操作簡(jiǎn)便，有利于大規(guī)模人群篩查，收集高危人群流行病學(xué)數(shù)據(jù)，為完善HP診斷流程尋找參考依據(jù)。及早發(fā)現(xiàn)上述基因突變攜帶者，進(jìn)行科學(xué)管理，可以有效預(yù)防CP發(fā)作、胰腺功能損傷，有利于預(yù)防癌變，提高患者生活質(zhì)量。同時(shí)，對(duì)于那些沒(méi)有明顯的胰腺炎易感因素或家族史的患者，也建議進(jìn)行基因檢測(cè)，及早發(fā)現(xiàn)病因，并及時(shí)干預(yù)治療，改善患者預(yù)后。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

倫理批準(zhǔn)和知情同意：本研究涉及的所有試驗(yàn)均已通過(guò)青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)(文件號(hào)QYFYWZLL26902)。受試對(duì)象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書。

EthicsApprovalandPatientConsent： All experiments involved in this study have been reviewed and approved by The Medical Ethics Committee of The Affiliated Hospital of Qingdao University (Approval Letter No. QYFYWZLL26902). Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻(xiàn)：李曉宇、雷珂、王玲珍參與了研究設(shè)計(jì)；張文清、魏宏云、王彩霞和陳志紅參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions： The study was designed byLIXiaoyu,LEIKe,andWANGLingzhen. The manuscript was drafted and revised byZHANGWenqing,WEIHongyun,WANGCaixia, andCHENZhihong. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.