單細胞凝膠電泳檢測H2O2脅迫對蚯蚓體腔細胞DNA的損傷作用

王鳳琴，張來軍，李 聃

(1.隴東學院 生命科學與技術學院，甘肅 慶陽745000；2.海南熱帶海洋學院 水產(chǎn)與生命學院，海南 三亞 572022)

0 引言

蚯蚓是土壤中生物量最大的無脊椎動物，能夠分解轉(zhuǎn)化土壤中的有機物質(zhì)，改善土壤的結構，富集重金屬、殺蟲劑等各種污染物。現(xiàn)已被廣泛用于土壤環(huán)境的指示生物，進行土壤污染研究和監(jiān)測工作。通過觀察蚯蚓行為，皮膚、細胞和組織解剖學結構，檢測蚯蚓的生理生化反應相關酶類的變化，全面了解和診斷土壤重金屬污染和各種有機污染[1-3]；通過研究蚯蚓腸道中的微生物群落組成，探知蚯蚓對某些污染物的富集和轉(zhuǎn)化，促進土壤污染的修復[4]。蚯蚓細胞DNA損傷也是檢測污染物致癌、致畸、致突變效應的理想生物標志物，用于土壤污染遺傳毒性分析和環(huán)境風險預測[5-6]。由于人工飼養(yǎng)蚯蚓的方法簡便，甚至可以進行無菌培養(yǎng)[7]，體腔細胞分離便捷，分離的細胞數(shù)量多且純凈，可以開發(fā)用于更廣泛的研究用途。

單細胞凝膠電泳技術是檢測有核細胞DNA損傷最常用的方法之一，試驗周期短、樣品用量少、結果靈敏、快速高效，廣泛應用于新藥開發(fā)、遺傳毒性檢測以及農(nóng)藥等環(huán)境安全檢測。將蚯蚓體腔細胞與單細胞凝膠電泳技術結合進行的各種細胞毒理實驗也多有報道[8-9]。本實驗通過單細胞凝膠電泳技術分析過氧化氫對蚯蚓離體體腔細胞DNA損傷的影響，尋找兩者之間的相關性，為將蚯蚓替代其他實驗動物以初步篩選具有抗氧化功能、對細胞有保護作用的天然抗氧化劑的研究提供參考。

1材料和方法

1.1實驗材料與儀器

赤子愛勝蚓(Eiseniafetida)由河北省石家莊市晉州市蚯蚓養(yǎng)殖場提供，且在室內(nèi)飼養(yǎng)4周以上。H2O2為西安化學試劑廠分析純試劑；低熔點瓊脂糖(LMA)、正常熔點瓊脂糖(NMA，西班牙)、Triton X-100、肌氨酸鈉、二甲基亞砜(DMSO)均為Amresco分裝產(chǎn)品；愈瘡木酚甘油醚(Guaiacol Glyceryl Ether)及其余試劑均為國產(chǎn)分析純。倒置熒光顯微鏡(德國Leica 公司DMI3000)、電泳儀(Tanon EPS 300)、電泳槽(北京六一生物技術有限公司，DYCP-33A)。

1.2 實驗方法

1.2.1 蚯蚓體腔細胞的分離提取

挑選體質(zhì)量為400～500 mg、體長約6～7 cm，最好是還未長出生殖帶的健康蚯蚓進行實驗。將蚯蚓在25 ℃，濕度65%，暗環(huán)境下清腸24 h。經(jīng)過預實驗，H2O2濃度梯度設置為0、60、120、240、480 μmol·L-15個梯度。

根據(jù)Eyambe的方法[10]提取蚯蚓體腔細胞，略有改動。選2～3條蚯蚓，避開生殖帶，剪取體后部約三分之一長的軀干放入離心管，加入400 μL預冷的體腔細胞提取液(EM:5% C2H5OH，95% 生理鹽水，10 mg·mL-1Guaiacol glyceryl ether，2.5 mg·mL-1Na2EDTA，pH 7.3)；1 min后，加入3倍體積預冷的PBS緩沖液，棄蚯蚓，1 000 r·min-1低速離心3 min，沖洗體腔細胞，再加入適量預冷的LBSS緩沖液(75.5 mmol·L-1NaCl，4.8 mmol·L-1KCl，1.1 mmol·L-1MgSO4·7H2O，0.4 mmol·L-1KH2PO4，0.3 mmol·L-1Na2HPO4，4.2 mmol·L-1NaHCO3,pH 7.4)。顯微鏡下觀察細胞活力，瑞氏姬姆薩染液染色后觀察細胞形態(tài)。將細胞懸液混勻后平均分為5份，分別加入不同濃度的H2O2，室溫(25 ℃)脅迫60 min，脅迫結束后，離心收集細胞，重新懸浮于PBS溶液中，調(diào)整細胞密度，準備電泳。

1.2.2單細胞凝膠電泳

按Zhang等[11]改良方法鋪膠，將細胞懸液和1%低熔點膠1∶1混合均勻，鋪在預處理后的載玻片上。瓊脂糖凝固后，按常規(guī)單細胞凝膠電泳方法進行操作，從裂解、變性解旋、電泳以及中和的所有過程需在4 ℃下進行。EB染色20 min后，將載玻片置于熒光顯微鏡下觀察拍照，每個處理組隨機取約50個細胞的圖片。

對獲得的各處理組的彗星圖片經(jīng)CASP圖像分析軟件分析后，得到多項表示DNA損傷程度的參數(shù)。本實驗選用尾部DNA含量(TDNA%)、尾長(TailLength，TL)、尾矩(從彗星頭的右邊界到彗星尾部末端的距離與尾部 DNA 含量的乘積，TailMoment，TM)和Olive尾矩(從頭光密度重心到尾光密度重心的距離與尾部 DNA 含量的乘積，Olive TailMoment，TOM)4項作為本實驗衡量細胞DNA損傷程度的評價指標。

以上實驗重復3次。

1.3數(shù)據(jù)處理

用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計檢驗，單因素方差分析(ANOVA)進行組間差異分析，采用LSD(方差齊性)或 Dunnett (方差不齊)進行多重比較，將H2O2各濃度處理組與對照組之間進行差異顯著性分析，顯著性以 3 個水平表示，分別為P<0.05、P<0.01 和P<0.001。繪圖在 Excel中完成，數(shù)據(jù)以均值±標準差來表示。

2結果與分析

2.1蚯蚓的體腔細胞

蚯蚓體腔細胞在細胞免疫中發(fā)揮著重要的作用，其細胞免疫功能主要是通過體腔細胞執(zhí)行。所提取的蚯蚓體腔細胞懸浮液由于其中大量黃細胞的存在而呈淡黃色。鏡下觀察，可看到大量大小、形狀各不相同的細胞存在于懸浮液中，如圖1(a)所示。用甲醇固定細胞后，瑞氏姬姆薩染液染色，細胞質(zhì)被染成粉紫色，細胞核被染成深紫色，如圖1(b)所示。其中黃細胞(A)數(shù)量居多，個體最大，核質(zhì)比小，紫色核居中或偏于細胞一側，這類細胞胞質(zhì)中會積累核黃素和外來物質(zhì)，比其他體腔細胞對污染物更為敏感[12]；嗜中性細胞(B)個體較大，細胞核也較大，呈紫色；嗜堿性細胞(C)個體較小，數(shù)量較多，染色質(zhì)致密，核深紫色，核質(zhì)比小。

A黃細胞;B嗜中性細胞;C嗜堿性細胞(a) 未染色蚯蚓體腔細胞 (b) 瑞氏姬姆薩染液染色圖1 蚯蚓體腔細胞(400×)

2.2 單細胞凝膠電泳

典型的蚯蚓體腔細胞單細胞凝膠電泳圖如圖2所示。

(a)H2O2濃度為60 μmol·L-1 (b)H2O2濃度為240 μmol·L-1圖2 典型的蚯蚓體腔細胞單細胞凝膠電泳圖(400×)

從圖2可知，由于H2O2的作用，細胞核中 DNA 斷裂，在堿性電泳緩沖液作用下，DNA超螺旋結構松散，斷裂的 DNA 碎片從超螺旋結構中釋放出來，在電泳時移向陽極。熒光染色后，在顯微鏡下觀察到尾部朝向陽極的彗星樣圖像。彗星頭部和尾部的熒光強度、彗星全長及慧尾的長度等特征均能夠反映核DNA損傷的程度，或與H2O2脅迫的濃度相關。

用CASP軟件處理后，不同濃度H2O2各處理組彼此之間DNA損傷結果如圖3所示。用不同濃度H2O2脅迫蚯蚓體腔細胞1 h，進行單細胞凝膠電泳，CASP軟件處理后得到TDNA%、TL、TM和TOM4項參數(shù)值，與0、60、120、240和480 μmol ·L-1的H2O2濃度相對應的TDNA%分別為17.00±11.58、18.51±10.09、23.70±10.30、27.64±12.38和30.91±9.09；TL分別為24.85±9.73、28.46±8.46、30.00±7.13、31.71±7.65和34.12±3.78；TM分別為5.25±4.87、6.04±4.75、7.78±5.03、9.59±6.02和10.83±4.11；TOM分別為4.78±3.53、5.43±3.33、6.73±3.54、8.12±4.05和9.24±2.85。從圖3可以看出TDNA%、TL、TM、TOM值均隨H2O2濃度升高而提高。與對照組比較，除了最低濃度組60 μmol·L-1外，其他各處理組的TDNA%、TL、TM和TOM值都具有顯著差異(P<0.05)，且H2O2濃度越高，差異越顯著。最高濃度480 μmol·L-1的TDNA%比對照組提高了1.8倍(P<0.001)，TL提高了1.4倍(P<0.001)，TM提高了2.1倍(P<0.001)，TOM提高了1.9倍(P<0.001)。4組H2O2處理組組間的4項參數(shù)值差異隨濃度升高也均達到顯著水平(P<0.05)。實驗揭示，H2O2脅迫蚯蚓的離體體腔細胞1 h后，細胞DNA產(chǎn)生了明顯的損傷，H2O2濃度越高，損傷越嚴重；H2O2濃度與蚯蚓體腔細胞DNA損傷程度兩者之間呈顯著的劑量-效應關系。

注：*、**、***分別表示與空白對照相比，達到P<0.05、P<0.01、P<0.001顯著水平。圖3 不同濃度H2O2脅迫下蚯蚓體腔細胞單細胞凝膠電泳結果

圖3也表明，在本實驗條件下，表示細胞DNA損傷的4個參數(shù)TDNA%、TL、TM、TOM變化較為一致，均能很好地反映出H2O2濃度與細胞DNA損傷程度之間的相關性。

3 討論

蚯蚓是土壤中生物量最大的無脊椎動物，對環(huán)境污染物表現(xiàn)出極強的耐性和抗性，是生態(tài)毒理學和土壤污染研究理想的實驗材料。實驗室人工飼養(yǎng)蚯蚓方法簡便，還可以無菌培養(yǎng)，這些優(yōu)勢使蚯蚓作為實驗動物開發(fā)并用于更廣泛的研究創(chuàng)造了條件。李紅玉等[13]以秀麗線蟲為實驗材料，嘗試開發(fā)抗氧化藥物篩選試劑盒，他認為秀麗隱桿線蟲培養(yǎng)條件簡單，世代周期短，壽命短，容易實現(xiàn)高通量的優(yōu)勢，是體內(nèi)抗氧化藥物高通量篩選的理想模型。盡管蚯蚓也幾乎具有以上所有優(yōu)點，但極少有人做這方面的嘗試。

由于生物機體內(nèi)的H2O2通過生成OH自由基(·OH)，對細胞造成損害，抗氧化劑能清除外來或內(nèi)源性生成的活性氧(ROS)，拮抗DNA損傷，保護生物體完整性[14]。天然來源的抗氧化劑綠色環(huán)保，安全性高，用途廣泛[15-17]。對天然抗氧化劑的抗氧化活性的測試有很多方法，其中H2O2構建的細胞損傷模型，常常用于對細胞具有保護作用的抗氧化劑的研究[18-19]。本研究將提取出的蚯蚓體腔細胞，用不同濃度的H2O2處理，結合單細胞凝膠電泳技術檢測體腔細胞DNA損傷程度，揭示H2O2與蚯蚓體腔細胞損傷之間的相關性，為探索能拮抗自由基，保護細胞免受DNA損傷的天然抗氧化劑的初步篩選提供新思路，這種方法節(jié)省成本，高效，經(jīng)濟。單細胞凝膠電泳實驗結果揭示了隨H2O2濃度升高，代表DNA損傷程度的4個參數(shù)值TDNA%、TL、TM、TOM也隨之升高，H2O2濃度與蚯蚓體腔細胞DNA損傷程度兩者之間呈顯著的劑量-效應關系，可以進一步考慮將蚯蚓體腔細胞用于天然來源抗氧化劑抗氧化活性的研究。