基于D-loop序列分析的綠海龜人工繁育群體的遺傳多樣性

謝子強(qiáng)，肖寶華，廖寶林，姜怡薇，陳華靈，葉明彬

(1.廣東海洋大學(xué) 深圳研究院，廣東 深圳 518000；2.深圳市碧海藍(lán)天海洋科技有限公司，廣東 深圳 518000；3.廣東惠東海龜國家級自然保護(hù)區(qū)管理局，廣東 惠州 516359)

0 引言

在過去的20年里，生物多樣性的保護(hù)已經(jīng)成為一個(gè)緊迫的全球性問題。森林砍伐、過度開發(fā)、農(nóng)業(yè)擴(kuò)張和物種入侵是導(dǎo)致物種及種群嚴(yán)重減少的一些因素，并對食物網(wǎng)的功能和生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)性產(chǎn)生負(fù)面影響[1-4]。包括綠海龜(Cheloniamydas)在內(nèi)的眾多珍稀水生野生動物正在面臨嚴(yán)重的種群衰退[5-6]。綠海龜隸屬于海龜科(Cheloniidae)海龜屬(Chelonia)，是我國分布的5種海龜中種群數(shù)量最多的物種，現(xiàn)為我國一級保護(hù)動物[7-8]。為了應(yīng)對日益減少的綠海龜種群狀況，通過科學(xué)的人工繁育技術(shù)手段進(jìn)行擴(kuò)繁、野化、放歸和種群復(fù)壯，成為綠海龜種群資源恢復(fù)的一條行之有效的途徑[9]。早在20世紀(jì)70年代，美國(佛羅里達(dá))、日本、開曼(英屬)等國家和地區(qū)，先后實(shí)現(xiàn)綠海龜?shù)娜斯し庇?，并?yīng)用于野生種群修復(fù)和商業(yè)開發(fā)，其中開曼海龜農(nóng)場(CTF)已是全球最大、技術(shù)也最為成熟的綠海龜人工繁殖場[10]1638。而在國內(nèi)，廣東惠東海龜國家級自然保護(hù)區(qū)開展了大量綠海龜人工繁育的技術(shù)研究[11-12]，并在國內(nèi)首次全人工繁育出綠海龜子代[13]。雖然國內(nèi)外已有不少綠海龜人工繁育實(shí)踐的案例，但由于綠海龜繁育周期長，經(jīng)過多代繁育后綠海龜群體的遺傳多樣性是否會降低進(jìn)而影響繁育后代品質(zhì)，成為目前海龜人工繁育中亟待解決的問題。

D-loop序列是線粒體DNA中的一段非編碼區(qū)序列，具有母系遺傳，突變率高，進(jìn)化速率快且缺乏基因重組等特點(diǎn)[14]。相比COI、16s rRNA、cyt-b等傳統(tǒng)分子標(biāo)記能累積更多遺傳變異，是研究種內(nèi)群體遺傳多樣性及遺傳分化的理想標(biāo)記[15]。目前，國內(nèi)外已有許多學(xué)者通過D-loop序列標(biāo)記對全球綠海龜群體遺傳多樣性情況開展研究。Barbanti等[10]1637通過D-loop序列標(biāo)記對開曼群島筑巢的野生雌性綠海龜和開曼群島海龜農(nóng)場人工繁育(CTF)的雌性綠海龜?shù)臉颖具M(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)人工繁育種群和野生種群的多樣性沒有顯著差異，與野生種群相比，人工繁育單倍型變異水平甚至更高。Nurhartini等[16]20通過D-loop和16s rRNA序列研究了馬來西亞海域的野生綠海龜群體的遺傳多樣性情況。楊文嘉[6]5通過包括D-loop在內(nèi)的多種分子標(biāo)記對中國南海海域的175只綠海龜進(jìn)行了遺傳多樣性研究，初步探究了我國南海綠海龜種群遺傳結(jié)構(gòu)。但目前，有關(guān)國內(nèi)人工繁育綠海龜子代遺傳多樣性現(xiàn)狀仍未見報(bào)道。

本研究通過D-loop序列部分片段作為分子標(biāo)記，對廣東惠東海龜國家級自然保護(hù)區(qū)人工繁育的子代綠海龜群體的遺傳多樣性進(jìn)行研究，為建立相應(yīng)的綠海龜人工繁育遺傳譜系以及開展綠海龜種質(zhì)資源保護(hù)奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 樣品采集

本研究的人工繁育綠海龜組織樣品采自廣東惠東海龜國家級自然保護(hù)區(qū)，綠海龜樣本均為保護(hù)區(qū)近年來人工繁育的群體，其中包括2020年人工繁育1號群體26個(gè)樣本(編號G，為同一母龜子代)、2020年人工繁育2號群體26個(gè)樣本(編號H，為同一母龜子代)、2019年人工繁育群體26個(gè)樣本(編號LM，來自多個(gè)母龜子代)、2017年人工繁育群體21個(gè)樣本(編號C，為同一母龜子代)，共計(jì)99個(gè)樣本。采集樣品的綠海龜均為活體，剪取綠海龜前鰭少量上皮組織并保存在無水乙醇中，剪取完畢后用安多福溶液對剪取的傷口進(jìn)行消毒。采集的樣品除了記錄編號以外，同時(shí)記錄相應(yīng)取樣海龜?shù)碾娮有酒柎a等其他相關(guān)信息。

1.2 基因組總DNA的提取

使用北京擎科生物科技有限公司生產(chǎn)的動物基因組DNA提取試劑盒(TSP201-200)提取海龜上皮組織樣品的DNA，所提取的DNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)合成

D-loop基因的PCR引物參考Nurhartini 等[16]21的研究論文。引物由北京擎科生物科技有限公司合成，上下游引物序列分別為TCR-5：TTGTACATCTACTTATTTACCAC(5′-3′)和TCR-6：GTAAGTAAAACTACCGTATGCCAGGTTA(5′-3′)。

1.4 PCR擴(kuò)增和DNA測序

PCR反應(yīng)體系反應(yīng)總體積50 μL：1.1×T3 Super PCR Mix(擎科生物) 47 μL，上下游引物各1 μL,DNA模板1 μL。PCR反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。將擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(2 μL樣品+ 6 μL溴酚藍(lán))，300 V電壓下12 min，獲取鑒定膠圖，通過膠圖確定擴(kuò)增條件是否單一，是否彌散，有無非特異性條帶。選取擴(kuò)增質(zhì)量較高的PCR產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序，獲得測序峰圖和堿基序列。

1.5 序列分析

2 結(jié)果與分析

2.1 序列多態(tài)性分析

本研究擴(kuò)增獲得了99條D-loop基因序列，排序去除兩端冗余序列后得到堿基片段在390～395 bp之間。在這99條D-loop基因序列中T、C、A和G堿基的平均含量分別為35.3%、14.7%、32.8%和17.2%，其中A+T含量(68.1%)明顯高于C+G含量(31.9%)，堿基組成具有明顯的偏向性(表1)。

表1 人工繁育4個(gè)群體D-loop基因片段的堿基含量比例

2.2 群體遺傳多樣性及單倍型分析

在99條D-loop基因序列中，共檢測出18個(gè)變異位點(diǎn)數(shù)，每個(gè)群體的單倍型多樣性指數(shù)(Hd)在0.000～0.212之間，99個(gè)樣本的單倍型多樣性指數(shù)為0.634；每個(gè)群體的核苷酸多樣性指數(shù)(π)在0.000 00～0.001 11之間，99個(gè)樣本的核苷酸多樣性指數(shù)為0.018 58(表2)。根據(jù)Grant和Bowen[17]的研究報(bào)道，種群單倍型多樣性指數(shù)以0.5為臨界值，核苷酸多樣性指數(shù)以0.001為臨界值，二者的值越大，群體的多樣性程度越高。本研究每個(gè)群體內(nèi)的種群單倍型多樣性和核苷酸多樣性均未超過臨界值，表明其每個(gè)種群內(nèi)的遺傳多樣性差異較小。但以99個(gè)樣本為一個(gè)總?cè)后w來算，其種群單倍型多樣性和核苷酸多樣性均超過臨界值，總?cè)后w的遺傳多樣性差異較大。

表2 綠海龜人工繁育4個(gè)群體D-loop基因的遺傳多樣性指數(shù)

在99條D-loop基因序列中共檢測出3個(gè)單倍型，其中共享單倍型有2個(gè)(Hap_1和Hap_3)。從單倍型網(wǎng)絡(luò)中介圖(圖1)可以看出，各單倍型之間的突變步數(shù)為1～16步不等，Hap_2僅含有G組群體的所有樣本，Hap_1含有C組和部分LM組群體的樣本，Hap_3含有H組和部分LM組群體的樣本。通過在NCBI上進(jìn)行的序列比對，并查閱有關(guān)太平洋地區(qū)海龜單倍型分類的國際命名編號[18-19]，確認(rèn)Hap_1對應(yīng)的單倍型為CMP 18，Hap_2對應(yīng)的單倍型為CMP 95，Hap_3對應(yīng)的單倍型為CMP 49。

圖1 基于D-loop基因序列的綠海龜人工繁育4個(gè)群體單倍型網(wǎng)絡(luò)中介圖

2.3 遺傳分化和基因流

從群體間的遺傳分化結(jié)果(表3)可以看出，G組和H組間的群體遺傳分化系數(shù)(Fst)值最大(1.000 0)；其次為G組和LM組間、C組和LM組之間的Fst值，均大于0.25；H組和LM組之間的Fst值最小，在0.05與0.15之間。Fst是一個(gè)衡量群體間遺傳分化程度的參數(shù)：Fst<0.05表示分化較小，0.05

表3 基于D-loop基因的群體間Fst(對角線左下方)和Nm值(對角線右上方)

表4 人工繁育4個(gè)群體D-loop序列的種群AMOVA分析

2.4 基于D-loop序列片段對綠海龜人工繁育群體的系統(tǒng)進(jìn)化分析

以棱皮龜(Dermochelyscoriacea)作為外源種(GenBank序列號：AF121964.1)，加入Nurhartini等[16]21研究報(bào)道中的3個(gè)馬來西亞綠海龜樣本的D-loop片段序列(GenBank序列號：HQ377528.1、HQ377535.1、HQ377538.1)，采用鄰位連接法構(gòu)建綠海龜人工繁育4個(gè)群體的D-loop系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)果顯示G組群體獨(dú)立成為一支，并與馬來西亞的2個(gè)樣本聚成第一個(gè)大分支；C組群體的樣本與LM12、LM13和LM24聚為一支，剩余的LM組群體樣本與H組以及馬來西亞的1個(gè)樣本聚為一支，再合并為第二個(gè)大分支。

圖2 利用D-loop序列數(shù)據(jù)構(gòu)建的分子系統(tǒng)進(jìn)化NJ樹

3 討論

在野生環(huán)境中，絕大部分海龜都有產(chǎn)卵洄游的特性，成年雌性海龜會在正常情況下準(zhǔn)確地找回其出生地進(jìn)行繁殖產(chǎn)卵活動，每次產(chǎn)卵前可與多只公龜進(jìn)行交配以豐富后代的遺傳多樣性[21-22]。綠海龜從出生一般要經(jīng)歷20～50年才達(dá)到性成熟，繁育周期長[23]。綠海龜?shù)倪@些繁殖特性給其人工繁育帶來了一定難度。本研究材料為廣東惠東海龜國家級自然保護(hù)區(qū)近年來人工繁育群體，其父本、母本均為海龜保護(hù)區(qū)經(jīng)野外采卵、人工孵化及圈養(yǎng)至性成熟的海龜。與其他經(jīng)濟(jì)性水生野生動物不同，綠海龜超長的性成熟繁育周期使其無法快速開展全人工選育工作，無法采集到更多世代的繁育樣本進(jìn)行深入的遺傳結(jié)構(gòu)分析。本研究的人工繁育4個(gè)群體中，G、H和C組群體均各自來源于同一個(gè)母本繁殖的后代，其D-loop基因來自母系，單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)均為0，其群體內(nèi)不存在遺傳差異；LM群體為多個(gè)母本后代的混合體，根據(jù)記錄顯示該種群母本數(shù)有2個(gè)以上，這也與該群體的單倍型有2個(gè)，群體內(nèi)存在一定遺傳差異的分子數(shù)據(jù)結(jié)果相吻合。因此僅以母系遺傳的線粒體分子標(biāo)記無法直接評估同個(gè)母本所繁育子代的遺傳多樣性，需要結(jié)合微衛(wèi)星等非母系遺傳的分子標(biāo)記來進(jìn)行評估。

早在20世紀(jì)90年代，Bowen等[21]871學(xué)者通過對全球綠海龜線粒體基因型研究最早提出全球綠海龜種群形成了2個(gè)主要的地理群體，一個(gè)為大西洋-地中海地理群體，另一個(gè)為印度-太平洋地理群體。經(jīng)過近30年的研究，尤其是通過更多的現(xiàn)代分子遺傳學(xué)技術(shù)手段的佐證，該理論得到了完善和補(bǔ)充，并進(jìn)一步明確了大西洋、地中海、印度洋、西太平洋、中太平洋和東太平洋等相對較小區(qū)域的綠海龜種群遺傳結(jié)構(gòu)[24-27]。Jensen等[28]通過收集全球127個(gè)棲息地的4 878個(gè)綠海龜樣本的mtDNA數(shù)據(jù)集，對種群的聯(lián)通性和基因流動障礙進(jìn)行了深入的研究，并通過D-loop序列歸納了11個(gè)綠海龜線粒體DNA譜系。本研究的人工繁育群體的3種單倍型，分別與Jensen研究報(bào)道中的日本譜系(CMP 95)和印度洋-太平洋譜系(CMP 18和CMP 49)的單倍型相一致，符合廣東惠東海龜國家級自然保護(hù)區(qū)親本海龜來源情況。中國華南沿岸地區(qū)是日本譜系、印度洋-太平洋譜系和西太平洋中部譜系3個(gè)地理譜系綠海龜洄游的交界區(qū)域，從遺傳育種的角度看，在該地區(qū)開展綠海龜?shù)倪z傳雜交育種有利于提升本地區(qū)海龜品種的遺傳多樣性水平。

不同群體間的遺傳分化系數(shù)值和基因流值反映了其分化狀況的程度,本研究的群體間具有較高的遺傳分化現(xiàn)象，G、H和C組群體間的值均為1，這表明這3組群體間存在完全分化的遺傳現(xiàn)象，這也從側(cè)面說明用于選育的母本具有豐富的遺傳多樣性。同時(shí)，選擇Nurhartini等[16]24研究報(bào)道中的3個(gè)遺傳分化度最高的馬來西亞野生綠海龜樣本與本研究的樣本進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)G組樣本與馬來西亞2個(gè)樣本聚成一個(gè)大分支，而H組與大部分LM組和另一個(gè)馬來西亞樣本聚為一個(gè)小分支，說明本研究的人工繁育種群與東南亞海域野生種群之間沒有明顯的遺傳分化。Barbanti等[10]1644研究報(bào)道指出開曼群島筑巢的野生種群和開曼群島海龜農(nóng)場(CTF)人工繁育種群的多樣性沒有顯著差異，人工繁育種群單倍型變異水平甚至更高，其開展人工繁育的時(shí)間已經(jīng)長達(dá)50年。因此本研究結(jié)果表明，借鑒國外綠海龜人工繁育的經(jīng)驗(yàn)，通過分子標(biāo)記技術(shù)對開展選育的綠海龜親本遺傳譜系的構(gòu)建，開展科學(xué)合理的選育，可保持繁育子代遺傳多樣性結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，后代群體在未來幾十年中仍將具有豐富的遺傳進(jìn)化潛力。