煙酰胺及聯(lián)合伊曲康唑體外抗煙曲霉活性研究

陳顯振 朱信霖 姜偉偉 扈東營(yíng) 張克明 方文捷 潘煒華 劉曉剛 廖萬(wàn)清

(1.海軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科，上海 200003; 2.上海市醫(yī)學(xué)真菌分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200003)

【關(guān)鍵字】 煙曲霉；煙酰胺；伊曲康唑；聯(lián)合治療

近年來(lái)，隨著器官移植、免疫抑制劑的應(yīng)用、放化療等醫(yī)療手段的不斷發(fā)展，侵襲性曲霉病發(fā)病率逐年上升[1]。煙曲霉是侵襲性曲霉病的主要病原體，占比約90%，其次為黃曲霉和黑曲霉。目前治療該疾病的藥物較為局限，主要有唑類、多烯類和棘白菌素類藥物。肝腎毒性、電解質(zhì)紊亂等不良反應(yīng)限制了兩性霉素B的應(yīng)用[2]，而棘白菌素類藥物因價(jià)格昂貴、缺乏口服劑型，臨床應(yīng)用受限[3]。自1997年首次報(bào)道煙曲霉伊曲康唑耐藥株以來(lái)，全世界多個(gè)國(guó)家陸續(xù)報(bào)道煙曲霉對(duì)唑類耐藥現(xiàn)象，且呈上升趨勢(shì)[4]。因此，臨床亟需發(fā)掘新的抗真菌藥物及抗真菌藥物增敏劑。

煙酰胺為維生素B3體內(nèi)衍生物，可用于糙皮病、神經(jīng)退行性疾病和皮膚癌等臨床疾病的治療與預(yù)防[5-7]，同時(shí)，煙酰胺還可用于農(nóng)作物真菌病害的防治，如啶酰菌胺(煙酰胺類內(nèi)吸收性殺菌劑)通過(guò)抑制菌絲及孢子生長(zhǎng)，從而對(duì)農(nóng)作物真菌性侵害發(fā)揮良好的防治效果[8]。既往研究表明煙酰胺對(duì)多種微生物具有抑制作用[9-14]，同時(shí)煙酰胺還可以增強(qiáng)青蒿素、氯喹、乙胺的抗瘧作用[11]以及氟康唑的抗真菌活性[13]。然而煙酰胺對(duì)煙曲霉的抗真菌能力尚不明確，與伊曲康唑聯(lián)用是否具有增效能力也未確定。本研究通過(guò)體外藥敏實(shí)驗(yàn)對(duì)煙酰胺的抗煙曲霉活性及聯(lián)合對(duì)伊曲康唑的增效活性進(jìn)行探索，為臨床抗真菌用藥提供新思路。

1 材料和方法

1.1 菌株

15株煙曲霉，均來(lái)自上海市醫(yī)學(xué)真菌分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種庫(kù)。

1.2 抗真菌藥物

伊曲康唑(ITR)、煙酰胺(NAE)，均購(gòu)于Sigma。ITR用二甲基亞砜(DMSO)溶解并配成6 400 μg/mL的儲(chǔ)存液，NAE用生理鹽水配成200 mg/mL的儲(chǔ)存液。

1.3 抗真菌藥敏試驗(yàn)

伊曲康唑及煙酰胺單獨(dú)作用于煙曲霉的藥敏試驗(yàn) 根據(jù)CLSI M38-A2方案[15]進(jìn)行煙曲霉的體外抗真菌藥物敏感性測(cè)定(工作濃度梯度分別為：ITR 0.12～16 μg/mL，NAE 0.8～102.4 mg/mL)；質(zhì)控菌株為克柔念珠菌ATCC 6258。48 h后觀察結(jié)果，與陽(yáng)性對(duì)照孔相比≥50%生長(zhǎng)抑制所對(duì)應(yīng)的藥物濃度為質(zhì)控菌株的MIC，100%抑制煙曲霉生長(zhǎng)所對(duì)應(yīng)的濃度為煙曲霉的MIC值。

伊曲康唑聯(lián)合煙酰胺的抗煙曲霉活性參照CLSI M38-A2方案并稍作修改進(jìn)行菌株藥物敏感性測(cè)定，將藥物儲(chǔ)存液用RPMI-1640稀釋為4倍最大工作濃度(工作濃度梯度分別為：ITR 0.00375～0.5 μg/mL，NAE 0.2～25.6 mg/mL)，倍比稀釋為所需濃度梯度。按照如下方法進(jìn)行操作：使用排槍分別取50 μL倍比稀釋的伊曲康唑工作液，自高濃度至低濃度依次加至96孔板的第1～8列；自高濃度到低濃度的順序，取50 μL倍比稀釋后的煙酰胺工作液依次加入96孔板的第1～8行；向已加藥液孔分別加入100 μL菌懸液；第11列為陰性對(duì)照(只加200 μL RPMI-1640)，第12列為生長(zhǎng)對(duì)照(100 μL菌懸液加100 μL RPMI-1640)。37℃恒溫培養(yǎng)48 h，用放大鏡觀測(cè)儀判定結(jié)果。

聯(lián)合用藥效能評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：分級(jí)抑制指數(shù)(FICI)=MIC(A藥聯(lián)合)/MIC(A藥單用)+MIC(B藥聯(lián)合)/MIC(B藥單用)。當(dāng)FICI≤0.5時(shí)，兩藥為協(xié)同作用；當(dāng)0.54時(shí)，兩藥為拮抗作用。

1.4 RT-qPCR檢測(cè)煙曲霉膜蛋白及外排泵相關(guān)基因表達(dá)水平

以煙曲霉標(biāo)準(zhǔn)株Af293為研究對(duì)象，向SDB培養(yǎng)基中加入孢子，使最終菌密度為(1～5)×105CFU/mL，220 r/min，35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后，分別加入煙酰胺與伊曲康唑使每管藥物濃度達(dá)到亞致死濃度(煙酰胺12.8 mg/mL，伊曲康唑0.12 μg/mL)，培養(yǎng)8 h后收集菌絲[17]。參照絲狀菌RNA抽提和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TIANGEN)操作得到cDNA，對(duì)膜蛋白基因cyp51A、erg3、erg24、erg25及外排泵基因cdr1B基因表達(dá)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，內(nèi)參為GAPDH,反應(yīng)過(guò)程：95℃，3 min；95℃ 5s、60℃ 10s、72℃ 15s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，相關(guān)引物見表1。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1 伊曲康唑及煙酰胺單獨(dú)作用于煙曲霉的藥敏試驗(yàn)

體外藥物敏感性試驗(yàn)表明，煙酰胺對(duì)煙曲霉具有抑菌作用，MIC為12.8～25.6 mg/mL。15株煙曲霉中有2株(CZZJ100527、CZZJ100528)伊曲康唑的MIC>2 μg/mL，對(duì)伊曲康唑耐藥株，其余MIC為0.25～1 μg/mL ，為伊曲康唑敏感株(見表2)。

2.2 伊曲康唑聯(lián)合煙酰胺的抗煙曲霉活性

煙酰胺聯(lián)合伊曲康唑?qū)?5株煙曲霉的MIC值見表2。煙酰胺的MIC值由12.8～25.6 mg/mL降至0.2～6.4 mg/mL，伊曲康唑的MIC值由0.25～16 μg/mL降至0.00375～0.12 μg/mL。煙酰胺聯(lián)合伊曲康唑的FICI值均小于0.5，表明煙酰胺聯(lián)合伊曲康唑具有協(xié)同作用。

表2 煙酰胺單用及聯(lián)合伊曲康唑作用于煙曲霉的MIC值

2.3 RT-qPCR檢測(cè)煙曲霉膜蛋白及外排泵相關(guān)基因表達(dá)水平

通過(guò)對(duì)膜蛋白及外排泵相關(guān)基因進(jìn)行相對(duì)表達(dá)分析，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，煙酰胺加藥組膜蛋白基因cyp51A、erg3、erg24、erg25及外排泵基因cdr1B的表達(dá)水平顯著下調(diào)；與伊曲康唑加藥組相比，聯(lián)合加藥組cyp51A、erg3、erg24、erg25、cdr1B的mRNA表達(dá)水平顯著降低。說(shuō)明NAE作用于Af293可下調(diào)膜蛋白基因cyp51A、erg3、erg24、erg25及外排泵基因cdr1B的表達(dá)水平，而且NAE對(duì)ITR降低Af293膜蛋白基因cyp51A、erg3、erg24、erg25及外排泵基因cdr1B的mRNA水平有增效作用(見圖1)。

圖1 AF293加藥組與不加藥組膜蛋白及外排泵蛋白的基因相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

近年來(lái)，隨著免疫抑制人群數(shù)量的不斷增加，侵襲性曲霉病的發(fā)病率也不斷升高，全世界年發(fā)病率約為25萬(wàn)例[18]，煙曲霉是侵襲性曲霉病最常見的病原體[19]。很多研究報(bào)道煙酰胺具有保護(hù)神經(jīng)、抗炎、抗糖尿病、保護(hù)皮膚及緩解腎功能不全等功能[20]，近些年發(fā)現(xiàn)煙酰胺對(duì)一些微生物如結(jié)核分枝桿菌、HIV、念珠菌、隱球菌等具有抑制作用[9,13,21]，然而煙酰胺對(duì)煙曲霉的抑制情況尚無(wú)相關(guān)報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)，NAE對(duì)煙曲霉具有抑制作用，MIC為12.8～25.6 mg/mL，與煙酰胺對(duì)念珠菌的抑菌濃度相近[13]。伊曲康唑?yàn)榕R床曲霉病的常用藥，然而自1997年Denning[22]課題組首次報(bào)道檢出對(duì)伊曲康唑耐藥的煙曲霉后，全球范圍內(nèi)有關(guān)煙曲霉對(duì)伊曲康唑耐藥的報(bào)道日漸增多。有研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)藥物聯(lián)用方式，不僅可以增效還可以逆轉(zhuǎn)耐藥株，如漢防己甲素與伊曲康唑聯(lián)合使用時(shí)，漢防己甲素可增加伊曲康唑抑制煙曲霉的作用同時(shí)可逆轉(zhuǎn)伊曲康唑耐藥株[23]，煙酰胺聯(lián)合氟康唑也具有協(xié)同抑制白念珠菌及逆轉(zhuǎn)氟康唑耐藥株的作用[13]。因此本研究對(duì)煙曲霉進(jìn)行煙酰胺聯(lián)合伊曲康唑的藥敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)煙酰胺可增強(qiáng)伊曲康唑抑制煙曲霉的作用，且對(duì)伊曲康唑耐藥煙曲霉菌株具有逆轉(zhuǎn)耐藥的作用，為伊曲康唑增敏劑研究提供了新的思路。

煙曲霉對(duì)唑類藥物耐藥機(jī)制主要有唑類藥物靶蛋白(Cyp51A)過(guò)表達(dá)及外排泵蛋白的過(guò)表達(dá)等[24]。因此可通過(guò)抑制麥角甾醇的生物合成及抑制外排泵基因的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)唑類藥效[25]。Cyp51A為14-α-羊角甾醇去甲基酶，唑類與該酶結(jié)合抑制該酶活性，影響麥角甾醇合成及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能，Erg3、Erg24、Erg25均為麥角甾醇合成過(guò)程中的催化酶[26]。Cdr1B屬于三磷酸腺苷結(jié)合盒(ATP-binding cassette)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族，英國(guó)Paul Bowyer課題組發(fā)現(xiàn)該蛋白的高表達(dá)可以增加煙曲霉對(duì)伊曲康唑的耐藥性[27]。我們對(duì)部分麥角甾醇合成通路蛋白的基因cyp51A、erg3、erg24、erg25及外排泵基因cdr1B進(jìn)行了加藥與不加藥的RT-qPCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單用煙酰胺時(shí)，這些基因的表達(dá)較對(duì)照組下調(diào)，聯(lián)合用藥時(shí)，這些基因較伊曲康唑組下調(diào)，由此推測(cè)，煙酰胺可能通過(guò)抑制膜蛋白及外排泵相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抑菌作用，從而聯(lián)合伊曲康唑發(fā)揮抗煙曲霉的增效作用，但具體的信號(hào)通路和作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。綜上，本研究為煙曲霉感染患者的臨床用藥提供新的思路。