不同化學(xué)型樟樹葉揮發(fā)油及純露對(duì)微生物的抑菌活性

楊素華，黎貴卿，陸順忠，蘇驪華，黨中廣

（1.廣西特色經(jīng)濟(jì)林培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530002；2.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，廣西南寧 530002）

食品加工通常采用各種包裝技術(shù)和方法來保存食物，但微生物污染仍不可避免[1]。據(jù)估計(jì)，全世界每年約有10% ～20%的食品腐敗源于微生物影響。添加食品防腐劑仍是目前防止食品腐爛變質(zhì)的重要手段之一[2-4]。食品防腐劑包括天然防腐劑和化學(xué)防腐劑。天然防腐劑是從植物、動(dòng)物或微生物代謝產(chǎn)物提取的抗菌活性物質(zhì)，具有高效、安全等化學(xué)防腐劑無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，越來越受到人們的青睞。

芳香植物揮發(fā)油是通過水蒸氣蒸餾、溶劑萃取和微波輔助等手段提取的具有一定芳香氣味的次生代謝物質(zhì)的總稱，由幾十到上百種化合物組成，主要成分有單萜、倍半萜及其衍生物等[5]。研究發(fā)現(xiàn)，芳香植物揮發(fā)油抑菌效果較明顯，對(duì)多種菌株均有顯著的抑制作用，被廣泛應(yīng)用于食品加工、醫(yī)療保健、化妝品和農(nóng)藥研發(fā)等方面[6-8]。純露是芳香植物揮發(fā)油的副產(chǎn)品，含有少量的揮發(fā)油成分及活性物質(zhì)，具有良好的抗菌、驅(qū)蟲及保健作用[2]。

樟樹（Cinnamomum camphora）作為芳香植物之一，可從其根、干、枝、葉和果中提取揮發(fā)油，簡(jiǎn)稱精油。按樟樹葉揮發(fā)油的主成分可將樟樹分為芳樟型、油樟型、腦樟型、龍腦型、檸檬醛型和異樟型[9-10]等。研究表明，樟樹葉揮發(fā)油中主要含有1，8-桉葉油素、芳樟醇、松油醇、樟腦、龍腦和檸檬醛等化學(xué)成分[11-12]，具有一定的殺菌、消毒效果，是食品、香精香料和醫(yī)藥等的重要原料[13]?？芤圾Q[14]通過篩選特定的香樟內(nèi)生真菌對(duì)香樟精油組分進(jìn)行生化修飾轉(zhuǎn)化，能顯著提高精油的抗菌和抗氧化作用。王芳等[15]采用微量稀釋法測(cè)定香樟精油抑菌活性，發(fā)現(xiàn)精油對(duì)真菌有較高的抑制活性。付敬敬[16]通過掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡直接觀察到香樟精油對(duì)大腸埃希菌（Escherichia coli）生物膜數(shù)量及形態(tài)有顯著抑制作用。采用抑菌圈試驗(yàn)和試管二倍稀釋法研究香樟精油抑菌活性及其抑菌機(jī)理，發(fā)現(xiàn)香樟精油對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中度敏感，其抑菌機(jī)制可能是破壞細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，引起內(nèi)含物滲漏，導(dǎo)致菌體缺乏營養(yǎng)物質(zhì)而死亡[17-18]。

芳樟醇有左、右旋兩種光異構(gòu)體，由于天然芳樟醇有旋光性的特點(diǎn)，特別是左旋體在醫(yī)藥上的“生物效價(jià)”要比合成芳樟醇優(yōu)異，且芳樟醇還具有抗菌、抗病毒和鎮(zhèn)靜等作用[19]。張婷[20]在篩選抗腫瘤小分子化合物時(shí)，發(fā)現(xiàn)天然小分子化合物芳樟醇能抑制多種人淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖，能殺傷處于靜止期的白血病細(xì)胞。王新偉等[21]采用紙片擴(kuò)散法以及雙倍稀釋法研究牛至油、香芹酚和檸檬醛等對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細(xì)菌的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)檸檬醛對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用。馬英姿等[22]采用杯蝶法測(cè)定樟樹葉精油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)樟樹精油具有較好的抑菌效果，精油中的成分冰片有很強(qiáng)的抗菌作用。樟樹葉揮發(fā)油具有良好的抑菌殺菌效果，而樟樹葉純露作為樟樹葉揮發(fā)油的副產(chǎn)物，一般都作為廢液丟棄。

本研究通過試管法和紙片法測(cè)定檸檬醛型、芳樟醇型（左旋、右旋）、油樟型和龍腦型樟樹葉揮發(fā)油和純露對(duì)幾種常見食品微生物的抗菌效果，以期為樟樹葉揮發(fā)油和純露作為食品添加劑、防腐保鮮劑及消毒殺菌劑等綜合開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 儀器

氣相色譜儀（Agilent 7890A）；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent 7890B-5977A）；電子天平（T-500，常熟雙杰測(cè)試儀器廠）；恒溫（30 ～38 ℃）細(xì)菌培養(yǎng)箱（HYQX-II，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；恒溫（20 ～28 ℃）霉菌培養(yǎng)箱（MJ-300，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；冰箱（BCD-212，西門子有限公司）；高壓滅菌鍋（SX-500，TOMY 公司）；高溫干燥烤箱（300 ℃）（BPG-9050AH，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；恒溫（30 ～38 ℃）水浴鍋（HH-6，常州國華儀器有限公司）；電熱套（98-I-B，天津市泰斯特儀器有限公司）；顯微鏡（BH2-U，OLYMPUS 公司）；0．2 μm 薄膜篩過濾除菌器（MILLEX GP）；圓底燒瓶、試管、量筒和燒杯等玻璃儀器。

1．1．2 樣品

樣品采自廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院海拔85 ～255 m 的種質(zhì)資源庫（108°57′E，23°55′N）。2020年9月和2021年5月，采集同1 株樟樹東、南、西、北和中5個(gè)方位的新鮮葉，每種化學(xué)型樟樹采集3 株。新鮮葉經(jīng)廣西林科院陸順忠教授鑒定為檸檬醛型、芳樟醇型（左旋、右旋）、油樟型和龍腦型樟樹葉。每株采樣約500 g，用塑料袋密封，并置于4 ℃冰箱低溫保存，待測(cè)。

1．1．3 試劑及培養(yǎng)基

培養(yǎng)基均源自北京陸橋技術(shù)有限公司，為胰酪大豆蛋白胨液體培養(yǎng)基（批號(hào)201010）、胰酪大豆蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)190815）、沙氏液體培養(yǎng)基（批號(hào)190326）和沙氏瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)200927）。其余試劑包括氯化鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）和蒸餾水。

1．1．4 對(duì)照品

陽性對(duì)照品包括：復(fù)方新諾明（400 mg 磺胺甲惡唑、80 mg 甲氧芐胺嘧啶）和抗真菌：洗必泰（氯已定含量＞99%）；陰性對(duì)照品為生理鹽水；固體溶劑對(duì)照品為二甲亞砜。

1．1．5 菌株

金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽性細(xì)菌）[CMCC(B)26003]；枯草芽孢桿菌（革蘭氏陽性細(xì)菌）（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]；大腸埃希菌（革蘭氏陰性細(xì)菌）[CMCC(B)44102]；銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10104]；白色念珠菌（真菌）（Candida albicans）[CMCC(B)98001]。以上標(biāo)準(zhǔn)菌株均由廣東環(huán)凱科技有限公司提供，試驗(yàn)所用菌株由凍干質(zhì)控菌種轉(zhuǎn)種所生，是本種源的5代內(nèi)后裔。

1．2 方法

1．2．1 揮發(fā)油和純露的提取

將采集到的新鮮葉子剪至1 ～2 cm，稱取200 g，葉子和去離子水按1∶2．5 比例放入1 000 mL 圓底燒瓶內(nèi)，加沸石，接上揮發(fā)油測(cè)定器及球形冷凝管，按《中國藥典》[23]揮發(fā)油測(cè)定法（甲法）進(jìn)行水蒸氣蒸餾3．5 h，得揮發(fā)油和純露。所得精油用一次性針管抽吸水分，用無水硫酸鈉脫去殘余水分。揮發(fā)油和純露置于5 ℃冰箱，避光密封保存。

1．2．2 揮發(fā)油成分分析

升 溫 程序：色譜柱：HP-INNOWAX（30 m ×0．32 mm，0．5 μm）；HP-5（30 m×0．32 mm，0．25 μm）。初始溫度為70 ℃，以1．5 ℃/min升至100 ℃；以3 ℃/min升至135 ℃，保持30 min；再以5 ℃/min 升至200 ℃；最后以10 ℃/min 升至250 ℃，保持10 min。進(jìn)樣量0．2 μL，進(jìn)樣口溫度250 ℃，分流比100∶1，流速1mL/min。

質(zhì)譜條件：電離方式E1，電離能量70 eV，離子源溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍30 ～450 amu。

1．2．3 培養(yǎng)基的制備

取胰酪大豆蛋白胨液體培養(yǎng)基30 g，胰酪大豆蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基40 g，沙氏液體培養(yǎng)基50 g，沙氏瓊脂培養(yǎng)基70 g，分別用蒸餾水配成1 L 溶液，高壓滅菌，密封存放，備用。

1．2．4 菌懸液的制備

取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠膿假單孢菌和枯草芽孢桿菌凍干質(zhì)控菌種的新鮮培養(yǎng)物接種至胰酪大豆蛋白胨液體培養(yǎng)基，置于35 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)入無菌生理鹽水，稀釋，倒入胰酪大豆蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，置于35 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h；取白色念珠菌凍干質(zhì)控菌種的新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏液體培養(yǎng)基，置于25 ℃恒溫箱培養(yǎng)48 h，轉(zhuǎn)入無菌生理鹽水，稀釋，倒入沙氏瓊脂培養(yǎng)基，置于25 ℃恒溫箱培養(yǎng)48 h。試驗(yàn)菌懸液細(xì)菌密度約為50 ～100 cfu/mL。

1．2．5 抑菌性試驗(yàn)

采用試管法進(jìn)行抗金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、綠膿桿菌和枯草芽孢桿菌試驗(yàn)。每種揮發(fā)油、純露、陽性試驗(yàn)藥液（復(fù)方新諾明）和陰性試驗(yàn)藥液處理各準(zhǔn)備滅菌玻璃試管5 支，每管加入胰酪大豆蛋白胨液體培養(yǎng)基2 mL。取已配制和除菌處理過的揮發(fā)油、純露、陽性試驗(yàn)藥液（復(fù)方新諾明）及陰性試驗(yàn)藥液各2 mL 加入第l 管，混勻后取2 mL 加入第2 管，各管按稀釋度2、4、8、16 和32 倍稀釋至第5管，第5管混勻后棄去2 mL；每管加入細(xì)菌密度約為50 ～100 cfu/mL 的試驗(yàn)菌懸液0．1 mL。另取2 支試管作對(duì)照（CK），分別加入2 mL 胰酪大豆蛋白胨液體培養(yǎng)基和0．1 mL 菌懸液作有菌無藥對(duì)照管，2 mL待檢藥液和2 mL 胰酪大豆蛋白胨液體培養(yǎng)基作有藥無菌對(duì)照管。置35 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h。在對(duì)照管無異常（有菌無藥對(duì)照管混濁有菌生長，有藥無菌對(duì)照管澄明無菌生長）的前提下觀察各試驗(yàn)管細(xì)菌生長狀況。培養(yǎng)液有紊絮狀混濁或豆腐渣樣凝塊者為有菌生長，培養(yǎng)液澄清透明、且搖勻后仍液澄清透明者為無菌生長或菌生長受抑制。無菌生長或菌生長受抑制的最低待檢藥物濃度為最低抑菌濃度（MIC）。取無菌生長或菌生長受抑制試管內(nèi)的培養(yǎng)物0．1 mL注入平皿，加入不超過45 ℃的胰酪大豆蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基15 ～20 mL，冷卻后倒置于35 ℃恒溫箱，培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長情況。生長菌落不超過5 個(gè)的瓊脂培養(yǎng)基里的藥物濃度，為該待檢藥物的最低殺菌濃度（MBC）[24]。

抗白色念珠菌試驗(yàn)。每種揮發(fā)油、純露、陽性試驗(yàn)藥液（洗必泰）及陰性試驗(yàn)藥液各準(zhǔn)備滅菌玻璃試管5 支，每管加入沙氏液體培養(yǎng)基2 mL。取已配制和除菌處理過的揮發(fā)油和純露、陽性試驗(yàn)藥液（洗必泰）、陰性試驗(yàn)藥液2 mL加入第l管，混勻后取2 mL加至入2管，各管按稀釋度2、4、8、16和32倍稀釋至第5 管，第5 管混勻后棄去2 mL；每管加入細(xì)菌密度約為50 ～100 cfu/mL 的試驗(yàn)菌懸液0．1 mL。另取2 支試管作對(duì)照，分別加入2 mL 沙氏液體培養(yǎng)基和0．1 mL 菌懸液作有菌無藥對(duì)照管，2 mL 待檢藥液和2 mL 沙氏液體培養(yǎng)基作有藥無菌對(duì)照管。置于25 ℃恒溫箱培養(yǎng)48 h。同上記錄MIC。取無菌生長或菌生長受抑制試管內(nèi)的培養(yǎng)物0．1 mL 注入平皿，加入不超過45 ℃的沙氏瓊脂培養(yǎng)基15 ～20 mL，冷卻后置于25 ℃恒溫箱，倒置培養(yǎng)48 h，觀察菌落生長情況，記錄MBC[24]。每處理重復(fù)5次。

紙片法：取厚濾紙，用直徑6 mm 沖子打出圓形紙片若干，高壓滅菌。每張紙片分別吸取揮發(fā)油、純露、復(fù)方新諾明、洗必泰、生理鹽水和二甲亞砜，浸濕備用。分別將藥貼片貼于涂有金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、綠膿桿菌和枯草芽孢桿菌的胰酪大豆蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平皿內(nèi)培養(yǎng)24 h；分別將藥貼片貼于涂有白色念珠菌的沙氏瓊脂培養(yǎng)基平皿內(nèi)培養(yǎng)48 h。測(cè)量貼片周圍抑菌圈直徑，每處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同類型樟樹葉出油率和純露得率

芳樟醇型樟樹葉出油率較高，分別為2．02%（左旋）和1．95%（右旋）；檸檬醛型樟樹葉的出油率較低（0．67%）（表1）。檸檬醛型樟樹葉揮發(fā)油的主成分為檸檬醛，含量為65．05%；芳樟醇型樟樹葉揮發(fā)油的主成分為芳樟醇（左旋和右旋），含量分別為88．92%和91．03%；油樟型型樟樹葉揮發(fā)油的主成分為1,8-桉葉油素，含量為55．69%；龍腦型樟樹葉揮發(fā)油的主成分為龍腦，含量為85．73%。芳樟醇型（左旋）油樟型樟樹葉純露的得率較高（0．52%），龍腦型樟樹葉純露的得率較低（0．45%）。

表1 不同類型樟樹葉出油率和純露得率Tab.1 Yield of essential oils and hydrolats from different types of C.camphora leaves

2．2 不同類型樟樹葉揮發(fā)油和純露抑菌效果

各菌株在適宜溫度、經(jīng)合適時(shí)間培養(yǎng)后，菌落或菌苔生長良好。陽性藥貼片周圍有明顯抑菌圈，陰性藥貼片周圍無抑菌圈（表2）。芳樟醇型（右旋）揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠膿假單胞菌和白色念珠菌、芳樟醇型（左旋）揮發(fā)油對(duì)大腸埃希菌、檸檬醛型揮發(fā)油對(duì)枯草芽孢桿菌和白色念珠菌、油樟型揮發(fā)油對(duì)白色念珠菌均極度敏感，抑菌圈直徑≥20 mm，抗菌效果很好。芳樟醇型純露（左旋）對(duì)枯草芽孢桿菌和白色念珠菌均有抑制作用，其他類型純露只對(duì)白色念珠菌有抑制作用。芳樟醇型（右旋）揮發(fā)油的抑菌效果最好，其次是油樟型揮發(fā)油。

表2 揮發(fā)油和純露的抑菌圈直徑Tab.2 Inhibition zone diameters of essential oils and hydrolats

續(xù)表2 Continued

2．3 不同類型樟樹葉揮發(fā)油和純露MIC和MBC

在合適溫度下，各菌株經(jīng)合適時(shí)間培養(yǎng)，有菌無藥對(duì)照管混濁有菌生長，有藥無菌對(duì)照管澄明無菌生長，陽性藥管澄清透明，陰性藥管有紊絮狀混濁或豆腐渣樣凝塊。陽性藥對(duì)所有細(xì)菌和真菌的MIC和MBC 均為31．25 μL/mL；陰性藥沒有抑菌和殺菌作用。檸檬醛型、芳樟醇型、油樟型和龍腦型樟樹葉揮發(fā)油在不同濃度和不同菌株試驗(yàn)管中，均有呈澄清透明表現(xiàn)，說明不同類型揮發(fā)油對(duì)所有試驗(yàn)菌均有抑菌作用。檸檬醛型揮發(fā)油對(duì)所有試驗(yàn)菌、芳樟醇型（左旋）揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠膿假單孢菌的MIC 均為250 μL/mL；芳樟醇型（左旋）揮發(fā)油對(duì)大腸埃希菌、龍腦型揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠膿假單孢菌的MIC均為125 μL/mL；芳樟醇型（左旋）揮發(fā)油對(duì)枯草芽孢桿菌和白色念珠菌、龍腦型揮發(fā)油對(duì)枯草芽孢桿菌和白色念珠菌、芳樟醇型（右旋）和油樟型揮發(fā)油對(duì)所有試驗(yàn)菌的MIC均為31．25 μL/mL（表3）。芳樟醇型（右旋）和油樟型揮發(fā)油的抑菌能力最好，其次是龍腦型。

表3 揮發(fā)油和純露的MIC和MBCTab.3 MIC and MBC of essential oils and hydrolats

續(xù)表3 Continued

續(xù)表3 Continued

續(xù)表3 Continued

芳樟醇型（右旋）揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌和白色念珠菌、油樟型揮發(fā)油對(duì)白色念珠菌、龍腦型揮發(fā)油對(duì)白色念珠菌的MBC均為500 μL/mL。芳樟醇型（左旋）揮發(fā)油對(duì)枯草芽孢桿菌和白色念珠菌、油樟型揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠膿假單孢菌及龍腦型揮發(fā)油對(duì)枯草芽孢桿菌的MBC 均為250 μL/mL，油樟型揮發(fā)油對(duì)枯草芽孢桿菌的MBC為125 μL/mL。油樟型揮發(fā)油的殺菌能力最好，其次是芳樟醇型（左旋）揮發(fā)油。

除芳樟醇型（右旋）純露對(duì)所有試驗(yàn)菌的MIC為500 μL/mL 外，其他純露只對(duì)白色念珠菌有抑菌作用。所有純露均未發(fā)現(xiàn)有殺菌作用。

3 討論與結(jié)論

3．1 葉出油率和純露的得率

揮發(fā)油和純露的提取和成分分析結(jié)果表明，檸檬醛型樟樹葉揮發(fā)油的主成分為檸檬醛，芳樟醇型樟樹葉揮發(fā)油的主成分為芳樟醇，油樟型型樟樹葉揮發(fā)油的主成分為1,8-桉葉油素，龍腦型樟樹葉揮發(fā)油的主成分為龍腦。不同化學(xué)型揮發(fā)油中，芳樟醇型和油樟型樟樹葉中含有較高的揮發(fā)油（左旋芳樟2．02%、右旋芳樟1．95%，油樟1．65%），與胡文杰[25]研究中芳樟、腦樟、油樟、異樟和龍腦樟葉精油含量分 別 為1．34% ～2．16%、1．59% ～2．25%、1．61% ～2．24%、0．02%～0．06%和1．53%～1．93%相似。檸檬醛型樟樹葉中的揮發(fā)油含量最低（0．67%），與楊素華等[10]研究中檸檬醛型樟樹葉揮發(fā)油含量一致。油樟型芳樟醇型（左旋）樟樹葉純露的得率較高（0．52%），龍腦型樟樹葉純露的得率較低（0．45%）。

3．2 揮發(fā)油和純露的抑菌活性

芳樟醇型（右旋）和油樟型揮發(fā)油抑菌效果較好；油樟型揮發(fā)油的殺菌效果最好；芳樟醇型（右旋）純露的抑菌效果較明顯；所有濃度的純露在本試驗(yàn)中均未發(fā)現(xiàn)有殺菌效果。本研究的芳樟醇型（右旋、左旋）揮發(fā)油和芳樟醇型（右旋）純露可應(yīng)用于食品、香水、護(hù)膚品和醫(yī)藥中；油樟型揮發(fā)油可應(yīng)用于天然消毒殺菌產(chǎn)品中。陳可欣等[26]發(fā)現(xiàn)香樟精油可有效抑制灰綠曲霉（Aspergillus glaucus），可作為天然抑菌劑應(yīng)用于糧食儲(chǔ)藏；王進(jìn)等[27]研究發(fā)現(xiàn)香樟葉精油對(duì)供試真菌的抑制活性較好，可作為果蔬防腐劑；秦海燕等[28]發(fā)現(xiàn)香樟精油對(duì)肺炎小白鼠具有保護(hù)作用，可應(yīng)用于醫(yī)藥方面的研究。

檸檬醛型和龍腦型揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌，芳樟醇型（左旋）揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠膿假單孢菌和枯草芽孢桿菌在試管法中有抑菌作用，在紙片法中無抑菌活性，這可能是因?yàn)閮蓚€(gè)類型揮發(fā)油的抗菌成份為脂溶性物質(zhì)，需綜合考慮應(yīng)用的領(lǐng)域，才能發(fā)揮其保鮮效果。檸檬醛型揮發(fā)油可應(yīng)用于調(diào)配特定香型食品添加劑，龍腦型揮發(fā)油可應(yīng)用于消炎藥膏中。

芳樟醇型（右旋）純露的抑菌效果較明顯。正常情況下，純露中有抑菌作用的揮發(fā)油成分，純露應(yīng)具有一定的殺菌作用。本研究中，純露的殺菌作用基本沒有，可能是純露濃度偏低，所含的抗菌有效成分少，抑菌效果不明顯。今后，可進(jìn)一步研究精油和純露的配比協(xié)同抑菌作用，最大程度減少純露資源浪費(fèi)。