基于大數(shù)據(jù)的微生物高通量測序

文/章玉鮮，申鐵*

（貴州省信息與計算科學(xué)重點實驗室，貴州貴陽 550001）

1.實驗部分

1.1 Illumina Novaseq 6000高通量測序

隨著生物信息學(xué)科的興起，高通量測序成為大數(shù)據(jù)分析方式中高效的分析測序方法，有利于相關(guān)部門高效快捷地得到所需數(shù)據(jù)。例如，我們將采集的樣品送往青島市百邁客生物測序公司進(jìn)行Illumina Novaseq 6000高通量測序，具體操作如下：首先將樣品進(jìn)行DNA提取，按照實驗設(shè)計獲得相應(yīng)的引物，并且在引物的最后位置加上所需要的測序接頭，在對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后進(jìn)行提純檢驗和使用量的定值設(shè)置，進(jìn)而形成最終的測序文庫。測序文庫也要經(jīng)過質(zhì)量檢查才能進(jìn)行最終的測序。

1.2 大數(shù)據(jù)結(jié)合下的生物數(shù)據(jù)

伴隨著高通量技術(shù)發(fā)展而產(chǎn)生的海量多元組學(xué)數(shù)據(jù)，為生物信息學(xué)的快速發(fā)展提供了豐富的數(shù)據(jù)資源。實驗基于大數(shù)據(jù)分析，基于binary jaccard、bray curtis、(un)weighted unifrac（限細(xì)菌）多種算法展示測序物種的多樣性并形成可視化的矩陣。分析主坐標(biāo)并進(jìn)行可視化展現(xiàn)，以及受到哪些環(huán)境因子影響、與該樣本中的組成間相關(guān)性如何等的分析算法，使用的都是排序分析。

1.3 信息分析

我們首先通過原始數(shù)據(jù)處理與樣品序列統(tǒng)計對16S rDNA高變區(qū)序列測序，測序區(qū)域為v3+v4_b區(qū)；對測序得到的Raw Reads進(jìn)行過濾，目的是實現(xiàn)所得引物的序列可以被識別到。根據(jù)實驗需求，我們隊引物的序列進(jìn)行了篩選，這一步是為了獲得Clean Reads，即沒有引物后的序列。接下來，我們用overlap方法拼接對每一個測序樣本的Clean Reads，同時選擇測序樣本中所需要的長度進(jìn)行相應(yīng)的篩選，在去除嵌合體序列后得到有效數(shù)據(jù)。我們利用有效數(shù)據(jù)就可以應(yīng)用相應(yīng)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的計算和分析了，例如對樣本的多樣性進(jìn)行分析、對不同樣本間的差異進(jìn)行分析、對各個樣本間的相關(guān)性與差異性進(jìn)行分析等。最后，我們根據(jù)所獲得的Reads讀數(shù)，在97.0%的相似度下進(jìn)行物種的聚類，從而得到OTU值，進(jìn)一步進(jìn)行獲得想要的多樣性測序。

2.結(jié)果與討論

2.1 OTU分析

大數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)庫的選擇可以對生物序列分析起到直觀、精確的作用。Venn圖的作用是：一方面可以展示測序樣本自身特殊的特征數(shù)目，另一方面能直觀地展示各個樣本間相同特征的重疊部分，如圖1所示。

大數(shù)據(jù)可視化將生物數(shù)據(jù)以三維方式呈現(xiàn)，將復(fù)雜的數(shù)字可視化，利用相關(guān)軟件呈現(xiàn)物種豐度，從而更直觀地展現(xiàn)物種的不同程度。由圖1可以看出，A組總的特征個數(shù)＞B組的特征個數(shù)＞C組的特征個數(shù)，垃圾填埋場中的土壤微生物特征含量大于普通土壤微生物特征含量。A、B、C三組之間共有的OTUs個數(shù)達(dá)到了1442個，A組特有的OTUs個數(shù)最高，有104個；C組特有的OTUs個數(shù)最少，只有59個。結(jié)果說明，在垃圾填埋場土壤中的微生物OTUs高于校園里土壤中微生物OTUs的含量。從A組組間分析可以看出：A1、A2、A3共有的OTU數(shù)是1269個，A3特有的OTU含量最高，達(dá)到了172個；B組組間共有的OTU數(shù)為1524個，其中B1特有的OTU最高，108個；C組組間共有的OTU特征數(shù)是1338個，其中C2特有的OTU最高，109個。結(jié)果表明，生活垃圾中所含有的物質(zhì)對周圍土壤生物多樣性有促進(jìn)作用。同時，這也體現(xiàn)出生物信息學(xué)作為新型交叉學(xué)科，能夠利用大數(shù)據(jù)分析來提高研究效率。

2.2 物種分布圖

如何從已有的生物數(shù)據(jù)中有效獲取到信息，需要利用數(shù)據(jù)挖掘工具。數(shù)據(jù)挖掘工具是基于大數(shù)據(jù)中存在的海量資源，獲取所需的實驗數(shù)據(jù)。由圖2可知，各土壤樣品中包含最多的微生物是變形菌門（Proteobacteria），其 次 是酸桿菌門（Acidobacteria）；相對于B組和C組，A組擬桿菌（Bacteroidetes）高于B組和C組土壤樣品中的擬桿菌。擬桿菌具有纖維素降解和發(fā)酵產(chǎn)酸的能力，在垃圾填埋場中占據(jù)絕對優(yōu)勢，對垃圾降解能起到非常大的作用。大多數(shù)擬桿菌存在于人體中，其可能的原因是：垃圾填埋場大多數(shù)是生活垃圾，經(jīng)過垃圾滲濾液長期侵蝕，造成伴生土壤中的擬桿菌數(shù)量高于其他土壤。己科河菌門（Rokubacteria）、匿桿菌門（Latescibacteria）、硝 化 螺旋菌門（Nitrospirae）在A組中幾乎不存在，但在B組中的比例相對來說是最大的，這與賀曉凌等人的研究結(jié)果一致。其原因可能是：A組的伴生土壤已經(jīng)有5年以上，其中的垃圾差不多已經(jīng)被降解，土壤中的N03--N、NH4+-N的濃度受垃圾滲濾液的影響效果不大；而B組土壤距垃圾填埋場只有約50米遠(yuǎn)，垃圾滲濾液經(jīng)過地下徑流仍然對周圍土壤中的微生物多樣性產(chǎn)生了影響。例如在參與亞硝酸鹽氧化的過程中，由于是異養(yǎng)菌群，己科河菌門通過醋酸或脂肪酸的降解來獲取能量。垃圾填埋場中大多數(shù)是生活垃圾（包括廚余垃圾），在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生大量的乳酸；其余生活垃圾厭氧發(fā)酵也會產(chǎn)生一些腐殖酸；擬桿菌門發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生丁酸、丙酸和乙酸這些短鏈脂肪酸，且大多數(shù)來源于人體中，所以在A組、B組中的含量明顯高于C組。酸桿菌門適合在pH濃度較低的環(huán)境中生長，C組土壤雖然是山上的，但是經(jīng)常有人在上面活動，動物產(chǎn)生的糞便也在一定程度上影響了土壤性質(zhì)。

2.3 Alpha多樣性指數(shù)分析

伴隨著生物信息大數(shù)據(jù)的發(fā)展，在生物信息學(xué)作為多學(xué)科交融的歷程中，生物學(xué)數(shù)據(jù)多樣性分析和數(shù)據(jù)可視化在生物信息學(xué)中急速發(fā)展。以Alpha多樣性（Alpha diversity）為例，它可以呈現(xiàn)每一個樣品的物種豐富程度和該物種的各個數(shù)值的多樣性情況，如表1所示。

由表1可知樣品的有效序列數(shù)。另外，計算機科學(xué)與技術(shù)也在生物信息學(xué)中起著至關(guān)重要的作用，例如數(shù)據(jù)公示的計算和可視化。比較各樣品ACE值和Chao1值，得到的結(jié)果是樣品B＞樣品A＞樣品C，物種豐富度總體表現(xiàn)為：靠近垃圾填埋的地方，土壤的微生物多樣性要高于距離垃圾填埋較遠(yuǎn)的土壤中的微生物多樣性。公式為：

表1 Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計

[其中，H=樣品的信息含量（彼得/個體）=群落的多樣性指數(shù)；S代表在這個群落中物種的豐富度值，即物種有多少類型；pi代表物種i的相對豐度值；x一般取2或e]。如果是完全均勻的群落（上式中，pi=1/s），Shannon指數(shù)的值能達(dá)到最大。

3.結(jié)語

生物數(shù)據(jù)分析依賴于大數(shù)據(jù)平臺的發(fā)展?；贗llumina Novaseq6000高通量測序平臺對采集樣品測序顯示，物種豐富度總體表現(xiàn)為：靠近垃圾填埋的地方，土壤的微生物多樣性要高于距離垃圾填埋較遠(yuǎn)的土壤中的微生物多樣性，垃圾滲濾液通過地表徑流對土壤微生物多樣性產(chǎn)生直接影響。各土壤樣品中包含最多的微生物是變形菌門，其次是酸桿菌門。FCPU426、纖維桿菌門（Fibrobacteres）、藍(lán) 細(xì) 菌（Cyanobacteria）和BRC1是A組伴生土壤中獨有的優(yōu)勢細(xì)菌。B1中含量較突出的新型細(xì)菌門植物鈣化物（Calditrichaeota）能為垃圾填埋場滲濾液對土壤微生物多樣性研究提供有力支持。