艾葉提取物對萬古霉素誘導急性腎損傷的保護作用及其機制

李 達，李 敏，蔡文志，柳文媛，徐 健，楊寶衛(wèi)*，馮 鋒，**

（1江蘇食品藥品職業(yè)技術學院制藥工程學院,淮安 223003；2常州市婦幼保健院，常州醫(yī)學中心，南京醫(yī)科大學，常州 213000；3中國藥科大學藥學院,南京 210009；3中國藥科大學中藥學院,南京211198）

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是指不超過3 個月的腎臟功能或結構方面的異常，包括血、尿、腎臟病理組織學檢測或影像方面的腎損傷標志物異常，并以腎功能迅速下降為臨床特點，最終可能導致急性腎衰竭（acute renal failure，ARF）［1-2］。AKI 對人的腎臟、腦、肝等器官都有一定的危害，研究表明，患有晚期腫瘤的患者使用化療藥物導致AKI 的概率遠高于早期患者，發(fā)生率約41%。因此，化療藥物在延長腫瘤患者的生命的同時，也給患者帶來了嚴重的并發(fā)癥，已成公眾健康難題［3］。

當前，臨床上用于治療AKI 的藥物幾乎沒有。常采用血液凈化和特殊的中成藥進行輔助治療（中成藥常用冬蟲夏草或靈芝，價格高昂）［4］，給患者造成了沉重的心理負擔和經(jīng)濟壓力。因此，尋找并發(fā)現(xiàn)能夠用于預防和治療由化療藥物導致AKI的候選藥物十分迫切。

不同病因所致AKI 的作用機制有所不同，但主要涉及血流動力學改變等幾個主要病理環(huán)節(jié)，其中炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡是藥物誘導AKI 發(fā)生的重要機制［6-7］。艾葉是菊科植物艾草（Artemisia argyiLevl.et Vant.）干燥葉，藥食兩用植物，味苦、性溫，具有理氣血、溫經(jīng)脈的功效，主要化學成分包括綠原酸類、揮發(fā)油類、黃酮類等；現(xiàn)代藥理學證明艾葉具有抗氧化、抗炎、降血糖、免疫調節(jié)等藥理作用［8-10］。

本課題組前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，艾葉中的黃酮、綠原酸、酚酸、酚醛、蒽醌等化合物均具有較強的抗氧化活性，艾葉石油醚萃取部位的揮發(fā)油組分具有低毒、高效的抗炎作用，所以采用艾葉治療AKI 有理論可循。目前對艾葉是否對化療藥物導致的AKI具有保護作用未見文獻報道。

本研究通過ip 雄性ICR 小鼠萬古霉素（VAN）建立藥物性AKI 模型，并檢測小鼠腎功能、氧化應激和炎癥等相關指標、檢查腎臟組織形態(tài)和腎組織細胞凋亡相關基因含量水平，從而進一步闡明艾葉乙醇提取物改善AKI 的作用機制，為中藥艾葉改善VAN誘導AKI作用研究提供理論依據(jù)。

1 材 料

1.1 試劑與藥材

注射用VAN（浙江海正藥業(yè)股份有限公司）；小鼠胱抑素C（Cys C）、尿素氮（BUN）、炎癥指標腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）、超敏C-反應蛋白（hs-CRP）檢測試劑盒（上海滬震生物科技有限公司）；肌酐（Scr）的含量水平，氧化應激指標丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒（北京九強生物技術股份有限公司）；細胞凋亡相關基因（Bax、Bcl-2、Caspase-3）檢測試劑盒（上海晶抗生物工程有限公司）；所使用的試劑均為分析純（南京化學試劑公司）。

艾葉由湖北蘄春栽培和購買（批號180401），經(jīng)馮鋒教授鑒定為Artemisia argyi的干燥葉，保存于江蘇食品藥品職業(yè)技術學院制藥工程學院中藥提取實驗室。

1.2 儀 器

臺式高速冷凍離心機（HR/T16M，湖南赫西儀器裝備有限公司）；CAX-370 型離心機（日本Tomy Seiko 公司）；酶標儀（美國BioTek EL-x800）；病理彩色圖象分析系統(tǒng)（鄭州澤銘科技有限公司）；XD-202型倒置顯微鏡（南京江南永新光學有限公司）。

1.3 動 物

動物等級均為SPF 級雄性ICR 小鼠，體重控制在22~25 g（南京市青龍山動物繁殖場，許可證號SCXK（蘇）2020.0001），動物實驗符合倫理學。

2 方 法

2.1 艾葉提取物制備

取艾葉500 g 陰干，使用95%乙醇為提取溶劑（料液比為1∶10），于室溫下過夜浸泡12 h，50 ℃加熱回流提取3次，每次3 h，合并提取液，過濾，減壓回收溶劑，得艾葉乙醇提取物。.

2.2 動物分組、AKI模型建立與給藥

小鼠適應性喂養(yǎng)后，隨機分為空白組、模型組和給藥組，給藥組包括高劑量組（H 組）、中劑量組（M 組）和低劑量組（L 組）。每組6 只小鼠，實驗前將小鼠用硝酸銀溶液進行分組標號，且不禁水不禁食。以腹腔注射（ip）方式給藥，其中，空白組小鼠按其體重給予等量的無菌生理鹽水；模型組小鼠ip VAN（100 mg/kg），每日1 次，連續(xù)8 d，在此期間動物自由飲食飲水。

通過預實驗發(fā)現(xiàn)，當給藥組小鼠灌胃（ig）250 mg/kg 及其以上劑量的艾葉乙醇提取物時，小鼠出現(xiàn)死亡，當ig 30 mg/kg 及其以下劑量的艾葉乙醇提取物時，給藥組小鼠相關參數(shù)水平與模型組無顯著差異，因此，實驗最終選擇200 mg/kg，100 mg/kg，50 mg/kg 3 個給藥劑量組。小鼠提前ig規(guī)定劑量的艾葉乙醇提取物，每日1次，連續(xù)兩周，之后ip VAN（100 mg/kg），每日1 次，連續(xù)8 d，同時繼續(xù)ig 規(guī)定劑量的艾葉乙醇提取物，其間動物自由飲食飲水［11］。

2.3 指標檢測

2.3.1 腎功能指標Cys C、BUN、Scr 的含量測定［11］空白組、模型組、H 組、M 組、L 組實驗小鼠末次給藥24 h 后，均采用小鼠眼球采血法，以6 000 r/min，離心10 min，分離血清，依據(jù)試劑盒方法檢測血清中有關腎功能指標的Cys C、BUN、Scr含量水平。

2.3.2 氧化應激指標MDA、SOD 和GSH-Px 的含量測定[12-13]空白組、模型組、H 組、M 組、L 組實驗小鼠末次給藥24 h 后，均采用小鼠眼球采血法，以6 000 r/min，離心10 min，分離血清，依據(jù)試劑盒方法檢測血清中氧化應激指標的MDA、SOD 和GSHPx含量水平。

2.3.3 炎癥指標TNF-α、IL-1β 和hs-CRP 含量測定[14-15]空白組、模型組、H 組、M 組、L 組實驗小鼠末次給藥24 h 后，均采用對小鼠眼球采血法，以6 000 r/min，離心10 min，分離血清，依據(jù)試劑盒方法檢測血清中炎癥指標的TNF-α、IL-1β 和hs-CRP的濃度。

2.4 標本采集與腎臟組織形態(tài)檢查

分別處死小鼠并解剖取出腎臟，分成兩部分，一部分于-80 ℃條件下保存，做腎組織中細胞凋亡相關基因Bax、Bcl-2、Caspase-3 的檢測；另一部分于10%福爾馬林中浸泡24 h，然后使用乙醇脫水，切制成4 μm 厚的切片，并用做蘇木精-伊紅染色法（HE 染色）染色，在光鏡下觀察各組腎臟組織形態(tài)學改變［16］。

2.5 細胞凋亡相關基因Bax、Bcl-2、Caspase-3 的檢測

2.5.1 腎組織勻漿制備 將各組實驗小鼠腎臟，依照質量體積比1∶9 分別加入勻漿介質，4 ℃的條件下制備腎組織勻漿，以6 000 r/min，離心10 min，分離并吸取上清液。

2.5.2 細胞凋亡相關基因Bax、Bcl-2、Caspase-3含量水平的檢測 于96 孔板待測孔（空白孔、標準品孔、樣品孔）中加入各自樣品10 μL 和稀釋液40 μL；然后，標準品孔和樣本孔中加入檢測抗體100 μL，空白孔加入等量稀釋液，避光封住，恒溫37 ℃反應60 min 后棄去液體，拍干，加洗滌液，來回洗5 次，每次中間靜置2 min；最后，加入底物50 μL，37 ℃恒溫下放置20 min 后加終止液50 μL，于酶標儀450 nm 處測定吸收度，依照標準曲線法計算各樣品濃度［17］。

2.6 統(tǒng)計分析

實驗結果以±s表示，用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計。數(shù)據(jù)間差異性采用t檢驗方法，P＜0.05 表示有統(tǒng)計學差異。

3 結 果

3.1 艾葉乙醇提取物制備

照“2.1”項下方法，減壓回收溶劑，烘箱加熱烘干，得艾葉乙醇提取物浸膏52.3 g。通過計算，艾葉出膏率結果為10.46%（出膏率=浸膏質量/艾葉干重× 100%）。同時，精密稱取浸膏樣品20 g，加入羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液100 mL 作樣品溶劑，超聲溶解配制成20 g/mL 動物實驗給藥樣品母液。

3.2 生化指標的測定

3.2.1 腎功能指標Cys C、BUN、Scr 的含量比較研究結果顯示（表1），與空白組比較，模型組小鼠血中Cys C、Scr 和BUN 等反映腎功能的指標參數(shù)水平顯著升高（P＜0.05），表明注射VAN 的小鼠因產(chǎn)生了明顯的藥物性AKI 模型；同時，給予了不同劑量艾葉提取物后，與模型組比較，H 組小鼠血中腎功能指標含量水平均有不同程度降低（P＜0.05），M 組和L 組給藥組小鼠血中腎功能指標含量水平也有不同程度降低，且3個不同劑量對其影響呈現(xiàn)濃度依賴性。上述結果表明，艾葉乙醇提取物對化療藥物VAN 誘導的藥物性AKI 具有保護作用。

Table 1 Content of Cys C,BUN and Scr in different groups(± s,n = 6)

Table 1 Content of Cys C,BUN and Scr in different groups(± s,n = 6)

Cys C: Cystain C; BUN: Blood urea nitrogen; Scr: Serum creatinine; L group: Low-dose(50 mg/kg) group; M group: Middle-dose(100 mg/kg)group;H group:High-dose(200 mg/kg)group#P ＜0.05 vs blank group;*P ＜0.05 vs model group

Group Blank Model L group M group H group Cys C/(mg/L)0.38±0.03 0.68±0.13#0.55±0.17 0.53±0.12 0.50±0.14*BUN/(mmol/L)8.26±1.09 11.26±2.11#11.16±3.46 10.02±0.97 9.30±1.90*Scr/(μmol/L)77.06±15.26 119.33±10.36#112.80±15.73 110.59±6.50 102.36±7.75*

3.2.2 氧化應激指標MDA、SOD 和GSH-Px 含量比較 研究結果顯示（表2），與空白組比較，模型組小鼠血清中MDA 含量增加，SOD 和GSH-Px活力下降，且反映氧化應激上述指標參數(shù)水平均呈顯著性變化（P ＜0.05），表明本實驗注射VAN 模型小鼠出現(xiàn)明顯的氧化應激反應；同時，給予了不同劑量艾葉提取物后，與模型組比較，H 組小鼠血中氧化應激指標參數(shù)含量水平均有不同程度降低（P＜0.05），M 組和L 組小鼠血中腎功能指標含量水平也有不同程度降低，且3個不同劑量對其影響呈現(xiàn)濃度依賴性。上述結果表明，艾葉提取物可能通過抗氧化應激改善化療藥物VAN引起的AKI。

3.2.3 炎癥指標TNF-α、IL-1β 和hs-CRP 含量比較 研究結果顯示（表3），與空白組比較，模型組小鼠血清TNF-α、IL-1β 和hs-CRP 含量均有增加，且TNF-α 和IL-1β 參數(shù)水平呈顯著性變化（P＜0.05），表明本實驗注射VAN 模型小鼠出現(xiàn)明顯的炎癥反應；同時，給予了不同劑量艾葉提取物后，與模型組比較，H 組、M 組和L 組給藥組小鼠血中腎功能指標含量水平也有不同程度降低，且3個不同劑量對其影響呈現(xiàn)濃度依賴性。上述結果表明，艾葉提取物可能通過抑制炎癥反應改善化療藥物VAN引起的AKI。

Table 2 Content of MDA, SOD and GSH-Px in different groups (xˉ±s,n = 6)

Table 3 Content of TNF-α,IL-1β and hs-CRP in different groups(xˉ±s,n = 6)

3.2.4 腎臟組織形態(tài)學改變 研究結果（圖1）顯示，在光鏡下，發(fā)現(xiàn)空白組小鼠的腎小管、腎小球等結構顏色正常、形態(tài)正常，無明顯的異樣；與空白組比較，模型組小鼠腎小管結構出現(xiàn)了異樣的病理情況，較多腎小管上皮細胞水腫甚至壞死，無明顯的細胞界限，小管管腔內有大量細胞管型，間質明顯淤血；與模型組比較，給藥組H 組、M 組和L組的小鼠腎臟的腎小管、腎小球病理癥狀隨著給藥量的增加，給藥組小鼠腎臟組織病變減輕程度呈現(xiàn)濃度依賴性。

3.3 細胞凋亡指 標Bax、Bcl-2 和Caspase-3 含量比較

研究結果顯示（表4），與空白組比較，模型組小鼠模型組Bax 含量升高、Bcl-2 含量降低，Cas?pase-3 含量升高，且反映細胞凋亡指標的Bcl-2、Caspase-3 參數(shù)水平呈顯著性變化（P＜0.05）。同時，給予了不同劑量艾葉提取物后，與模型組比較，H 組、M 組和L組給藥組不同程度地降低了Bax濃度、升高了Bcl-2 濃度和降低了Caspase-3 濃度，其中H組小鼠Bax、Caspase-3等參數(shù)水平均有發(fā)生顯著性差異（P＜0.05）且3 個不同劑量對其影響呈現(xiàn)濃度依賴性；此外，Bax/Bcl-2 比例下降，從而減少了Caspase-3的產(chǎn)生，起到抑制細胞凋亡作用。上述結果表明，艾葉提取物可能通過抑制細胞凋亡改善化療藥物VAN引起的AKI。

Figure 1 Pathological changes in different groups

Table 4 Content of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 in different groups (xˉ±s,n = 6)

4 討 論

本實驗結果表明，艾葉乙醇提取物對化療藥物VAN 誘導的AKI 具有保護作用，其機制與艾葉提取物能改善氧化應激、抑制炎癥與細胞凋亡等有關，與Xu，Lu 等的研究結果［14，18］一致。此外，本實驗的研究結果進一步證實了氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡3 個影響因素在VAN 誘導的藥物性AKI模型中過程中關系密切且相互影響。

艾葉在我國藥用歷史悠久，且資源豐富，目前臨床應用多是胃炎、關節(jié)炎等疾病治療［19］，尚未見到AKI臨床治療的相關文獻記載；而Zhang 等［20］的研究表明，艾葉水煎液對尿毒癥患者慢性腎功能不全有保護作用，且該作用在一定濃度范圍內呈現(xiàn)劑量相關性，表明艾葉臨床上具有潛在的腎保護作用。根據(jù)Li 等［21］的研究，艾葉的口服給藥的安全性較好，小鼠的給藥量到達120 g/（kg·d）灌胃7 d時仍未出現(xiàn)明顯急性毒性反應。本實驗設計的對治療組小鼠采用8 d 灌胃艾葉提取物［200 mg/（kg·d）］的給藥方式，該劑量給藥期間小鼠無明顯不良反應，治療組小鼠相比模型組小鼠腎功能明顯改善，表明其具有潛在的臨床使用安全療效。

艾葉中的化學成分繁多，且化合物之間的協(xié)同作用對藥效影響甚大，需要進一步對其含有單體化學成分的AKI 藥效和機制深入研究，為艾葉防治AKI的潛在藥物開發(fā)奠定實驗基礎。