3-芳基香豆素衍生物抑制血管鈣化的機制

李雨霏，初海平，李 妍，王曉靜，牟艷玲*，孫 捷**

（1山東第一醫(yī)科大學（山東省醫(yī)學科學院）藥學與制藥科學學院，濟南 250014；2山東第一醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院（山東省千佛山醫(yī)院）麻醉與圍術期醫(yī)學科，濟南 250014）

血管鈣化是一種類似于骨形成的過程，具有高度可調節(jié)性和主動性［1］，其發(fā)生與高血糖、氧化應激、炎癥反應等各種刺激因素下導致的血管平滑肌細胞向成骨樣細胞表型轉換的過程有關［2-4］，糖尿病患者中廣泛存在血管鈣化現(xiàn)象［5-6］。目前常用的他汀類藥物和二甲雙胍等［7-9］可以通過減少與鈣化相關的氧化應激反應和阻斷炎癥反應的信號分子及通路來減少機體的血糖和血脂，從而延緩血管鈣化的進展［10-12］。

近年來，越來越多的研究表明，與單一靶點藥物相比，多靶點的天然藥物在心血管的保護中具有不可替代的優(yōu)勢，尤其是香豆素類化合物具有良好的AGEs 生成抑制活性，異黃酮類化合物具有良好的抗氧化、抗炎活性，近年來備受關注［13-15］。若能設計一類藥物同時兼具兩類化合物的優(yōu)點，將會在血管保護領域邁出重要一步。前期本課題組利用孿藥的設計原理，將具有相關活性的香豆素與異黃酮類化合物重疊結合，設計了500多個芳基香豆素類化合物，通過體外篩選發(fā)現(xiàn)其中基于傘形花內(nèi)酯、大豆異黃酮設計的3-（4′-羥基苯基）-6-羥基香豆素（C15H10O4，代號SJ-6，相對分子質量225.5）具有較好的體外降糖、清除氧自由基、抑制晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）生成活性，本研究進一步對化合物SJ-6 的作用靶點及相關的藥理活性開展研究［16-17］，化合物SJ-6的合成路線見圖1。

Figure 1 Synthetic route of compound SJ-6

1 材 料

1.1 藥品與試劑

1.2 儀 器

3111 型CO2培養(yǎng)箱、Evolution 220 紫外分光光度計（美國Thermo公司）；Eclipse TE 2000-S熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）；Infinite M200 PRO 型酶標儀（法國Tecan 公司）；CFX96 TOUCK 熒光定量PCR 儀、Trans-Blot SD 半干轉印系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；Azure cSeries 200 型化學發(fā)光成像儀（美國Azure Biosystems公司）。

1.3 細 胞

人主動脈血管平滑肌細胞（HCASMCs）由山東第一醫(yī)科大學藥學與制藥科學學院藥理室提供。使用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2孵育。

2 方 法

2.1 人主動脈血管平滑肌細胞鈣化誘導

取生長狀態(tài)良好的第2~5代HCASMCs，按照每皿1×106個的密度接種于35 mm 培養(yǎng)皿中，5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)至80% ~ 90%細胞融合貼壁，加入含100 mg/L 晚期糖基化終產(chǎn)物-牛血清白蛋白（AGEs-BSA）的鈣化誘導液進行培養(yǎng)，隔天換液，4 d 后對細胞進行茜素紅染色并于顯微鏡下觀察，若視野中細胞出現(xiàn)密集鈣化斑時，視為造模成功。

2.2 茜素紅染色實驗

取生長狀態(tài)良好的第2~5代HCASMCs，按照每皿1 × 106個的密度接種于35 mm 培養(yǎng)皿中，各組細胞誘導及藥物干預4 d，隔天換液，各組細胞培養(yǎng)完成后，吸棄培養(yǎng)基并用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗2 次，4%多聚甲醛固定15 min，去離子水洗滌3 次，加入0.2%茜素紅S 溶液（pH 8.3），室溫避光染色30 min，去離子水洗滌5 次，顯微鏡下觀察鈣結節(jié)染色情況并拍照。染色后進行茜素紅定量，每孔加入十六烷基氯化吡啶200 μL，37 ℃孵育1 h，于562 nm 波長處檢測吸收度，記錄并分析數(shù)據(jù)。

2.3 ALP酶活力測定

將細胞以每孔5.0×104個細胞的密度接種于24 孔板，參考并依據(jù)本課題組已進行的體外活性篩選的最佳濃度，分別設置正常對照組（HCASMCs正常培養(yǎng)）、溶媒對照組（HCASMCs + 0.5%DMSO）、鈣化誘導組（HCASMCs+100 mg/L AGEs-BSA）、陰性對照組（HCASMCs + 100 mg/L AGEs-BSA + 0.5%DMSO）、陽性對照氨基胍鹽酸鹽（AGH）組（HCASMCs+100mg/LAGEs-BSA+0.5%DMSO+5.7×10-2mmol/L AGH）、SJ-6 處理組（HCASMCs+100 mg/L AGEs-BSA+0.5%DMSO+0.025 mmol/L SJ-6）、SJ-6 處理組（HCASMCs + 100 mg/L AGEs-BSA+0.5%DMSO+0.012mmol/L SJ-6）、SJ-6 處理組（HCASMCs+100 mg/L AGEs-BSA+0.5%DMSO+0.006mmol/L SJ-6），誘導及藥物干預4 d，隔天換液，各組細胞培養(yǎng)完成后，按照堿性磷酸酶活力測定試劑盒說明進行裂解和加樣，測定各組在405 nm 處的吸收度，根據(jù)各組吸收度計算各組ALP活性。

2.4 細胞存活率實驗

取生長狀態(tài)良好的第2~5代HCASMCs，按照每皿1×106個的密度接種于35 mm培養(yǎng)皿中，各組細胞誘導及藥物干預4 d，隔天換液，培養(yǎng)完成后，用0.25%胰酶消化細胞，以每孔5.0×104個細胞的密度接種于96孔板，培養(yǎng)貼壁后，將各組培養(yǎng)液更換為不含血清的DMEM 培養(yǎng)液以使細胞同步化，分組及處理同每組做6 個孔，重復3 次。采用MTT法測定各組細胞增殖情況。每孔加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL，37 ℃孵育4 h。小心吸出培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL 溶解結晶，振蕩混勻后于波長490 nm下測定各孔吸收度。

在一列快速行進的地鐵車廂里，某人客氣地彎腰對身旁的一位女士說：“車廂真暗，請允許我為你找扶手吊帶吧?！?/p>

2.5 AGEs含量測定

取生長狀態(tài)良好的第2~5代HCASMCs，按照每皿1 × 106個的密度接種于35 mm 培養(yǎng)皿中，各組細胞誘導及藥物干預4 d，隔天換液，各組細胞誘導完成后，按照ELISA 試劑盒說明進行操作，向預先包被了抗體的酶標孔中加入樣本，再加入生物素標記的識別抗原，在37 ℃下孵育30 min，兩者與固相抗體競爭結合形成免疫復合物，經(jīng)PBS 洗滌后加入親和素-HRP，在37 ℃下孵育30 min，親和素-HRP 與生物素抗原相結合，洗滌后加入反應終止液，于波長450 nm下檢測各孔吸收度。

2.6 細胞內(nèi)鈣離子濃度測定

取生長狀態(tài)良好的第2~5代HCASMCs，按照每皿1 × 106個的密度接種于35 mm 培養(yǎng)皿中，各組細胞誘導及藥物干預4 d，隔天換液，各組細胞培養(yǎng)完成后，取適當細胞進行勻漿，低速離心取上清液，鄰甲酚酞絡合銅法測定各組細胞鈣含量。

2.7 細胞內(nèi)總活性氧含量測定

取生長狀態(tài)良好的第2~5代HCASMCs，按照每皿1 × 106個的密度接種于35 mm 培養(yǎng)皿中，各組細胞誘導及藥物干預4 d，隔天換液，各組細胞培養(yǎng)完成后，采用活性氧檢測試劑盒檢測細胞內(nèi)總活性氧（ROS）含量，去除培養(yǎng)液，用PBS 溶液洗細胞后加入熒光染料DCFH-DA，孵育20 min，然后用PBS 清洗細胞，熒光顯微鏡下進行拍攝。使用IPP5.0進行熒光面積分析。

2.8 超氧化物歧化酶含量測定

取生長狀態(tài)良好的第2~5 代HCASMCs，按照每皿1 × 106個的密度接種于35 mm 培養(yǎng)皿中，各組細胞誘導及藥物干預4 d，隔天換液，各組細胞培養(yǎng)完成后，收集細胞至離心管，超聲破碎并離心，按照超氧化物歧化酶（SOD）活性測定試劑盒（黃嘌呤氧化酶法）檢測各組細胞SOD的含量。

2.9 炎癥因子表達量測定

取生長狀態(tài)良好的第2~5 代HCASMCs，按照每皿1 × 106個的密度接種于35 mm 培養(yǎng)皿中，各組細胞誘導及藥物干預4 d，隔天換液，各組細胞誘導完成后，按照ELISA 試劑盒說明進行操作，向預先包被了抗體的酶標孔中加入樣本，再加入生物素標記的識別抗原，在37 ℃下孵育30 min，兩者與固相抗體競爭結合形成免疫復合物，經(jīng)PBS 洗滌后加入親和素-HRP，在37 ℃下孵育30 min，親和素-HRP 與生物素抗原相結合，洗滌后加入反應終止液，于波長450 nm下檢測各孔吸收度。

2.10 Runx2 mRNA的表達量測定

取生長狀態(tài)良好的第2~5 代HCASMCs，按照每皿1 × 106個的密度接種于35 mm 培養(yǎng)皿中，各組細胞誘導及藥物干預4 d，隔天換液，各組細胞誘導完成后，提取各組細胞總mRNA，逆轉錄為互補脫氧核糖核酸（cDNA），并以cDNA 為模板行實時熒光定量PCR。反應步驟：預熱：95 ℃（30 s），1 個循環(huán)；擴增：95 ℃（10 s），60 ℃（20 s），40個循環(huán)；熔解：95 ℃（15 s），60 ℃（60 s），95 ℃（60 s），1個循環(huán)；冷卻：40 ℃（60 s）1 個循環(huán)。以GAPDH 作為內(nèi)參，計算各組別成骨相關轉錄因子2 mRNA（Runx2 mRNA）表達的倍比關系即為各組別Runx2 m RNA相對表達量。

2.11 RAGE、NF-κB、NOX-1、PKC、Akt、p38、SMAα蛋白表達量測定

取生長狀態(tài)良好的第2~5 代HCASMCs，按照每皿1×106個的密度接種于35 mm培養(yǎng)皿中，各組細胞誘導及藥物干預4 d，隔天換液，各組細胞誘導完成后，用預冷的PBS沖洗2遍，參照總蛋白提取試劑盒的操作說明，刮取細胞并提取總蛋白，取上清液后采用BCA 法進行蛋白定量。取蛋白20 μg 進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，封閉，加入兔抗人晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）抗體（1∶1 000）、兔抗人蛋白激酶C（PKC）抗體（1∶1 000），兔抗人核因子κB（NF-κB）抗體（1∶1 000）、兔抗人蛋白激酶B（AKT）抗體（1∶1 000）、兔抗人NADPH 氧化酶-1（NADPH oxidase-1，NOX-1）抗體（1∶1 000）、兔抗人p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）抗體（1∶1 000）、兔抗人α-平滑肌肌動蛋白（SMA-α）抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，加入二抗Ig G（1∶10 000），室溫孵育1 h，ECL 試劑盒顯影，以β-actin為內(nèi)參進行數(shù)據(jù)標準化，以對照組為參照樣本，計算各組目的蛋白的相對表達水平。

2.12 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進行分析，所有的數(shù)據(jù)結果均按照平均值± 標準差（±s）表示，采用方差分析及t檢驗進行組間差異的比較。采用獨立樣本t檢驗比較兩組指標的組間差異；采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）比較各項指標的組間差異，用P＜0.05 來表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1 不同濃度SJ-6對細胞存活率的影響

MTT 測定的結果表明，AGEs 和化合物SJ-6 均對細胞存活沒有顯著影響（P＞0.05）（圖2）。這些結果表明該化合物對細胞無毒。

Figure 2 Effects of different concentrations of compound SJ-6 on cell viability(± s,n = 3)

3.2 茜素紅染色的平滑肌細胞鈣化結節(jié)

AGEs 能促進血管平滑肌細胞的鈣化［18］。根據(jù)顯微鏡拍攝的照片和茜素紅的定量結果，與對照組相比，AGEs 組與AGEs+DMSO 組細胞內(nèi)及細胞外鈣結節(jié)數(shù)量明顯增多。相比于AGEs組與AG?Es+DMSO 組，不同濃度化合物SJ-6 處理組，隨化合物濃度增加，鈣結節(jié)數(shù)量及區(qū)域面積逐漸減少，呈濃度依賴性（圖3）。

Figure 3 Calcified nodules of smooth muscle cells stained with alizarin red

3.3 化合物SJ-6對平滑肌細胞ALP活力的影響

研究表明，ALP 與主動脈鈣化密切相關［19-20］，是評估血管鈣化和骨質疏松癥的可靠指標。通過測量各個組別中的ALP 活性，發(fā)現(xiàn)各個濃度梯度的SJ-6 均可顯著抑制鈣化的血管平滑肌細胞中的ALP 的增加（P ＜0.01）（表1），推測化合物SJ-6 對主動脈鈣化可能具有良好的抑制作用。

3.4 不同濃度SJ-6對AGEs含量的影響

與對照組相比，AGEs 組的細胞內(nèi)AGEs 含量顯著增加（P ＜0.01）（圖4）。隨著濃度的增加，化合物SJ-6 逐漸降低細胞中的AGEs（P ＜0.01）。推測這些化合物可能能夠直接裂解AGEs 或加速AGEs的自然分解。

3.5 不同濃度SJ-6對細胞內(nèi)鈣含量的影響

相比對照組，AGEs 組細胞內(nèi)鈣含量明顯增加（P ＜0.01），說明AGEs 可以誘導HCASMCs 鈣化。與AGEs 組相比，不同濃度的SJ-6 干預組細胞內(nèi)鈣含量明顯降低（P ＜0.01），在不同濃度組之間，隨著化合物的濃度增加，細胞內(nèi)鈣含量逐漸下降，說明化合物SJ-6 可以抑制AGEs 誘導的HCASMCs 鈣化，且細胞內(nèi)鈣含量減少與化合物SJ-6 呈濃度依賴性（圖5）。研究證明胞內(nèi)鈣含量以及ALP 活性均與HCASMCs 鈣化呈正相關，因此再次間接證明化合物SJ-6 可抑制AGEs 誘導的血管鈣化。

Table 1 Effects of compound SJ-6 on alkaline phosphatase (ALP)activity(± s,n = 3)

Table 1 Effects of compound SJ-6 on alkaline phosphatase (ALP)activity(± s,n = 3)

ΔΔP ＜0.01 vs normal group; **P ＜0.01 vs AGEs group

Group Normal DMSO AGEs AGEs+DMSO AGH 0.025 mmol/L SJ-6 0.012 mmol/L SJ-6 0.006 mmol/L SJ-6 ALP activity/(U/mg)0.117±0.003 0.116±0.003 0.245±0.003ΔΔ 0.241±0.002ΔΔ 0.183±0.003**0.180±0.004**0.187±0.005**0.208±0.003**

Figure 4 Effects of different concentrations of compound SJ-6 on AGEs content(± s,n = 3)

3.6 不同濃度SJ-6 對各組細胞ROS 熒光強度表達的影響

氧化應激可以誘發(fā)心血管疾病［21-22］。與對照組相比，AGEs 組細胞綠色熒光面積明顯增大（P＜0.01），且熒光強度更加聚集。與AGEs 組對比，加入不同濃度化合SJ-6 組綠色熒光面積明顯減少（P ＜0.01），且隨濃度增加而面積逐漸減少，說明AGEs 可誘導HCASMCs 發(fā)生氧化應激反應，但化合物SJ-6 抑制這一效應，對HCASMCs 起到保護作用（圖6）。

Figure 5 Effects of different concentrations of SJ-6 on intracellular calcium content(± s,n = 3)

Figure 6 Effects of compound SJ-6 on ROS.The induction of AGEs increases the ROS content in vascular smooth muscle cells, and each compound group can reduce the ROS content

3.7 不同濃度SJ-6對SOD表達量的影響

與對照組相比，AGEs 組細胞的抗氧化指標SOD 的活性顯著降低（P ＜0.01）。相比AGEs 組不同濃度化合物SJ-6干擾組細胞內(nèi)SOD 的活性明顯升高（P ＜0.01），且不同濃度組之間，SOD 的活性隨化合物濃度增加而逐漸升高，說明化合物SJ-6可以增強細胞的抗氧化能力，且抗氧能力的增強與化合物SJ-6呈濃度依賴性（圖7）。

3.8 不同濃度SJ-6對炎癥因子TNF-α、1L-6、1L-β表達的影響

與對照組相比，AGEs 組細胞的炎性細胞因子TNF-α，1L-6 和1L-β 顯著增加（P＜0.01），表明AGEs 可以誘導HCASMCs 發(fā)生炎癥反應。相比AGEs 組不同濃度SJ-6 干擾組細胞內(nèi)炎癥因子TNF-α、1L-6、1L-β 的表達明顯降低（P ＜0.01），且不同濃度組之間，炎癥因子表達量隨化合物濃度增加而逐漸下降，說明化合物SJ-6 可以抑制AGEs誘導的HCASMCs 的炎癥反應，且炎癥因子表達量的減少與化合物SJ-6呈濃度依賴性（圖8）。

Figure 7 Effect of different concentrations of compound SJ-6 on SOD expression(± s,n = 3)

Figure 8 Influence of different concentrations of compound SJ-6 on the expression of inflammatory factors TNF-α(A),1L-6(B),1L-β(C).The induc?tion of AGEs increased the content of TNF-α,1L-6,1L-β(± s,n = 3)

3.9 不同濃度SJ-6 對Runx 2 mRNA 表達量的影響

Runx2 mRNA 是正常骨骼形成所必需的，AG?Es 顯著增加了Runx2 mRNA（P ＜0.01），表明AG?Es可以誘導HCASMCs 的成骨轉化。與AGEs 組相比，化合物SJ-6 的濃度升高時，細胞中Runx2 mRNA 的表達逐漸降低（P ＜0.01），提示化合物SJ-6 可以抑制AGEs 誘導的HCASMCs 的成骨轉化且Runx 2 mRNA 表達量的減少與化合物SJ-6呈濃度依賴性（圖9）。

3.10 不同濃度SJ-6 對AGEs 誘導的RAGE，SMAα，NF-κB，p38，Akt，PKC，NOX-1蛋白表達的影響

與對照組相比，AGEs 組RAGE，NF-κB，pp38，Akt，PKC，NOX-1 蛋白 達 量明 顯增高（P ＜0.01），平滑肌動蛋白SMA-α 的蛋白表達量明顯降低（P ＜0.01），與AGEs組相比，化合物SJ-6處理組中RAGE，NF-κB，p-p38，Akt，PKC，NOX-1 蛋白達量表達量明顯降低（P ＜0.01），SMA-α 的蛋白表達量明顯增多（P ＜0.01），且表達量隨化合物濃度增加而逐漸降低，說明化合物SJ-6可以抑制AGEs誘導的HCASMCs 向成骨細胞分化的相關通路，且這種抑制具有濃度依賴性（圖10）。

Figure 9 Effect of different concentrations of compound SJ-6 on the expression of Runx2 mRNA (± s,n = 3).The induction of AGEs increased the Runx2 mRNA content of the osteogenic transcription factor in vascular smooth muscle cells,and each compound group could reduce the Runx2 mRNA content

4 討 論

血管鈣化是糖尿病、動脈粥樣硬化、高血壓、慢性腎臟病等多種疾病的共同病理表現(xiàn)，而目前血管鈣化的發(fā)病機制尚不十分清楚［23］。目前尚無直接逆轉血管鈣化的手段，但多種干預措施可用于減慢或延緩血管鈣化的進展，例如控制高血糖等傳統(tǒng)危險因素、阻斷AGEs 生成、抑制AGEs/RAGE的相互作用、降低氧化應激等，但這些干預措施存在作用靶點單一、副作用大、治療效果差等缺點，所以治療血管鈣化仍是目前研究的難點和熱點。本研究首次發(fā)現(xiàn)多靶點化合物SJ-6 能直接對抗鈣化對平滑肌細胞的損害，這對于血管鈣化發(fā)病機制的深入理解和防治靶點的開發(fā)具有重要意義。

Figure 10 Effects of compound SJ-6 at different concentrations on RAGE, SMA-α, NF-κB, p38, Akt, PKC, NOX-1 protein expression induced by AGEs(± s,n = 3)

化合物SJ-6 在不影響細胞的正常增殖的情況下呈劑量依賴性地降低血管平滑肌細胞的鈣化程度，包括促進AGEs 的裂解、降低胞內(nèi)的鈣離子濃度、減弱ALP 酶活力、抑制成骨相關轉錄因子以及相關信號蛋白的表達并增強平滑肌動蛋白的表達，同時伴隨著氧化應激以及部分炎癥反應的減弱和抗氧化能力的增強。因此推測化合物SJ-6 對于鈣化的保護作用機制可能與其抗氧化特性以及對AGEs/RAGE通路的抑制有關。

化合物SJ-6 降低了ROS、OX-1、NF-κB、p38、Akt、PKC 蛋白和炎癥因子TNF-α、1L-6、1L-β 的總量，同時增加了細胞內(nèi)SOD 的含量，推測該化合物可抑制氧化應激過程，從而抑制NF-κB和PKC信號通路并減少β細胞的炎癥反應，最終減輕鈣化過程。

AGEs 的刺激增加了RAGE 的表達，并且AGEs/RAGE 途徑與血管鈣化密切相關［24-26］。隨著化合物SJ-6 濃度的增加，AGEs 和RAGE 的表達均受到明顯抑制，推測化合物SJ-6 可能促進AGEs的裂解，進而下調RAGE受體的表達并抑制下游信號通路和多種信號轉導蛋白，包括NF-κB，p38，Akt，PKC，ROS，NOX-1 等，抑制了Runx2 mRNA 的表達并刺激SMA-α的表達，最終減少AGEs誘導的HCASMCs向成骨細胞的分化。

氨基胍同樣能夠緩解鈣化對平滑肌細胞的損害，氨基胍的保護作用與0.012mmol/L 的化合物SJ-6 的保護作用相似，而0.025mmol/L 的化合物SJ-6 的延緩鈣化效果更好?；衔颯J-6 對于更多其他相關的信號通路蛋白表達的影響以及其是否可以有效抑制實驗動物的血管鈣化，有待進一步探索。總之，3-芳基香豆素衍生物SJ-6 的抑制血管鈣化作用使其成為潛在的候選藥物，并有望開發(fā)成為治療血管鈣化的新藥。