羧甲司坦L-精氨酸鹽的合成及其對(duì)支氣管上皮細(xì)胞的保護(hù)作用

賈 健，吳建兵，張奕華，黃張建

（中國(guó)藥科大學(xué)新藥研究中心，南京 210009）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmo?nary diseases，COPD）是一種常見的慢性氣道疾病，具有高發(fā)病率、致殘率和致死率的特點(diǎn)［1-4］。據(jù)報(bào)道我國(guó)20 歲及以上成人COPD 患病率為8.6%，40 歲以上人群患病率高達(dá)13.7%，提示我國(guó)COPD發(fā)病率呈現(xiàn)高態(tài)勢(shì)［5-7］。吸煙是造成COPD 最主要的原因，80% ~ 90%的COPD 患者都與吸煙密切相關(guān)［8-10］。

羧甲司坦（carboxymethylcysteine，CMC）是臨床常用的黏痰溶解藥。臨床研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用CMC可明顯減少COPD 患者病情急性加重并延長(zhǎng)發(fā)作間歇［11-12］。CMC 治療COPD 的療效不僅與其黏液溶解性有關(guān)，更多地與其抗氧化、抗炎作用相關(guān)［13］。CMC 還可通過抑制促炎因子白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6 及腫瘤壞死因子α 等的生成，減少炎性介質(zhì)的釋放，減輕體內(nèi)的炎性反應(yīng)［14-16］。遺憾的是，CMC 化學(xué)結(jié)構(gòu)中的兩個(gè)羧酸基導(dǎo)致該藥物對(duì)消化道有刺激作用，可引起胃部不適、惡心、嘔吐、腸胃道出血等不良反應(yīng)。

L-精氨酸（L-arginine，L-Arg）是一種半必需氨基酸，可被內(nèi)源性NOS 代謝為NO 和瓜氨酸，在維持氣道張力和功能方面起著重要作用。值得一提的是，只有L-精氨酸才能作為NOS 的底物釋放NO，而D-精氨酸不具有產(chǎn)生NO 的能力［17-18］。NO缺乏也被證明是COPD、哮喘和囊性肺纖維化患者肺功能惡化的原因之一［19-21］。在胃腸道系統(tǒng)中，NO 可通過抑制胃酸分泌、促進(jìn)胃黏液分泌、調(diào)節(jié)黏膜血流量等發(fā)揮胃腸道保護(hù)作用［22-27］。傳統(tǒng)非甾體抗炎藥（NSAIDs）具有嚴(yán)重胃腸道不良反應(yīng)，而NO 供體型NSAIDs（NO-NSAIDs）如阿司匹林L-精氨酸鹽、NO-阿司匹林、NO-布洛芬等不僅具有強(qiáng)效的抗炎、鎮(zhèn)痛作用而且具有NO 介導(dǎo)的胃腸道和心血管保護(hù)作用［28-33］。

基于上述背景，本研究設(shè)計(jì)、合成了一種CMC的L-精氨酸鹽化合物（CMCA），并測(cè)試了CMCA 的理化性質(zhì)及其在人支氣管上皮細(xì)胞（16-HBE）中抗氧化、抗凋亡和NO釋放的作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

羧甲司坦（成都西亞化工股份有限公司，Lot：20200710）；L-精氨酸［梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，Lot：22RPO］；商用卷煙（萬寶路紅標(biāo)）；16-HBE 細(xì)胞系、DCFH-DA 活性氧檢測(cè)試劑盒、Annexin V-APC/7-AAD 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、DAF-FM DA 一氧化氮檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；6 孔培養(yǎng)板（美國(guó)Corning Costar 公司）；AV-500 核磁共振儀（德國(guó)Bruker 公司）；MAT95XP 型高分辨質(zhì)譜儀［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司］；X-4 精密顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀（北京福凱儀器有限公司）；pH 計(jì)［梅特勒-托利多（中國(guó)）有限公司］；FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton-Dickinson公司）。

1.2 CMCA的制備與表征

CMCA 的合成途徑如路線1 所示，將L-精氨酸（1.74 g，10 mmol）溶于蒸餾水5 mL 中，逐量加入CMC（1.79 g，10 mmol）始終保持反應(yīng)液為澄清狀，于室溫25 ℃下攪拌2 h，向反應(yīng)液中滴加無水乙醇50 mL，開始時(shí)滴速稍快，至有白色晶體析出時(shí)減慢滴速，滴畢，攪拌0.5 h，抽濾，用少量乙醇洗滌濾餅，40 ℃真空干燥，得白色CMCA結(jié)晶3.20 g，收率約90.7%。mp 203.8 ~ 205.2 ℃；UV（H2O）λmax211.5（lg ε 3.717）nm；IR（KBr，ν）：918.6，1 223.9，1 380.0，1 690.7，3 336.9，3 438.0 cm-1；MS（m/z）：175［M2+H］+，178［M1-H］-；1H NMR（500 MHz，D2O）：δ1.86 ~1.66（2H，m），2.04 ~1.91（2H，m），3.11（1H，dd，J1= 14.6，J2= 8.5 Hz），3.23（1H，d，J=14.8 Hz），3.31（2H，t，J= 6.6 Hz），3.39（2H，s），3.84（1H，t，J=5.7 Hz），3.98（1H，d，J=6.6 Hz）；13C NMR（125 MHz，D2O）：δ175.38，172.13，170.66，52.20，51.61，38.37，34.83，31.33，25.39，21.75。

Scheme 1 Synthetic route of carboxymethylcysteine L-arginate(CMCA)

1.3 香煙煙霧提取物（cigarette smoke extract，CSE）的制備及模型的建立

香煙煙霧溶液的制備方法如文獻(xiàn)所述［34］。在真空燒瓶中每25 mL PBS 使用一支香煙燃燒5 min以生成CSE-PBS 溶液。再使用0.22 μm 孔徑的過濾器過濾CSE 溶液，以去除細(xì)菌和大顆粒。然后將煙霧溶液的pH 調(diào)節(jié)至7.4，其溶液設(shè)為100%CSE，并在每次實(shí)驗(yàn)中稀釋至所需濃度。

本研究采用16-HBE 細(xì)胞系建立CSE 模型，參照文獻(xiàn)方法［35］所述，將受試藥物與16-HBE 細(xì)胞預(yù)孵育1 h 后，加入10%CSE 繼續(xù)孵育18 h。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。

1.4 DCFH-DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧含量

DCFH-DA 是一種被廣泛用于檢測(cè)ROS 的熒光探針。用PBS 洗滌細(xì)胞1 次（離心200 r/min，5 min）收集并調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升1× 106個(gè)細(xì)胞，按照1∶1 000 用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L。細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA 中，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。每3~5 分鐘顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3 次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)（λEx=488 nm；λEm=530 nm）細(xì)胞內(nèi)的活性氧。

1.5 Annexin-V APC/7-AAD雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的16-HBE 細(xì)胞接種到6 孔板中，次日，待細(xì)胞貼壁后，根據(jù)組別設(shè)置相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組。藥物作用18 h后，用0.25%胰酶（不含EDTA）消化收集細(xì)胞，用PBS 洗滌細(xì)胞兩次（離心200 r/min，5 min）調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升5×105個(gè)，加入結(jié)合緩沖液500 μL懸浮細(xì)胞，加入Annexin V-APC 5 μL 混勻后，再加入7-AAD 5 μL 混勻，室溫、避光、反應(yīng)5 ~ 15 min。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6 DAF-FM DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NO含量

DAF-FM DA 是一種可用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)低濃度NO 的熒光探針。將細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)、配制成濃度為每毫升5 × 104個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種到六孔板中，次日，待細(xì)胞貼壁后，根據(jù)組別設(shè)置加入相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組。加藥18 h 后，用0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，用PBS 洗滌細(xì)胞1 次（離心200 r/min ，5 min）收集并調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升1 × 106個(gè)。按照1∶1 000 用無血清培養(yǎng)液稀釋DAF-FM DA，使終濃度為5 μmol/L，細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DAF-FM DA 中，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，每3 ~ 5 分鐘顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3 次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DAF-FM DA；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)（λEx= 495 nm；λEm=515 nm）細(xì)胞內(nèi)NO 的情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05 認(rèn)為有顯著性差異。兩組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異采用Tukey's 檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)使用單因素方差分析（One-Way ANOVA）分析檢驗(yàn)。所有分析和繪圖均使用統(tǒng)計(jì)軟件GraphPad Prism 8。

2 結(jié) 果

2.1 CMCA改善CMC的理化性質(zhì)

將CMC 與CMCA 配制成為1 mg/mL 的水溶液，使用pH 計(jì)測(cè)試二者pH，結(jié)果如表1 所示，CMCA 改善了CMC 自身的強(qiáng)酸性。以脂水分配系數(shù)lgP作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用分配系數(shù)（正辛醇-水）搖瓶法試驗(yàn)，結(jié)果如表1 所示，CMCA 的親水性較CMC好。

Table 1 pH and lg P of CMC and CMCA(± s,n = 3)

Table 1 pH and lg P of CMC and CMCA(± s,n = 3)

CMC:Carboxymethylcysteine;CMCA:Carboxymethylcysteine L-arginate

Compd.CMC CMCA pH 2.18±0.67 4.22±0.25 RSD 30.47 5.92 lg P-1.47±0.09-2.03±0.31 RSD-6.05-15.05

2.2 CMCA 抑制CSE 引起的16-HBE 細(xì)胞內(nèi)的ROS積聚

首先，本研究測(cè)試了CMCA 清除CSE 誘導(dǎo)16-HBE 細(xì)胞內(nèi)ROS 的能力，以證明其抗氧化作用。如圖1 所示，10%CSE 刺激18 h 后，16-HBE 細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量ROS（P＜0.001）。通過給予1×10-4mol/L CMC 或L-精氨酸治療后，與模型組相比ROS 的生成明顯減少。采用不同濃度的CMCA 治療后ROS的生成也顯著降低，并呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系，其中1×10-4mol/L 的CMCA 組ROS 蓄積程度最低，且低于等摩爾濃度的CMC 組（P＜0.001），與1 × 10-4mol/L L-精氨酸組相比無顯著性差異。

Figure 1 Effect of CMCA on cigarette smoke extract（CSE）-induced reactive oxygen species(ROS)generation in 16-HBE cells(± s,n = 3)

2.3 CMCA抑制CSE引起的16-HBE細(xì)胞凋亡

CMCA 抑制CSE 引起的16-HBE 細(xì)胞凋亡情況見圖2，10%CSE 刺激18 h 后，導(dǎo)致16-HBE 細(xì)胞大量凋亡（P＜0.001）。通過給予1 × 10-4mol/L CMC或1×10-4mol/L L-精氨酸治療后，與模型組相比細(xì)胞凋亡情況明顯好轉(zhuǎn)。采用不同濃度的CMCA 治療后能劑量依賴性的抑制細(xì)胞凋亡，其中1 × 10-4mol/L CMCA 治療效果最佳，優(yōu)于1 × 10-4mol/L CMC 組（P＜0.001）和1 × 10-4mol/L L-精氨酸組（P＜0.001）。

2.4 CMCA促進(jìn)16-HBE細(xì)胞內(nèi)NO的生成

為了驗(yàn)證NO 在16-HBE 細(xì)胞中發(fā)揮的作用，進(jìn)一步研究了16-HBE 細(xì)胞內(nèi)NO 的含量情況（圖3），10% CSE 刺激后，16-HBE 細(xì)胞內(nèi)NO 含量明顯降低（P＜0.001）。通過給予1×10-4mol/L CMC 治療后，細(xì)胞內(nèi)NO 含量顯著性增加（P＜0.001）。給予1 × 10-4mol/L CMCA 治療后，細(xì)胞內(nèi)NO 含量增加，顯著多于模型組和1 × 10-4mol/L CMC 組（P＜0.001）。

3 結(jié)果與討論

香煙煙霧中含有醛類、尼古丁類、氰化物、氧自由基、焦油等大量有害成分，可直接對(duì)氣道和肺組織造成損傷，產(chǎn)生并釋放TNF-α、IL-8 及IL-6 等炎癥介質(zhì)，促進(jìn)氣道炎癥，是導(dǎo)致COPD 最主要的原因。CSE 從香煙煙霧中提取并溶于細(xì)胞培養(yǎng)基中，被廣泛用于體外研究中［36-38］。支氣管上皮細(xì)胞在協(xié)調(diào)COPD 病理進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用，刺激物首先與之接觸引起氣道和肺部的炎癥反應(yīng)，釋放各種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，進(jìn)而導(dǎo)致疾病加重和各種相關(guān)癥狀的產(chǎn)生［39］。本研究采用10%CSE 誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞系16-HBE 病變，以模擬體外COPD 損傷。結(jié)果表明，模型組ROS 大量積聚，細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡，提示造模成功。

Figure 2 Effect of CMCA on CSE-induced 16-HBE cells apoptosis(± s,n = 3)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CMCA 顯著改善了CMC 本身的強(qiáng)酸性，從而可能減輕對(duì)消化道的刺激作用。此外，在等物質(zhì)的量濃度下CMCA 較CMC 或L-精氨酸有著更好的清除ROS 和抗細(xì)胞凋亡的能力，并且呈現(xiàn)濃度依賴性關(guān)系，提示在體外CSE 誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型中CMCA 較CMC 有著更好的治療效果。

隨后使用DAF-FM DA 熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NO 的含量，考察CMCA 細(xì)胞保護(hù)作用是否依賴于NO。研究發(fā)現(xiàn)，模型組較對(duì)照組NO 含量顯著下降，可能是由于10%CSE 的加入，使細(xì)胞內(nèi)自身的NO 與CSE 刺激產(chǎn)生的ROS 進(jìn)一步反應(yīng)生成NO2、N2O3和ONOO-等其他活性氮形式，無法被熒光探針?biāo)鶛z測(cè)。CMC 的加入，減輕細(xì)胞內(nèi)炎癥和抗氧化應(yīng)激損傷，恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)部分NO 含量（P＜0.001vs模型組），而CMCA給藥后細(xì)胞內(nèi)NO含量進(jìn)一步增加（P＜0.001vsCMC 組）。以上提示NO 對(duì)CSE誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷可能具有保護(hù)作用。

總之，本研究合成的CMCA 較CMC 具有更優(yōu)的理化性質(zhì)，在體外CSE 誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型中較CMC 有著更好的清除ROS 和抗細(xì)胞凋亡的作用。此外，CMCA 還可能降低應(yīng)用CMC 帶來的胃腸道不良反應(yīng)，改善患者的依從性，較CMC具有更廣泛的應(yīng)用前景，值得深入研究。

Figure 3 Effect of CMCA on CSE-induced NO concentration in 16-HBE cells(± s,n = 3)